Name: Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Aprenda a quantificar a reposição de pools de vesículas sinápticas em terminais nervosos centrais usando imagens de fluorescência ao vivo com corantes FM em neurônios granulares do cerebelo.

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Este trabalho foi financiado por uma concessão do Wellcome Trust (Ref: 084277).

1. Preparação Neuron cerebelar Granule <ol><li> Autoclave aproximadamente 100 mm de diâmetro 25 lamínulas (Tabela 1). </li><li> Lamínulas lugar em um tubo de 50 ml estéril, contendo solução de poli-D-lisina estéril (Tabela 2). Coloque em uma plataforma giratória para 2 h para revestir as lamelas. </li><li> Lamínulas seca revestida com papel de filtro estéril em uma capela de fluxo laminar (Tabela 1). </li><li> Lamínulas estéreis lugar em 6 pratos e Lamelas bem quente em uma incubadora de CO 2 (Tabela 1). Pode ser armazenado por 1 mês a 4 ° C para antes do uso. </li><li> Euthanize a 7 dias de idade Sprague Dawley rat filhote de cachorro de acordo com as orientações locais de comitê de ética. Nós sacrificados filhotes usando deslocamento cervical. </li><li> Dissecar o cerebelo e colocá-lo numa placa de Petri estéreis, contendo uma solução de sais de fosfato tamponada (solução B, Tabela 3). </li><li> Repita os passos 1.5 e 1.6 para 4-6 filhotes de ratos. </li><li> Cerebelos são então colocados no palco estéril de um tecido McIlwain Chopper (Tabela 1). Tecido é cortado em 375 intervalos mM antes de girar o estágio de 90 ° e repetindo o processo. </li><li> O cerebelo picada são transferidos para uma solução de tripsina (solução de T, a Tabela 4), que tinha sido previamente aquecido a 37 ° C. </li><li> Incubar cerebelos a 37 ° C por 20 min com agitação suave a cada 5 min, aproximadamente. </li><li> Durante a digestão tríptica, chama polonês três pipetas de vidro estéreis (Tabela 1) utilizando uma chama de Bunsen. Use a chama para criar um furo fino, um furo médio e um furo de largura na boca respectivos das pipetas. </li><li> Após 20 min de incubação em solução T, adicione 20 ml de uma solução de inibidor de tripsina / DNase (solução W, Tabela 5) para a suspensão do cerebelo e células de pelotas em 1000 g por 1 min em uma centrífuga de bancada (Tabela 1). </li><li> Decantar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1,5 ml de um concentrado de tripsina / DNase inibidor (solução C, Tabela 6), utilizando a mais ampla pipeta furo. </li><li triturar as c usando a pipeta primeiro furo de largura ent o meio di e finalmente estreito at suspens homog>Este é um passo fundamental, a suspensão deve ser homogênea nesta fase. </li><li> Suspensão a camada de células na parte superior de 10 ml de uma pré-aquecido (37 ° C) albumina sérica bovina complementada Earles solução de sais Balanceada (Tabela 7) em um tubo estéril ml 15. </li><li> Centrifugar a suspensão por 5 min a 1.500 g e ressuspender o pellet celular em 2 mls de pré-aquecida (37 ° C) meio de cultura (Tabela 8). </li><li> Estimar o número de células usando uma hemocitómetro (Tabela 1) e diluir a suspensão de célula para uma densidade final de 3,3 x 10 6 células por ml. </li><li> Células são banhados pela adição de 75 mL da suspensão de células para o centro de poli-D-lisina revestido lamínulas (densidade final 2,5 x 10 5). </li><li> As placas de cultura contendo as lamelas são colocados na incubadora de CO 2 por 60 minutos para permitir que as células a umadhere. </li><li> Adicionar 1,5 ml de meio de cultura em cada poço tomando cuidado para não perturbar as células banhado e retornar a placas de cultura para o CO 2 incubadora. </li><li> No dia seguinte, substituir o meio de cultura com meio de cultura fresco suplementado com o inibidor mitótico arabinoside citosina (Tabela 8). Prisões Esta proliferação de células gliais em cultura. </li></ol> 2. Instalação Experimental <ol><li> Configuração experimental básica deve consistir no seguinte (ver tabelas 1 e 9 de equipamentos e software específicos utilizados): <ul><li> Microscópio invertido epi-fluorescência </li><li> Câmera CCD refrigerado </li><li> Fonte de luz fluorescente (monocromador ou roda de filtros) </li><li> Aparelho de perfusão gravidade </li><li> Imagem de câmara com eletrodos de platina paralelo </li><li> Estimulador elétrico </li><li> Computador </li><li> Software de aquisição de imagem </li></ul></li><li> Experimentos devem ser realizados no escuro ou sob luz vermelha conditions com iluminação fluorescente mínimo da amostra para evitar a tintura FM branqueamento. </li><li> Experimentos são realizados à temperatura ambiente. Se a temperatura fisiológica é necessário, um sistema de perfusão com temperatura controlada pode ser usado. </li></ol> 3. Preparação da Amostra <ol><li> Culturas deve ser utilizado após 8-12 dias in vitro. </li><li> Transferência de uma lamínula única solução salina (Tabela 10) por 10 min em temperatura ambiente para permitir a estabilização no novo meio. </li><li> Retirar as lamelas, seque sua parte inferior ea área circundante as células associadas com um pequeno pedaço de papel toalha ou papel absorvente. </li><li> Utilizando graxa de silicone (Tabela 2), cola a lamela na parte inferior da câmara de imagem. As células devem ser entre os dois fios paralelos. Graxa de silicone suficiente deve ser usado para fechar completamente a câmara, mas sem qualquer graxa entrar no centro da câmara de banho. </li><li> Suavemente preencher a câmara de banho com ~ 260 mL sasolução de linha e preencha o tubo de entrada com a mesma solução. </li><li> Cola uma lamela limpo com graxa de silicone para o topo da câmara para selá-lo. A tubulação de entrada e saída pode ser usado para remover as bolhas de ar aprisionado na câmara. É importante que o circuito elétrico não é interrompido por bolhas de ar. </li><li> Imobilizar a câmara de imagem em uma plataforma de aço inoxidável e verificar se há vazamentos suavemente perfusão de solução salina através do tubo de entrada. </li><li> Montar a câmara montada no palco de um microscópio invertido, e conectar a câmara a um sistema de perfusão gravidade, após ter preparado a entrada com solução salina. </li><li> Anexar fios de ligação da câmara ao estimulador elétrico. </li><li> Adicionar uma gota de óleo de imersão para o objectivo, se uma lente de óleo é usado. Foco sobre as células no meio da câmara com uma iluminação de campo claro. </li></ol> 4. Fase S1 <ol><li> Neurônios perfundir com 1,5 mlFM de corante (Tabela 2) diluída em solução salina. </li><li> Estimulam os neurônios para evocar a absorção de corante utilizando o estimulador ligado. </li><li> Após a estimulação, os neurônios perfundir com solução salina fresca por 2 min para lavar o excesso de corante FM (vazão 7 ml / min). Contaminação da glia no sistema de cultura CGN é inferior a 5% 14, portanto, enquadrar este tempo é suficiente para remover a tintura . </li><li> Deixe descansar por neurônios a 8 min. </li><li> Durante este intervalo, localize redes axonal onde individuais FM terminais dye-carregado do nervo são visíveis usando comprimentos de onda de fluoresceína (excitação, 480 nm; emissão,&gt; 550 nm). Evite áreas com aglomerados de células. Mantenha a iluminação a um mínimo nesta etapa, já que a excitação intensa pode resultar em fototoxicidade corante. Sinais evidentes disso são blebbing de axônios e uma falta de corante descarga (devido à fixação de corantes). </li><li> Re foco imagem imediatamente antes da aquisição da imagem desde um ligeiro desvio pode ter ocorrido durante o período de descanso. </li> Comece lapso de tempo de aquisição de imagem, à taxa de 1 quadro a cada 4 s. <li> Depois de adquirir 5-10 imagens de referência, evocar exocitose do PRR, oferecendo um estímulo Hz 30 para 2 s (60 potenciais de ação) 8 Commence estimulação manualmente imediatamente após a captura frame.. </li><li> Depois de adquirir mais 10 imagens, evocam exocitose SV da RP com três estímulos de 40 Hz por 10 s (400 potenciais de ação), a cada 30 s para além 8. </li><li> Adquirir um outro 5-10 imagens e, em seguida, a aquisição de imagens de pausa. </li></ol> 5. Fase de recuperação (ver Figura 2) <ol><li> Permitem que os neurônios para recuperar, pelo menos, 20 min. </li><li> Opcional - Se o efeito de uma droga sobre endocitose deve ser testada, os neurônios perfundir com solução de drogas durante este período (Figura 2b) 3,8. </li></ol> 6. Fase S2 <ol><li> Repita protocolo fase S1 (seção 4) para um experimento de controle usando o mesmo campo de visão comoem S1. </li><li> Opcional - Se o efeito de uma droga sobre endocitose é para ser testado, perfundir neurônios com a solução de drogas suplementado com FM corante (Figura 2b) 3,8. </li><li> Opcional - Alternativamente, se os efeitos da droga sobre exocitose são de interesse, os neurônios perfundir com a solução de drogas antes e durante o RRP e estímulos RP descarga (Figura 2c) 3. </li></ol> 7. Análise de Dados <ol><li> Use ImageJ e Microsoft Excel ou software semelhante para análise de dados. </li><li> Para a análise, uma seqüência de imagens em formato de pilha é necessária. Alguns software de imagem pode exportar seqüências como únicas imagens. Se este for o caso, converter as imagens para uma pilha usando um ImageJ built-in função Imagem&gt; Pilhas&gt; Imagens de pilha. </li><li> Ajustar o brilho eo contraste da pilha para maximizar a gama dinâmica. Image&gt; Adjust&gt; Brightness / Contrast (Figura 3a). </li><li> Se deriva horizontal significativa ocorreu durante tele experimento, executar StackReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</a> ) e TurboReg ( <a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/">http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</a> ) plugins em ImageJ para alinhar pilha de imagens (Figura 3b) . </li><li> Run-Time Series Analyzer plugin ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html</a> ) (Figura 3c). </li><li> Definir regiões de interesse (ROIs) ao longo de pelo menos 90 terminais nervosos. Estes devem ser idênticos (ROIs circular com diâmetro 1,5 mm) É útil para alternar entre as imagens antes e depois da descarga de corante para revelar terminais nervosos ativa (alternativamente um estímulo pré-imagem pode ser subtraído de uma imagem pós-estimulação). Um ideal ROI é um tamanho que é muito maior do que um terminal nervoso típico (Figura 3c). </li><li> Obter a intensidade total / integrada de fluorescência de cada ROI sobre time e exportar para o Microsoft Excel (Figura 3d e 4a). </li><li> Normalize traços ROI para o mesmo valor arbitrário, alinhando traços no plano do eixo Y para o estímulo primeiro desembarque em fases tanto S1 e S2 (Figura 4b-c). Este é o controle para pequenas variações na intensidade da fluorescência de fundo. </li><li> Medir a queda absoluta na fluorescência evocados por cada estímulo descarga em arbitrária unidades de fluorescência para S1 e S2 da seguinte forma (Figura 4d): <ul><li> RRP = Mudança de fluorescência (ΔF) desencadeada por 30 Hz 2 s </li><li> RP = Soma de ΔF desencadeada por 3 x 40 Hz 10 s </li><li> Piscina de reciclagem total = RRP + RP </li></ul></li><li> Para cada parâmetro relevante em 7,9, calcular o valor médio de todos os terminais nervosos de uma experiência única. </li><li> Para a análise estatística, os valores médios obtidos a partir de vários experimentos independentes podem ser calculadas. O número de lamelas em vez de o número de terminais nervosos deve ser usado como o statistical n. </li></ol> 8. Resultados representativos: Um experimento de controle, onde foi submetido a duas rodadas CGNs de passos idêntica carga e descarga é representado na Figura 5. Ao começar uma série de experimentos, é essencial que um experimento de controle como este é realizado a cada dia para confirmar que S1 e S2 são comparáveis ​​antes de variadas condições experimentais durante a S2. Neste exemplo, CGNs foram carregados com 10 mM FM1-43 usando um 80 Hz 10 a estimulação s (Figura 5a). Figura 5b mostra terminais FM1-43-carregados nervo representada por puncta fluorescente. ROIs foram definidos mais de 90 terminais nervosos como mostrado na Figura 5c. O mesmo conjunto de ROIs foi utilizado tanto para S1 e S2. Durante ambas as descarrega, o PRR foi descarregado com um Hz 30 (2 s) estímulo seguido por RP descarga com 3 40Hz seqüencial (10 s) estímulos (Figura 5a). A queda de fluorescência durante cada estímulo podem ser claramente observados e quantificados (Figura 5d-e). Quando examinado, a fluorescência gotas correspondente ao PRR, RP e piscina de reciclagem total foram comparáveis ​​em ambos os S1 e S2. Além disso, 20% dos SVs reciclados residia no RRP enquanto 80% residiam na RP em ambos os S1 e S2. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Diagrama esquemático de um experimento típico FM. A) endocitose SV é acionado na presença de corante FM (representada em verde). O corante é absorvido pela membrana invaginante (SVS única ou a granel endossomos). B) corante não-internalizado na membrana plasmática é lavado por perfusão. C) Após a aplicação de um estímulo descarga, rotulados SVs que se tornaram disponíveis para fusível de liberação com a membrana plasmática, resultando em uma perda de fluorescência. D) A mudança de fluorescência (ΔF), que é proporcional à quantidade de lançado SVs rotulados podem ser quantificados. _upload/3143/3143fig2.jpg "/&gt; Figura 2 Diagramas esquemáticos de possíveis protocolos experimentais. A) Fluxograma de um experimento de controle onde as células sofrem duas rodadas de FM corante carga e descarga (S1 e S2). As células podem ser carregados usando uma variedade de estímulos diferentes. Passos descarga são idênticos em que a RRP é descarregado com 30 Hz por 2 s seguido por RP descarregar usando 3 vezes 40 Hz para 10 s. RRP e estímulos piscina reserva descarga foram separados por 40 segundos, todos os outros estímulos por 30 seg. Células são deixados para se recuperar de 20 min entre S1 e S2. Fluxogramas de possíveis modificações para testar o efeito de uma substância ou B) ou C endocitose exocitose) também são mostrados. Teste de drogas correspondentes podem ser perfundidos na câmara durante períodos indicados. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Figura 3 Imagens de análise de dados em J imagem. Imagens são mostradasUm de brilho) e ajuste de contraste, B) de alinhamento de quadro, C) a seleção ROIs, e D) de intensidade de extração valores usando Image J. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3143/3143fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 4"> Figura 4 Imagens da análise de dados em Microsoft Excel. Imagens são mostradas para A) a importação de dados brutos de imagem J (1 coluna st = número de quadro, colunas restantes = dados de terminais nervosos individual) B) de ajuste de valores de referência S1 (quadro 10) para um valor arbitrário (200) no início do primeiro estímulo, C ajuste) dos valores basais S2 no quadro 55, usando um protocolo idêntico ao S1, e D de medição) de gotas de fluorescência usando Microsoft Excel. Note-se que o traço mostrado na média D é usado para definir os pontos de tempo antes e depois de cada queda. O tamanho das gotas de fluorescência para cada ROI deve ser determinada a partir de valores na planilha mostrada na C. <img alt="Figura 5" src='"files/ftp_upload/3143/3143fig5.jpg'> Figura 5. Representante experimento de controle. A) Fluxograma de um experimento de controle, onde CGNs foram carregados com 10μM FM1-43 usando 80 Hz (10 s) estimulação. As fases de S1 e S2 são idênticos. RRP e estímulos piscina reserva descarga foram separados por 40 segundos, todos os outros estímulos por 30 seg. B) Uma imagem que mostra terminais nervosos carregados com FM1-43. C) A mesma imagem B mostra 90 ROIs numeradas selecionadas para análise. D) Imagens de uma área representada por uma caixa vermelha no B em pontos de tempo selecionado. = Basal antes da estimulação; 30 Hz = depois de 30 Hz 2 s estimulação; 40 Hz 1,2,3 = após cada estímulo 40 Hz 10 s. Estas imagens são apresentadas em pseudo para ilustrar mudanças na fluorescência (bar espectro exibido à direita). E) Média ± SEM traço obtido a partir de 90 terminais nervosos retratado em C. estímulos individuais são representados por barras horizontais. Barra de escala = 10 mM.

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Não temos nada a revelar.

FM corantes são usados ​​extensivamente para investigar a função do nervo terminal em muitas preparações neuronal. Eles têm sido utilizados principalmente para acompanhar o grau de qualquer endocitose SV, SV volume de negócios ou a cinética da exocitose 6. O protocolo descrito estende esses estudos para examinar o diferencial de descarga de piscinas específicas SV. Esta fornece informações adicionais sobre a reposição de piscinas SV e também a sua extensão de mobilização. Corantes FM pode ser usado para rotular várias rodadas de reciclagem de SV dentro dos terminais nervosos mesmo. Temos explorado esta propriedade e projetado protocolos em que SV volume de negócios em cada terminal pode ser monitorado duas vezes na mesma terminais nervosos. Isso proporciona um controle preciso interna, que é essencial devido à natureza heterogénea de reciclagem SV em terminais nervosos paralelo 11. Através do uso da fase de S1 como um controle interno, a recarga do PRR, RP eo totalSV piscina na presença de drogas pode ser confiável e directamente comparados. Além de fornecer informações do tamanho absoluto da reciclagem, piscinas RRP e RP em condições de estimulação diferente, este protocolo também pode fornecer dados para o seguinte - 1) O particionamento de SVs entre o PRR e RP em função da piscina de reciclagem para S1 e S2, 2) o tamanho relativo das piscinas S2 (RRP e RP) em função da piscina reciclagem total S1 e 3) o tamanho relativo de qualquer piscina SV definido no S2 em função da mesma piscina em S1. Este protocolo particular, não fornecerá informações sobre cinética de descarga no entanto, desde o tempo de aquisição é muito lento (para medições cinética tempos de aquisição deve ser o mais rápido possível e descarga automaticamente sincronizados para capturar imagem). Os nossos 30 Hz estímulos 2 s evoca uma extensão idêntica de RRP descarga à sacarose hipertônica 8. Como o tamanho do PRRé definida por sacarose hipertônica descarga 15, podemos afirmar que este protocolo descarrega todos os SVs RRP, de acordo com estudos em neurônios do hipocampo 16. O pool de reserva é quase completamente esgotada por três trens de 400 estímulos (40 Hz 10 s cada) já que este estímulo descarrega uma quantidade idêntica de tintura para um paradigma (2 estímulos com 50 mM KCl), que esgota os 95% de todos os SVs dye-rotulados 8,17. Quantificação exata do tamanho de ambos os RRP e piscina reserva é também dependente de aquisição de informação dentro da faixa linear dinâmica da câmera CCD. Este protocolo simples também pode ser modificado ainda. A força de estímulos de carga também pode ser variado para determinar como a atividade neuronal e modos diferentes afetam endocitose SV reabastecimento da piscina. Além disso, maior do que dois ciclos de carga e descarga também pode ser realizada, se necessário. Este protocolo também pode ser usado em células transfectadas tanto com superexpressão ouvetores shRNA. Devido à eficiência de transfecção baixos de culturas primárias de neurônios, proteínas expressas devem ser marcadas com proteínas fluorescentes. É essencial que essas marcas fluorescentes não interferir com o sinal FM corante (use ciano ou proteínas vermelho, por exemplo). Neste exemplo, terminais nervosos das células transfectadas e não transfectadas no mesmo campo de visão também pode ser comparada como um controle adicional de 8. Em tais experimentos uma comparação da extensão de carga, entre cargas de S1 e S2 é de pouco valor, uma vez que a perturbação está presente durante as duas cargas. Particionamento de corante entre piscinas SV ainda pode ser visualizado no entanto 8. Repórteres genética chamada pHluorins também pode ser empregado para monitorar SV exocitose e endocitose na cultura neuronal primária. Estas sondas usar um pH-sensível proteína verde fluorescente ao ambiente pH de domínios luminal de proteínas tag SV, como VAMP, sinaptofisina e VGLUT1 18 </sup&gt;. Quando usado em conjunto com inibidores da ATPase vesicular, pHluorins pode relatar tanto a cinética ea extensão da SV mobilização piscina 19. A abordagem FM-dye com base descrita aqui tem algumas vantagens sobre a técnica pHluorin, Em primeiro lugar, corantes FM fornecer informações sobre quais SV modo endocitose reabastece o RRP e piscinas reserva 8. Em segundo lugar piscinas específicas SV pode ser rotulado com corantes FM que possuem diferentes propriedades espectrais 20 e, finalmente, não há nenhuma exigência para a transfecção. Corantes FM não pode fornecer informações sobre o tráfego entre o SV de descanso e reciclagem piscinas SV porém (em contraste com pHluorins 19), uma vez que, por definição, SVs têm de ser carregados com tinta durante a endocitose a ser visível. Assim, tanto corantes FM e pHluorins têm pontos fortes e fracos e são mais poderosos quando utilizados em experimentos independentes para lidar com a mesma pergunta. Imagens de alta qualidade são essenciais para a análise válida e reproducible resultados. Enquanto o deslizamento horizontal pode ser facilmente corrigido, experimentos onde há um desvio no eixo Z não podem ser recuperados. Por esta razão, é importante re-focar imagens antes de iniciar a descarrega S1 e S2. Nos casos em que uma deterioração significativa fluorescentes ocorreu, correções decadência pode ser aplicado (geralmente subtraindo um traço previamente gravados a partir de células FM-carregados na ausência de estimulação). No entanto, sugere-se que a correção de atenuação é realizada somente para a representação gráfica e não deve ser usado para qualquer análise quantitativa.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th></tr><tr><td> AxioCam MRM Rev. 3 Câmera Digital </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4265099901000 </td></tr><tr><td> Axio Microscópio Observer.A1 </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4310040000000 </td></tr><tr><td> Placas de cultura de células (6 poços) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 657160 </td></tr><tr><td> Centrifugação (Universal 32R) </td><td> Hettich Zentrifugen </td><td> 1610 </td></tr><tr><td> Incubadora de CO 2 </td><td> Heraeus Instruments </td><td> 51014042 </td></tr><tr><td> Falcon tubos (15/50 ml) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 188271/210261 </td></tr><tr><td> Fluar 20X / 0,75 ∞ / 0,17 Objetivo </td><td> Carl Zeiss </td><td> 4401459901000 </td></tr><tr><td> Lamínulas de vidro (Ø25mm) </td><td> A VWR International </td><td> 631-1584 </td></tr><tr><td> Pasteur de vidro pipetas (230 nm) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 612-1799 </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td><td> VWR </td><td> 15170-170 </td></tr><tr><td> Imagens da câmara </td><td> Warner </td><td> RC-21 BRFS </td></tr><tr><td> Capela de fluxo laminar </td><td> Biohit </td><td> VLF BHS 1200 </td></tr><tr><td> McIlwain Tissue Chopper </td><td> Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. </td><td> MTC / 2 </td></tr><tr><td> Lâmpada de mercúrio </td><td> Carl Zeiss </td><td> HBO 103 </td></tr><tr><td> MultiStim Sistema Elétrico Estimulador (100mV, largura pluse 1ms) </td><td> Digitimer Ltd. </td><td> D330 </td></tr><tr><td> Bomba de perfusão </td><td> Watson-Marlow </td><td> 313S </td></tr><tr><td> Pipetas sorológicas (5/10/25 ml) </td><td> Greiner bio-one </td><td> 606180/607180/760180 </td></tr><tr><td> Obturador controlador </td><td> Carl Zeiss </td><td> MAC5000 </td></tr><tr><td> Seringa (20 ml) </td><td> BD Plastipak </td><td> ST01-B002 </td></tr><tr><td> Filtros de seringa (Minisart - 0,20 mm) </td><td> Sartorius Stedim </td><td> 16532 </td></tr><tr><td> VC-6 Six controlador de válvula Canal </td><td> Warner </td><td> 64-0135 </td></tr><tr><td> YFP filter set (Set 46) </td><td> Carl Zeiss </td><td> 1196-681 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Equipamentos específicos e aparelhos utilizados <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> FM1-43 </td><td> Cambridge BioScience </td><td> BT70021 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> FM2-10 </td><td> Cambridge BioScience </td><td> BT70044 </td><td> 100 mM </td></tr><tr><td> Poli-D-lisina </td><td> Sigma </td><td> P7886 </td><td> 15 mcg / ml </td></tr><tr><td> Graxa de silicone </td><td> Sigma </td><td> 85403 </td><td align="center"> - </td></tr></tbody></table> Tabela 2. Reagentes específicos utilizados <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 0,3% </td></tr><tr><td> D-Glicose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 0,25% </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> D-PBS </td><td> Gibco </td><td> 21300 </td><td> 960 mg/100 ml </td></tr></tbody></table> -Make 100ml frescas para cada preparação Estéril antes do uso do filtro Tabela 3. Solução B para a preparação CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> Solução B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 19 ml </td></tr><tr><td> Tripsina (5 estoque mg / ml, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9201 </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 4. T solução para a preparação CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> Solução C </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 3,2 ml </td></tr><tr><td> Solução B </td><td align= &quot;Center&quot;&gt; - </td><td align="center"> - </td><td> 16,8 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 5. Solução W para CGN preparação <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> Desoxirribonuclease (DNase, 500 U por 0,5 ml de ações, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> D5025 </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 1,5 mM </td></tr><tr><td> Solução B </td><td align="center"> - </td><td align="center"> - </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Inibidor de tripsina de soja (SBTI, 0,5 mg por 0,5 ml de ações, -20 ° C) </td><td> Sigma </td><td> T9003 </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Tabela 6. Solução C para CGN preparação <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) </td><td> Sigma </td><td> A4503 </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Solução salina balanceada de Earle (EBSS) </td><td> Gibco </td><td> 24010 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> MgSO 4 · 7H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M2773 </td><td> 3 mM </td></tr></tbody></table> Tabela 7. EBSS solução para a preparação CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> Citosina β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * </td><td> Sigma </td><td> C1768 </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Fetal bovino Serum </td><td> Gibco </td><td> 10106 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> D-Glicose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 30 mM </td></tr><tr><td> L-Glutamina </td><td> Sigma </td><td> G3126 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 25 mM </td></tr><tr><td> Meio essencial mínimo (MEM) </td><td> Gibco </td><td> 21090 </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> Penicilina (P) / estreptomicina (S) </td&gt; <td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> 100 U / ml (P), 100 mg / ml (S) </td></tr></tbody></table> * Ara-C deve ser adicionado ao meio a partir de 1 DIV Tabela 8. Meios de Cultura para a preparação CGN <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Versão </th><th> Companhia </th></tr><tr><td> AxioVision Rel. </td><td> 4,8 </td><td> Carl Zeiss </td></tr><tr><td> ImageJ </td><td> 1.42q </td><td> National Institutes of Health </td></tr><tr><td> Microsoft Excel </td><td> 2003 </td><td> Microsoft </td></tr></tbody></table> Tabela 9. Software de computador específicos utilizados <table border="1"><tbody><tr><th> Nome </th><th> Companhia </th><th> Catálogo não. </th><th> Concentração </th></tr><tr><td> CaCl 2 · 2H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,3 mM </td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Sigma </td><td> G5767 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma </td><td> P9791 </td><td> 0,4 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 · 6H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M0250 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fluka </td><td> 71378 </td><td> 170 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71627 </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> Na 2 SO 4 </td><td> Suprimentos BDH Laboratory </td><td> 10264 </td><td> 1,2 mM </td></tr><tr><td> TES </td><td> Sigma </td><td> T1375 </td><td> 20 mM </td></tr></tbody></table> Tabela 10. Solução salina (pH 7,4)

análise quantitativa de reposição da vesícula sináptica piscina em cultured neurônios granulares do cerebelo usando dyes fm

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

Após a liberação do neurotransmissor nos terminais nervosos central, são rapidamente recuperados SVs por endocitose. SVs recuperados são então recarregados com neurotransmissor e voltar a piscina de reciclagem, definido como SVs que estão disponíveis para 1,2 exocitose. A piscina de reciclagem geralmente podem ser subdivididos em dois grupos distintos - a piscina prontamente liberável (RRP) e da piscina de reserva (RP). Como seus nomes sugerem, o RRP consiste em SVs que estão imediatamente disponíveis para a fusão, enquanto RP SVs são liberados apenas durante 1,2 estimulação intensa. É importante ter um teste confiável que relata a reposição diferencial dessas piscinas SV, a fim de compreender 1) como SVs tráfego após diferentes modos de endocitose (como clatrina-dependente e endocitose dependente de atividade endocitose granel) e 2) os mecanismos de controlar a mobilização de ambos os RRP e RP em resposta a estímulos diferentes. Corantes FM são rotineiramente empregamed quantitativamente relatório volume de negócios SV em terminais de nervo central 3-8. Eles têm uma cauda de hidrocarbonetos hidrofóbicas que permite particionamento reversível na bicamada lipídica, e um grupo cabeça hidrofílico que bloqueia a passagem através das membranas. Os corantes têm pouco de fluorescência em solução aquosa, mas o seu rendimento quântico aumenta dramaticamente quando particionado na membrana 9. Assim corantes FM são ideais sondas fluorescentes para acompanhar ativamente a reciclagem SVs. O protocolo padrão para uso de corante FM é a seguinte. Primeiro, eles são aplicados aos neurônios e são captados durante a endocitose (Figura 1). Depois de não-internalizado corante é lavado da membrana plasmática, redistribuir SVs reciclados dentro do pool de reciclagem. Estes são, então, esgotadas SVs usando estímulos descarga (Figura 1). Desde FM rotulagem tintura de SVs é quantal 10, a queda de fluorescência resultante é proporcional à quantidade de vesículas libertadas. Assim, a reciclagem e fusão de SVs gerada a partir da previous rodada de endocitose podem ser confiavelmente quantificados. Aqui, apresentamos um protocolo que foi modificado para obter dois elementos adicionais de informação. Em primeiro lugar, os estímulos seqüenciais são usados ​​para descarga diferencialmente descarregar o RRP eo RP, para permitir a quantificação da reposição de piscinas específicas SV. Em segundo lugar, cada terminal nervoso sofre o protocolo duas vezes. Assim, a resposta do terminal nervoso mesmo em S1 pode ser comparada com a presença de uma substância de ensaio na fase S2 (Figura 2), proporcionando um controle interno. Isso é importante, dado que a extensão de SV reciclagem nos terminais nervosos diferentes é altamente variável 11. Qualquer adepto culturas primárias neuronais podem ser usados ​​para este protocolo, porém a densidade de plaqueamento, soluções e condições de estimulação são otimizados para neurônios granulares do cerebelo (CGNs) 12,13.

A técnica de imagem ao vivo de fluorescência para quantificar o reabastecimento e mobilização de vesículas sinápticas específicas (SV) piscinas de terminais nervosos central é descrito. Duas rodadas de SV reciclagem são monitorados nos terminais nervosos mesmo fornecendo um controle interno.

Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

Após a libertação de neurotransmissores nos terminais nervosos centrais, as vesículas sinápticas (VS) são rapidamente recuperadas por endocitose. As VS recuperadas são então preenchidas novamente com...

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar o recrutamento e a mobilização de pools específicos de vesículas sinápticas em terminais nervosos centrais, utilizando técnicas de imagem de fluorescência em tempo real. Isso é alcançado por meio do monitoramento de duas rodadas de reciclagem de vesículas sinápticas, utilizando corantes FM nos mesmos terminais nervosos para fornecer controles internos válidos. Como segundo passo, o pool prontamente liberável e o pool de reserva são esgotados sequencialmente por meio de protocolos específicos de descarga, os quais permitem a quantificação dos tamanhos relativos dos pools.Em seguida, altere as condições de carregamento ou descarregamento para estudar o efeito da variação escolhida no esgotamento ou mobilização do pool de vesículas sinápticas. Os resultados mostram que o carregamento com FM d de diferentes pools físicos sinápticos é reprodutível com base na quantificação e análise do descarregamento evocado do corante. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a família de repórteres genéticos fluorescentes, é que esta técnica acompanha especificamente o reabastecimento de pools por vesículas sinápticas que sofreram endocitose.Além disso, permite uma quantificação precisa. Como este protocolo é realizado duas vezes nos mesmos terminais nervosos, fornecendo um controle interno. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de sinapse, ELR, endocitose e exocitose, como a forma pela qual a manipulação de modos específicos de endocitose pode afetar o reabastecimento tanto do pool reciclável total quanto dos pools sinápticos de ELR nele contidos, tais como o pool prontamente reutilizável e o pool de reserva.A montagem experimental básica deve consistir em um microscópio invertido com epifluorescência, uma câmera CCD refrigerada, uma fonte de luz fluorescente, um aparato de perfusão por gravidade, uma câmara de imagem com eletrodos de platina paralelos e estimulador elétrico, e um computador. Realize os experimentos no escuro ou sob luz vermelha, com iluminação fluorescente mínima da amostra para evitar o desbotamento do corante FM. Inicie este procedimento utilizando filhotes de rato Spra Dolly com sete dias de idade para preparar culturas primárias de neurônios granulares cerebelares.Após o preparo dos cultivos, plaque os neurônios no centro de um lamínula de 25 milímetros revestido com poli-D-lisina em uma gota, não excedendo sete milímetros de diâmetro. Após uma hora, adicione dois mililitros de meio de cultura aos neurônios após sete dias. Coloque um único lamínula na solução salina à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a estabilização no novo meio. Em seguida, remova o lamínula, seque sua face inferior e a área ao redor das células aderidas com um pequeno pedaço de papel toalha ou papel absorvente.Posteriormente, utilize a graxa de silicone para colar a lamínula à base da câmara de imagem. As células devem estar entre os dois fios paralelos. Use quantidade suficiente de graxa de silicone para selar completamente a câmara sem invadir o centro da câmara de banho.Em seguida, encha cuidadosamente a câmara do banho com cerca de 260 microlitros de solução salina. Depois, encha os tubos de entrada e saída com a mesma solução. Sobre o topo da câmara, fixe uma lamínula limpa com graxa de silicone para selar a câmara.Em seguida, remova todas as bolhas de ar aprisionadas na câmara com os tubos de entrada e saída. Então, imobilize a câmara de imagem em uma plataforma de aço inoxidável. Verifique vazamentos perfundindo suavemente solução salina através do tubo de entrada.O próximo passo é montar a câmara montada na platina de um microscópio invertido. Prime a entrada do sistema de perfusão por gravidade com solução salina e conecte a câmara à entrada. Em seguida, conecte os fios da câmara ao estimulador elétrico.Perfunda os neurônios com 1,5 mililitros de corante FM diluído. Em seguida, estime os neurônios utilizando o estimulador acoplado para induzir a captação do corante. Após a estimulação, perfunda os neurônios com solução salina fresca durante dois minutos para remover o excesso de corante FM. Em seguida, mantenha os neurônios na solução salina por oito minutos.Enquanto isso, localize as redes axonais onde os terminais nervosos individualmente carregados com FM D são visíveis. Utilizando comprimentos de onda de fluoresceína. Evite as áreas com aglomerados de células.Em seguida, refocalize a imagem imediatamente antes da aquisição, já que uma pequena deriva pode ter ocorrido durante o período de repouso. Inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo à taxa de um quadro a cada quatro segundos. Após adquirir cinco a dez imagens de linha de base, induza a exocitose do pool prontamente liberável mediante estimulação de 30 hertz por dois segundos.Após adquirir outras 10 imagens, induza a exocitose das vesículas sinápticas do pool de reserva usando três estímulos de 40 hertz durante 10 segundos com intervalo de 40 segundos entre os estímulos, adquira outras cinco a 10 imagens. Em seguida, pause a aquisição de imagens. Deixe os neurônios se recuperarem por pelo menos 20 minutos e repita novamente este protocolo de fase S1 na fase S2 para o experimento controle.Para a análise dos dados, converta as imagens em uma pilha. Utilizando uma função interna do ImageJ, ajuste o brilho e o contraste da pilha para maximizar a faixa dinâmica, caso tenha ocorrido deriva horizontal significativa. Durante o experimento, execute os plugins StackReg e TurboReg no ImageJ para alinhar a pilha de imagens.Em seguida, o plugin analisador de séries temporais. Depois, defina as regiões de interesse em pelo menos 90 terminações nervosas. É útil alternar entre as imagens antes e depois da descarga do corante para revelar as terminações nervosas ativas.Um tamanho ideal de região de interesse é aquele ligeiramente maior que um terminal nervoso típico. Em seguida, obtenha a intensidade total de fluorescência de cada região de interesse ao longo do tempo. Depois disso, exporte para o Microsoft Excel.É apresentado aqui um diagrama de fluxo de um experimento controle no qual neurônios granulares cerebelares foram carregados com FM 1-43 a 10 micromolar utilizando estimulação de 80 hertz por 10 segundos. Aqui há uma imagem mostrando terminais nervosos carregados com FM 1-43. Esta é a mesma imagem mostrando 90 regiões de interesse numeradas selecionadas para análise após a identificação de terminais nervosos ativos, e estas são as imagens dos terminais nervosos nos pontos de tempo selecionados.Essas imagens são apresentadas em cores falsas para ilustrar as alterações na fluorescência à medida que os diferentes compartimentos de vesículas sinápticas foram esgotados. Por fim, aqui são mostradas as unidades de fluorescência normalizadas desses 90 terminais nervosos. Nas fases S um e S dois, a queda da fluorescência de cada estimulação sequencial pode ser medida e comparada entre as fases S um e S dois.Neste experimento controle, tanto S um quanto S dois resultaram em tamanhos idênticos dos compartimentos prontamente liberáveis e de reserva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar o recrutamento e a mobilização de compartimentos específicos de vesículas sinápticas em terminais nervosos centrais utilizando técnicas de imagem de fluorescência vital. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de confirmar a viabilidade celular e a resposta funcional realizando os experimentos controle S um antes de variar as condições experimentais S dois.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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