Análise quantitativa de Reposição da vesícula sináptica Piscina em Cultured neurônios granulares do cerebelo usando Dyes FM

O objetivo geral do experimento a seguir é quantificar o recrutamento e a mobilização de pools específicos de vesículas sinápticas em terminais nervosos centrais, utilizando técnicas de imagem de fluorescência em tempo real. Isso é alcançado por meio do monitoramento de duas rodadas de reciclagem de vesículas sinápticas, utilizando corantes FM nos mesmos terminais nervosos para fornecer controles internos válidos. Como segundo passo, o pool prontamente liberável e o pool de reserva são esgotados sequencialmente por meio de protocolos específicos de descarga, os quais permitem a quantificação dos tamanhos relativos dos pools.

Em seguida, altere as condições de carregamento ou descarregamento para estudar o efeito da variação escolhida no esgotamento ou mobilização do pool de vesículas sinápticas. Os resultados mostram que o carregamento com FM d de diferentes pools físicos sinápticos é reprodutível com base na quantificação e análise do descarregamento evocado do corante. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como a família de repórteres genéticos fluorescentes, é que esta técnica acompanha especificamente o reabastecimento de pools por vesículas sinápticas que sofreram endocitose.

Além disso, permite uma quantificação precisa. Como este protocolo é realizado duas vezes nos mesmos terminais nervosos, fornecendo um controle interno. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais nas áreas de sinapse, ELR, endocitose e exocitose, como a forma pela qual a manipulação de modos específicos de endocitose pode afetar o reabastecimento tanto do pool reciclável total quanto dos pools sinápticos de ELR nele contidos, tais como o pool prontamente reutilizável e o pool de reserva.

A montagem experimental básica deve consistir em um microscópio invertido com epifluorescência, uma câmera CCD refrigerada, uma fonte de luz fluorescente, um aparato de perfusão por gravidade, uma câmara de imagem com eletrodos de platina paralelos e estimulador elétrico, e um computador. Realize os experimentos no escuro ou sob luz vermelha, com iluminação fluorescente mínima da amostra para evitar o desbotamento do corante FM. Inicie este procedimento utilizando filhotes de rato Spra Dolly com sete dias de idade para preparar culturas primárias de neurônios granulares cerebelares.

Após o preparo dos cultivos, plaque os neurônios no centro de um lamínula de 25 milímetros revestido com poli-D-lisina em uma gota, não excedendo sete milímetros de diâmetro. Após uma hora, adicione dois mililitros de meio de cultura aos neurônios após sete dias. Coloque um único lamínula na solução salina à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir a estabilização no novo meio. Em seguida, remova o lamínula, seque sua face inferior e a área ao redor das células aderidas com um pequeno pedaço de papel toalha ou papel absorvente.

Posteriormente, utilize a graxa de silicone para colar a lamínula à base da câmara de imagem. As células devem estar entre os dois fios paralelos. Use quantidade suficiente de graxa de silicone para selar completamente a câmara sem invadir o centro da câmara de banho.

Em seguida, encha cuidadosamente a câmara do banho com cerca de 260 microlitros de solução salina. Depois, encha os tubos de entrada e saída com a mesma solução. Sobre o topo da câmara, fixe uma lamínula limpa com graxa de silicone para selar a câmara.

Em seguida, remova todas as bolhas de ar aprisionadas na câmara com os tubos de entrada e saída. Então, imobilize a câmara de imagem em uma plataforma de aço inoxidável. Verifique vazamentos perfundindo suavemente solução salina através do tubo de entrada.

O próximo passo é montar a câmara montada na platina de um microscópio invertido. Prime a entrada do sistema de perfusão por gravidade com solução salina e conecte a câmara à entrada. Em seguida, conecte os fios da câmara ao estimulador elétrico.

Perfunda os neurônios com 1,5 mililitros de corante FM diluído. Em seguida, estime os neurônios utilizando o estimulador acoplado para induzir a captação do corante. Após a estimulação, perfunda os neurônios com solução salina fresca durante dois minutos para remover o excesso de corante FM. Em seguida, mantenha os neurônios na solução salina por oito minutos.

Enquanto isso, localize as redes axonais onde os terminais nervosos individualmente carregados com FM D são visíveis. Utilizando comprimentos de onda de fluoresceína. Evite as áreas com aglomerados de células.

Em seguida, refocalize a imagem imediatamente antes da aquisição, já que uma pequena deriva pode ter ocorrido durante o período de repouso. Inicie a aquisição de imagens em lapso de tempo à taxa de um quadro a cada quatro segundos. Após adquirir cinco a dez imagens de linha de base, induza a exocitose do pool prontamente liberável mediante estimulação de 30 hertz por dois segundos.

Após adquirir outras 10 imagens, induza a exocitose das vesículas sinápticas do pool de reserva usando três estímulos de 40 hertz durante 10 segundos com intervalo de 40 segundos entre os estímulos, adquira outras cinco a 10 imagens. Em seguida, pause a aquisição de imagens. Deixe os neurônios se recuperarem por pelo menos 20 minutos e repita novamente este protocolo de fase S1 na fase S2 para o experimento controle.

Para a análise dos dados, converta as imagens em uma pilha. Utilizando uma função interna do ImageJ, ajuste o brilho e o contraste da pilha para maximizar a faixa dinâmica, caso tenha ocorrido deriva horizontal significativa. Durante o experimento, execute os plugins StackReg e TurboReg no ImageJ para alinhar a pilha de imagens.

Em seguida, o plugin analisador de séries temporais. Depois, defina as regiões de interesse em pelo menos 90 terminações nervosas. É útil alternar entre as imagens antes e depois da descarga do corante para revelar as terminações nervosas ativas.

Um tamanho ideal de região de interesse é aquele ligeiramente maior que um terminal nervoso típico. Em seguida, obtenha a intensidade total de fluorescência de cada região de interesse ao longo do tempo. Depois disso, exporte para o Microsoft Excel.

É apresentado aqui um diagrama de fluxo de um experimento controle no qual neurônios granulares cerebelares foram carregados com FM 1-43 a 10 micromolar utilizando estimulação de 80 hertz por 10 segundos. Aqui há uma imagem mostrando terminais nervosos carregados com FM 1-43. Esta é a mesma imagem mostrando 90 regiões de interesse numeradas selecionadas para análise após a identificação de terminais nervosos ativos, e estas são as imagens dos terminais nervosos nos pontos de tempo selecionados.

Essas imagens são apresentadas em cores falsas para ilustrar as alterações na fluorescência à medida que os diferentes compartimentos de vesículas sinápticas foram esgotados. Por fim, aqui são mostradas as unidades de fluorescência normalizadas desses 90 terminais nervosos. Nas fases S um e S dois, a queda da fluorescência de cada estimulação sequencial pode ser medida e comparada entre as fases S um e S dois.

Neste experimento controle, tanto S um quanto S dois resultaram em tamanhos idênticos dos compartimentos prontamente liberáveis e de reserva. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como quantificar o recrutamento e a mobilização de compartimentos específicos de vesículas sinápticas em terminais nervosos centrais utilizando técnicas de imagem de fluorescência vital. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de confirmar a viabilidade celular e a resposta funcional realizando os experimentos controle S um antes de variar as condições experimentais S dois.