Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a capacidade de reparo da membrana tanto no animal quanto nas células isoladas. As fibras musculares esqueléticas isoladas são coletadas e cercadas com meios contendo o corante FM 1 43. Um laser UV é então usado para irradiar e danificar uma parte da membrana celular para permitir a entrada do corante na célula.

As células isoladas são transfectadas com DNA plasmático expressando GFP MG 53, que se localizará na membrana plasmática e no citosol da célula. A ponta de um microeletrodo é então inserida na membrana C dois C 12 para induzir danos. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram a translocação da GFP MG 53 para o local da lesão.

A demonstração visual deste método é fundamental, uma vez que as práticas necessárias para dominar as técnicas de penetração de microeletrodos e isolamento de fibras musculares. Demonstrando o procedimento estarão o Dr. Lin, nosso gerente de laboratório, o Dr. Wazu, um colega de pós-doutorado Matt Orange, um estudante de pós-graduação, e o Dr. Shaza, um professor assistente de pesquisa em nosso departamento. Para começar, coloque uma bandeja ou um bloco de laboratório azul embaixo da esteira para coletar os resíduos dos animais durante o experimento.

Em seguida, defina o ângulo da superfície da esteira. Algumas esteiras possuem um aparato integral para ajustar a inclinação, enquanto outras exigem que a esteira seja elevada por outros meios. Uma superfície plana ou um ângulo entre sete e 15 graus para baixo ou para cima é geralmente usado.

Aclimate os ratos colocando-os na esteira com a rede elétrica desligada e o motor de acionamento por correia ligado, mas sem se mover por 15 minutos após o período de aclimatação, ligue a rede elétrica motivacional. Inicie a esteira com uma velocidade inicial de aproximadamente cinco metros por minuto. Com velocidades aumentando de um a dois metros por minuto a cada minuto, permita ao animal um período de aquecimento de cinco minutos.

Repita esse período de aquecimento todos os dias por três a 10 dias para aumentar a conformidade durante o teste. Para executar um exercício de exaustão aguda. Aumente a velocidade da esteira ao longo do tempo até que uma velocidade máxima seja alcançada e monitore os sinais de exaustão.

Um animal é considerado exausto quando passa mais da metade do tempo fora da esteira ou cinco segundos consecutivos na grade. Remova o mouse exausto e registre o tempo total de execução. Treinamento de resistência.

Os protocolos em execução começam com o mesmo procedimento de aquecimento. No entanto, a velocidade máxima é geralmente menor e os tempos de execução podem ser bastante longos. Retorne os ratos à gaiola de casa após o teste e limpe a esteira com 70% de etanol.

Isole a camada superficial do músculo flexor curto dos dedos do pé para análise posterior. Primeiro, corte a pele da sola na linha mediana, tomando cuidado para não danificar o músculo por baixo. Em seguida, faça cortes horizontais e remova a pele.

Identifique o tendão branco plano do músculo FDB ligado ao osso calcâneo. Use uma pinça para separar e depois cortar o tendão próximo ao local de fixação. Puxe o tendão para cima suavemente enquanto corta qualquer tecido conjuntivo.

Localize onde os tendões distais se ramificam nos dígitos individuais. Corte os tendões onde eles se conectam à camada mais profunda do músculo e remova o FDB. Coloque o feixe muscular FDB em um mililitro de solução de colagenase Pré-aqueça a 37 graus Celsius.

Prenda o tubo horizontalmente em um agitador orbital de 37 graus Celsius e agite a 200 RPM por 65 minutos. A digestão suficiente é marcada por aparência assustadora e cor pálida. Corte a ponta de uma pipeta de um mililitro para permitir a passagem do feixe digerido.

Transfira facilmente o feixe para um tubo de centrífuga contendo cerca de 600 microlitros de 2,5. Cálcio tyro. Vire suavemente o tubo para sacudir as fibras soltas do feixe.

Em seguida, corte a extremidade de uma ponta de pipeta de 30 microlitros para que o diâmetro seja apenas ligeiramente menor que o feixe muscular. Use esta ponta para puxar o feixe para dentro da pipeta e, em seguida, empurre-o de volta para a solução. Repita esse processo até que a maioria das fibras seja dissociada do feixe.

Misture as fibras dissociadas girando suavemente o tubo. Remova a quantidade desejada e coloque em um prato delta T com fundo de vidro. Armazene as fibras restantes a quatro graus Celsius por aproximadamente seis horas para uso e estudos adicionais.

Deixe o prato descansar por cinco minutos. Isso permite que as fibras adiram ao fundo de vidro do prato. Coloque o prato com fundo de vidro em um microscópio confocal equipado com um laser UV.

Observe as fibras sob microscopia de fase com ampliação superior a 100 x para verificar a presença de um padrão de estrias normal e uma forma de haste reta. Adicione matrizes de períneo FM 1 43 ou FM 4 64 à solução até uma concentração final de 2,5 micromolar. Oriente a fibra em um ângulo de 45 graus do canto superior esquerdo do campo de visão para o canto inferior direito para induzir danos.

Irradie uma área de cinco por cinco pixels da membrana plasmática. Usando um laser UV ajustado para potência máxima por cinco segundos, a região irradiada deve dividir a membrana plasmática que é metade da caixa de cinco por cinco deve estar dentro da fibra, enquanto o restante deve estar fora da fibra capturar imagens de entrada de corante na fibra em intervalos de cinco segundos cada por até cinco minutos. Apenas três fibras podem ser irradiadas por prato, pois o corante fluorescente acabará sendo endocitado na fibra e complicará qualquer análise de dados.

Depois que três fibras são usadas, um novo prato deve ser preparado. Usando um software de análise, calcule a mudança na intensidade da fluorescência em uma área de aproximadamente 200 mícrons quadrados para comparação entre as fibras. O cálculo a seguir deve ser feito para cada quadro delta F dividido por F zero, onde F zero é a fluorescência média da região de interesse no primeiro quadro capturado e delta F é a mudança de fluorescência em cada quadro subsequente.

Use métodos padrão para transfectar células com DNA plasmidial expressando GFP MG 53. Em seguida, prepare as micropipetas. Coloque um capilar Pyrex em uma micropipeta.

Puxe e puxe por programa predefinido. Conecte a micropipeta a uma cultura de micromanipulador de três eixos. O meio é removido da placa delta T e substituído por tampão tirano de cálcio 2,5 milimolares.

Coloque o prato contendo células transfectadas em um microscópio confocal de varredura a laser com objetiva de imersão em óleo 40 x 1.3 NA. Induza danos agudos às células vivas inserindo a micropipeta na membrana celular e, em seguida, retraindo rapidamente a micropipeta para fora da célula. Colete imagens consecutivas de células vivas em um intervalo de 1,54 segundos por quadro para a ruptura da membrana induzida pela troponina.

PERFU 0,005% troponina a uma taxa de aproximadamente um mililitro por minuto diretamente acima da célula que está sendo fotografada. A esteira pode ser usada para medir uma redução na capacidade de corrida. Os camundongos knockout MG 53 vistos aqui têm capacidade de corrida reduzida devido a danos no músculo esquelético.

A extensão do dano causado pelo laser UV depende da capacidade de reparo da membrana da fibra vista. Aqui está uma fibra antes da lesão em um camundongo normal. Esta imagem foi capturada 200 segundos depois e mostra uma pequena lesão.

Uma fibra muscular derivada dos camundongos knockout MG 53 com capacidade de reparo de membrana comprometida exibirá uma entrada de corante mais significativa após a lesão observada. Aqui está um exemplo de um tubo F A seta nesta imagem aponta para GFP MG 53 contendo vesículas que se movem em direção aos locais de dano.

Neste exemplo, a saponina foi usada para danificar a membrana plasmática. Observe a translocação de GFP MG 53 do citosol para a membrana celular após a lesão. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de isolar boas fibras musculares com membranas sarais lisas e padrões de estrias claros.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como avaliar a capacidade de reparo da membrana do músculo e da cultura, as células.