Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar a reposição e mobilização dos pools de vesículas sinápticas específicas nos terminais nervosos centrais usando técnicas de imagem de fluorescência ao vivo. Isso é conseguido monitorando duas rodadas de reciclagem de vesículas sinápticas, usando corantes FM nos mesmos terminais nervosos para fornecer controles internos válidos. Como segunda etapa, o pool prontamente liberável e o pool de reserva são esgotados sequencialmente usando protocolos de descarga específicos, que permitem a quantificação dos tamanhos relativos do pool.

Em seguida, altere as condições de carga ou descarga para estudar o efeito da variação escolhida na vesícula sináptica, no reabastecimento da piscina ou na mobilização. Os resultados mostram que a carga de FM d de diferentes pools físicos sinápticos é reprodutível com base na quantificação e análise da descarga de corante evocado. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a família fluente de repórteres genéticos, é que essa técnica rastreia o reabastecimento de pools especificamente por vesículas sinápticas, que sofreram endocitose.

Também permite uma quantificação precisa. Uma vez que este protocolo é realizado duas vezes nos mesmos terminais nervosos, proporcionando um controle interno. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo sináptico, CLE, endocitose e exocitose, como a manipulação em modos específicos de endocitose pode afetar o reabastecimento do pool de reciclagem total e dos pools de CLE sinápticos dentro dele, como o pool prontamente reutilizável e o pool de reserva.

A configuração experimental básica deve consistir em um microscópio de epifluorescência invertido, uma câmera CCD resfriada, uma fonte de luz fluorescente, um aparelho de perfusão por gravidade, uma câmara de imagem com eletrodos de platina paralelos e estimulador elétrico e um computador. Realize os experimentos no escuro ou sob condições de luz vermelha com iluminação fluorescente mínima da amostra para evitar o branqueamento do corante FM. Comece este procedimento usando filhotes de rato spra dolly de sete dias de idade para preparar as culturas primárias de neurônios granulares cerebelares.

Depois que as culturas foram preparadas, coloque os neurônios no centro de uma lamínula de 25 milímetros revestida com poli D lisina em uma gota, não excedendo sete milímetros de diâmetro após uma hora, adicione dois mililitros de meios de cultura aos neurônios após sete dias. Coloque uma única lamínula na solução salina em temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a estabilização no novo meio. Depois disso, remova a lamínula, seque sua parte inferior e a área ao redor das células anexadas com um pequeno pedaço de papel toalha ou papel absorvente.

Em seguida, use a graxa de silicone para colar a lamínula no fundo da câmara de imagem. As células devem estar entre os dois fios paralelos. Use graxa de silicone suficiente para selar completamente a câmara sem invadir o centro da câmara de banho.

Em seguida, encha suavemente a câmara de banho com cerca de 260 microlitros de solução salina. Em seguida, encha a tubulação de entrada e saída com a mesma solução. Sele a câmara colando uma lamínula limpa com graxa de silicone na parte superior.

Depois disso, remova todas as bolhas de ar presas na câmara com a tubulação de entrada e saída. Em seguida, imobilize a câmara de imagem em uma plataforma de aço inoxidável. Verifique se há vazamentos profundindo suavemente solução salina através da tubulação de entrada.

O próximo passo é montar a câmara montada no palco de um microscópio invertido. Prepare a entrada do sistema de perfusão por gravidade com solução salina e conecte a câmara à entrada. Em seguida, conecte os fios de conexão da câmara ao estimulador elétrico.

Perfunda os neurônios com 1,5 mililitros de corante fm diluído. Posteriormente, estimule os neurônios usando o estimulador acoplado para evocar a absorção de corante Após a estimulação, perfunda os neurônios com solução salina fresca por dois minutos para lavar o excesso de corante FM. Em seguida, mantenha os neurônios na solução salina por oito minutos.

Enquanto isso, localize as redes axonais onde os terminais nervosos individuais carregados com FM D são visíveis. Usando comprimentos de onda de fluoresceína. Evite as áreas com aglomerados de células.

Em seguida, refocalize a imagem imediatamente antes da aquisição da imagem, pois pode ter ocorrido um ligeiro desvio durante o período de repouso. Comece a aquisição de imagens com lapso de tempo a uma taxa de um quadro a cada quatro segundos. Depois de adquirir de cinco a 10 imagens de linha de base, evocam a exocitose da piscina prontamente liberável, fornecendo uma estimulação de 30 hertz por dois segundos.

Após adquirir mais 10 imagens, evocar vesícula sináptica, exocitose do pool de reserva utilizando três estímulos de 40 hertz por 10 segundos com intervalo de 40 segundos entre os estímulos, adquirir mais cinco a 10 imagens. Em seguida, pause a aquisição da imagem. Permita que os neurônios se recuperem por pelo menos 20 minutos e repita este protocolo de uma fase S novamente em S de duas fases para o experimento de controle.

Para análise de dados, converta as imagens em uma pilha. Usando uma função integrada de imagem J, ajuste o brilho e o contraste da pilha para maximizar a faixa dinâmica se ocorrer um desvio horizontal significativo. Durante o experimento, execute os plug-ins stack reg e turbo reg na imagem J para alinhar a pilha de imagens.

Em seguida, plug-in do analisador de séries de tempo de execução. Em seguida, defina as regiões de interesse em pelo menos 90 terminais nervosos. É útil alternar entre as imagens antes e depois do descarregamento da matriz para revelar os terminais nervosos ativos.

Uma região ideal de tamanho de interesse é aquela que é ligeiramente maior do que um terminal nervoso típico. Em seguida, obtenha a intensidade total de fluorescência de cada região de interesse ao longo do tempo. Depois disso, exporte para o Microsoft Excel.

Aqui é mostrado um fluxograma de um experimento de controle em que os neurônios do grânulo cerebelar foram carregados com 10 micromolares FM 1 43 usando estimulação de 80 hertz e 10 segundos. Aqui está uma imagem mostrando terminais nervosos carregados com FM 1 43. Aqui está a mesma imagem mostrando 90 regiões numeradas de interesse selecionadas para análise após a identificação de terminais nervosos ativos, e estas são as imagens dos terminais nervosos em pontos de tempo selecionados.

Essas imagens são apresentadas em pseudocores para ilustrar as mudanças na fluorescência à medida que os diferentes pools de vesículas sinápticas foram esgotados. Finalmente, aqui mostradas as unidades fluorescentes normalizadas desses 90 terminais nervosos. Em S um e S duas fases, a queda de fluorescência de cada estimulação sequencial pode ser medida e comparada entre S um e S duas fases.

Neste experimento de controle, tanto o S um quanto o S dois resultaram nos mesmos tamanhos dos pools prontamente liberáveis e de reserva. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como quantificar a reposição e mobilização de pools de vesículas sinápticas específicas nos terminais nervosos centrais usando técnicas de imagem de fluorescência de vida. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de confirmar a viabilidade e a capacidade de resposta celular realizando os experimentos de controle S um antes de variar as duas condições experimentais S.