Name: Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-30T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Aprenda a visualizar o reparo de membrana mediado por MG53 em fibras musculares esqueléticas isoladas e células transfectadas. Este método utiliza laser UV e microeletrodos para estudar mecanismos de resselamento da membrana plasmática.

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1. Corrida em esteira para revelar a extensão da lesão muscular em ratos <ol><li> Estabelecer o ângulo da superfície esteira para uso durante o protocolo de execução. Geralmente, uma plana ou um ângulo entre 7 ° e 15 ° graus para baixo ou para cima é usado. Algumas esteiras têm em aparelho essencial para ajustar a inclinação, enquanto outros exigem a esteira para ser elevado através de outros meios. </li><li> Coloque uma bandeja ou uma almofada de laboratório azul debaixo da esteira antes de colocar os animais na esteira para coletar os resíduos dos animais durante o protocolo de execução. </li><li> Antes de ratos em execução devem ser aclimatados ao ambiente da esteira. Este envolve a colocação dos animais na esteira por 15 minutos com a rede elétrica fora eo motor de acionamento por correia em mas o cinto não em movimento (ou seja, com a velocidade fixada em 0 m / s). </li><li> Ligue a rede elétrica motivacional. A intensidade ea freqüência dos pulsos utilizados geralmente podem ser controlados em esteiras, mas varia de um fabricante para outro. Geralmente, a intensidade máxima não é necessária para motivar os ratos para correr enquanto uma alta freqüência (pelo menos uma vez a cada dois segundos) vai melhorar a adesão. </li><li> Ativar o cinto de esteira para iniciar o protocolo de execução. Uma velocidade inicial de aproximadamente 5 metros / min deve ser usado para um período de aquecimento para os ratos. A velocidade da esteira pode ser acelerado lentamente, normalmente adicionando 1-2 metros / min para cada minuto após o início da esteira. </li><li> Cumprimento dos animais na maioria dos protocolos pode ser melhorada através da realização de uma série de corridas curtas (5 minutos) a uma velocidade de aquecimento de 3 a 10 dias antes da execução experimental começa. </li><li> Um exercício de exaustão aguda geralmente envolvem o aumento da velocidade da esteira com o tempo até uma velocidade máxima (geralmente &lt;30 m / m) é alcançado e mantido até que os ratos mostram sinais de esgotamento. Critérios para julgar a exaustão variar, mas geralmente incluem um rato passar mais de metade do tempo na rede elétrica ou 5 segundos consecutivos na rede elétrica sem retornar para a superfície da esteira. Depois de um mouse individuais está esgotado, pode ser retirado da esteira eo tempo total de execução pode ser gravado. </li><li> Mudando o ângulo da esteira pode ser usada em ensaios aguda a correr para aumentar a carga de exercício (com um ângulo para cima) ou para induzir danos contrações excêntricas (com um ângulo de descida) que rasgam as membranas sarcolemmal de fibras musculares 1. Evans corante azul pode ser injetado em animais antes de tais procedimentos para uso como corante histológico para identificar fibras musculares danificadas 2,3. </li><li> Treinamento de resistência execução protocolos proporcionam uma carga de exercício para o animal durante um período de tempo prolongado (até meses) a fim de produzir o remodelamento do músculo ou o sistema cardiovascular. Warm up procedimento é o mesmo que acima (passo 1.5) no entanto a velocidade máxima é geralmente mais baixos e os tempos de execução pode ser muito longo (&gt; 1 hora). </li><li> Após a conclusão da execução dos camundongos podem ser devolvidos aos seus gaiolas. Esteiras geralmente tornam-se muito sujo, enquanto os ratos estão sendo executados, principalmente por meio de protocolos de comprimento. É necessário limpar a esteira, geralmente com um spray de etanol 70%, após cada uso. </li></ol> 2. Ex Assay Vivo da Capacidade de Membrana de reparo de fibras musculares isoladas após UV laser-Damage <ol><li> Dissecar a camada superficial do músculo flexor brevis (FDB) do pé mouse. Primeiro, corte a pele da sola aberta na linha mediana, enquanto tomando cuidado para não danificar o músculo por baixo, em seguida, faça cortes horizontais e remover a pele. O tendão do apartamento branco de FDB músculo (tendão proximal) pode ser visto ligado ao osso calcâneo. Sem rodeios separar o tendão por fórceps e separarão os próximos tendão ao local de fixação, agarre o tendão livre por fórceps e puxe-o suavemente para separar os FDB dos tecidos adjacentes ao cortar qualquer tecido conjuntivo que permanecem conectados. Ao ver o ramo tendões distais à dígitos individuais do FDB pode ser removido por corte onde estes tendões se conectar à camada mais profunda do músculo. </li><li> Coloque o feixe muscular FDB em 1 ml de solução de colagenase pré-aquecido a 37 ° C em um tubo Eppendorf 1,5 ml, tape o tubo em uma orientação horizontal em um 37 ° C e agitar agitador orbital a 200 rpm por 65 min. Tempos de incubação pode ter de ser ajustada para assegurar uma digestão suficiente, o que é indicado por uma aparência desgastada e cor pálida do músculo. </li><li> Transferir cuidadosamente o pacote FDB digerido em um tubo de centrífuga de 1,5 l contendo 600 mL ~ de 2,5 Tyrode + Ca 2 através de um uma ponta da pipeta ml com uma extremidade de corte que tem um diâmetro suficiente para permitir que o feixe digerida facilmente passar sem interrupções. Suavemente virar o tubo para agitar as fibras soltas do pacote. </li><li> Cortar uma ponta de pipeta 30 mL de modo que o diameter é apenas ligeiramente menor do que o feixe muscular (entre 15-20 m de diâmetro) Use a pipeta suavemente para desenhar o pacote para a pipeta e depois empurrá-lo de volta para a solução.. Repita esse processo até que a maioria das fibras são dissociados do pacote. </li><li> Mix de fibras disassociated bem suavemente girando o tubo, tomar quantidade desejada e solte um prato fundo de vidro T delta. O volume de carga vai variar de acordo com a eficiência do isolamento e do número de fibras úteis que são necessárias em um prato para um protocolo particular. As fibras remanescentes podem ser armazenados no tubo a 4 ° C por aproximadamente seis horas para estudos adicionais. </li><li> Permitir que o prato se sentar sem ser perturbado por 5 minutos. Isto permite que as fibras de aderir ao fundo de vidro do prato. </li><li> Coloque o prato de vidro em um fundo de microscopia confocal equipado com um laser UV. Observe as fibras em microscopia de fase em&gt; aumento de 100X para verificar a presença de um padrão de estriação normal e uma haste, em linha reta como a forma. </li><li> Adicionar FM1-43 ou corantes FM4-64 styrylpyridinium 4 a solução para uma concentração final de 2,5 mM 5. </li><li> Para induzir a danos para a posição de fibra-lo na janela de imagem para que a fibra é orientada em um ângulo de 45 ° a partir do canto superior esquerdo do campo de visão para o canto inferior direito (Figura 1). Irradiar uma área de 5x5 pixel (aproximadamente 0.9μmx0.9μm) da membrana plasmática usando um laser UV (80 mW ou mais, 351/364 nm) para definir potência máxima por 5 segundos. A região irradiada deve dividir a membrana plasmática, ou seja, metade da caixa de 5x5 deve ser no interior da fibra, enquanto o restante deve ser fora da fibra (Figura 1). </li><li> Capturar imagens de entrada corante na fibra em intervalos de 5 segundos cada por até 5 minutos. </li><li> Repita o passo 2.8 para não mais de 3 fibras por prato, como o corante fluorescente será eventualmente endocytosed na fibra e complicar qualquer análise de dados. Depois de 3 fibras um novo prato deve ser preparado a partir do passo 2.5. </li><li> Analisar os dados, calculando a mudança na intensidade de fluorescência (ΔF / F 0) entre cada quadro capturado para medir a quantidade de entrada corante. Isto requer a medição da fluorescência média de uma área de aproximadamente 200 mM 2, utilizando o software de análise, como o ImageJ publicamente disponíveis (http://rsbweb.nih.gov/ij/). Para a comparação entre as fibras, o seguinte cálculo deve ser feito para cada quadro: ΔF / F 0, onde F 0 é a fluorescência média da região de interesse no primeiro quadro capturado (t = 0; antes da lesão), e ΔF é a mudança de fluorescência de cada quadro subseqüente (FF 0). </li></ol> 3. Ao vivo imagens de células Confocal para monitorar o processo dinâmico de Reparação Membrana Celular <ol><li> Micropipetas foram feitas a partir PYREX capilares. O capilar foi colocado em um extrator micropipeta e puxado por pré-definidos do programa (calor = 695; Pull = 50; Vel .= 55; Time = 250). </li><li> Micropipeta foi anexado a um micromanipulador de 3 eixos (xyz). </li><li> Células são transfectadas com DNA plasmidial usando métodos normais em um prato fundo de vidro delta T. Meios de comunicação devem ser transferidos para 2,5 Ca 2 + tampão Tyrode antes dos experimentos começar. </li><li> Pratos de vidro contendo células transfectadas foram colocados em um microscópio confocal de varredura a laser com o objectivo de imersão 1.3NA óleo de 40X. </li><li> O dano live-celular aguda foi realizada através da inserção da micropipeta na membrana celular e então rapidamente retirar a micropipeta para fora da célula 3,6. Consecutivos imagens de células vivas foram obtidas em um intervalo de 1,54 s / frame. </li><li> Para o ensaio interrupção induzida membrana saponina, saponina 0,005% (Sigma) em 2,5 mm Ca 2 + tampão Tyrode foi perfundidos por um sistema de perfusão de fluxo por gravidade custom-montados 7. A taxa de perfusão é de aproximadamente 1 ml / min ea ponta de perfusão deve ser colocado diretamente acima da célula que está sendo fotografada. </li></ol> 4. Resultados representativos: Um filme representante da esteira rolante do mouse pode ser feita durante as filmagens. O filme vai ilustrar a capacidade reduzida de funcionamento do mg53 / - ratos, devido aos danos ao músculo esquelético. A extensão dos danos causados ​​pelo protocolo de danos UV laser detalhado acima depende da capacidade de reparação da membrana da fibra analisada. Esta capacidade é afetada pelo genótipo do mouse a partir do qual a fibra foi isolado, condições extracelular, e quaisquer alterações a expressão da proteína (transfecção ou infecção). A fibra tipo normal selvagens permitirá leve a moderada entrada corante (Figura 2a). Fibra muscular derivado do mg53 / - ratos com capacidade comprometida membrana reparação irá exibir a entrada mais significativa de corante na fibra (Figura 2b). Os resultados típicos de translocação de microeletrodos mostram lesão de MG53 contendo vesiculos para o local da lesão. Figura 3a e 3b mostram GFP-MG53 C2C12 transfectadas miotubos danificado pela inserção da micropipeta na membrana celular. Na célula antes que os danos micropipeta, GFP-MG53 é localizado em ambos os membrana plasmática e citoplasma 3. Após a penetração micropipeta, GFP-MG53 vesículas contendo mudou para sites de dano (como indicado pela seta). Figura 3c mostra um GFP-MG53 C2C12 transfectadas mioblastos tratados com 0,005% de saponina, um detergente que podem permeabilizar a membrana plasmática. Após tratamento saponina, GFP-MG53 translocado do citosol para a membrana celular. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Weisleder, et al. Figura 1. Alinhamento das fibras e definição região lesão. Orientação adequada da fibra muscular isolada dentro do campo de visão e definição da região ferimentos mostrados. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Weisleder, et al. Figura 2. Danos a laser UV de fibras FDB. Imagens mostram fibras antes da lesão (0 sec, à esquerda) e em 200 lesões pós sec (direita). Fibras de um camundongo de tipo selvagem (a) mostram ferimentos leves. Fibras de ratos com a reparação da membrana comprometida (b) permitir que mais tinta para entrar. <img src="/files/ftp_upload/2717/2717fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> Weisleder, et al. Figura 3. Microeletrodos e saponina danos às células em cultura. Imagens mostram miotubos C2C12 (a, b) e um mioblastos C2C12 (c) antes da lesão (acima) e lesão pós (em baixo). Células ferido com um microeletrodo (a, b) mostram MG53 translocação para sites lesão (setas). Células tratadas com saponina (c) mostram MG53 translocação para a membrana celular.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esteira rolante é uma metodologia útil no fornecimento de uma carga de exercícios para os animais tratados. Como uma metodologia para medir a função muscular ou da capacidade de resistência é uma abordagem notoriamente barulhentos que é difícil de executar de uma forma consistentemente reprodutíveis 8. Em geral, os tempos até a exaustão pode ser usado como um ponto final para resolver diferenças importantes entre os grupos experimentais, tais como aquelas entre algumas linhas e camundongos knockout rato do tipo selvagem 9. Manipulações experimentais que produzem diferença mais sutil, como alguns ensaios farmacêuticos, não pode resolver as diferenças acima do ruído associado a essa técnica. A fim de maximizar a reprodutibilidade ea sensibilidade destas técnicas é importante para manter as condições para uma sessão para outra de muito perto. A hora do dia os animais são exercidas, bem como as condições de aquecimento período utilizado, são fatores importantes e devem permanecer consistentes de julgamento para julgamento. Efeitos estirpe pode ter impacto significativo sobre o projeto de protocolos de esteira como certas cepas de camundongos pode funcionar por muito mais tempo na esteira do que outras linhagens e respondem diferentemente ao exercício de resistência 10. Como orientação geral, muitos ratos será capaz de executar 200-300 metros no total, em um estudo de exaustão com constante aumento na velocidade da esteira (5 velocidade m / m inicial com 1 m / m adicionado por cada minuto após o início). Para um exercício de resistência dos ratos pode ser executado entre 9 a 12 m / m por 30 minutos 2 ou 3 vezes por semana. No entanto, estudos individuais geralmente requerem alguma otimização do protocolo para corresponder às necessidades individuais experimental. O procedimento de danos UV laser tem demonstrado ser um método eficaz para medir a capacidade de reparação da membrana das fibras musculares esqueléticas 3,6,11. Um componente vital para o sucesso desses experimentos é a utilização de fibras musculares que exibem apenas uma linha reta, a aparência da haste em forma com um padrão regular de estrias e um sarcolema lisa que não aparece enrugada. Se outras fibras musculares são selecionados dano à membrana pode já estar presente nestas fibras e interpretação dos resultados desses experimentos pode ser complicado. Também é importante que a orientação da fibra e definição da região irradiada os definidos na Figura 1. Isto proporciona uma lesão de tamanho reprodutível, permitindo a comparação entre as fibras. Se a região definida de lesão está completamente dentro da fibra, uma lesão interna será criado ao invés de interromper o sarcolema. Além disso, o valor calculado para ΔF / F 0 é muito sensível para a região de interesse selecionada para a medição de fluorescência média. Uma área de aproximadamente 200μm 2, adjacentes, e incluindo o local da lesão, é adequado. Ao contrário da região definida por lesão, esta área deve estar completamente dentro da fibra. Se você incluir espaço fora da fibra, resultando em branco a área vai aumentar ΔF / F 0 em fibras com entrada pouco de corante, reduzindo ΔF / F 0 em fibras com um fenótipo mais grave. Isso diminui a sensibilidade do ensaio, fazendo comparação entre as fibras mais difícil. Para o ensaio danos micropipeta, o ângulo entre o micropipeta e prato fundo de vidro deve ser de aproximadamente 45 graus, a fim de efetivamente dano à membrana celular. As células foram escolhidos por danos micropipeta devem ser bem colocado no fundo do prato e células arredondadas não deve ser usado desde muito provavelmente eles vão separar após micropipeta cutucando. Experimentos permeabilzation saponina são menos exigentes tecnicamente e relativamente rápido para executar comparação com micropipeta ensaios de penetração. No entanto, há várias limitações a danos saponina, incluindo a apenas uma célula pode ser usado por prato desde saponina será difusa e danos outras células que prato.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th></tr><tr><td> Esteira de roedores </td><td> Columbus Instruments Exer 06/03 ou equivalente </td><td></td></tr><tr><td> Etanol 70% </td><td> ISC Bioexpress </td><td></td></tr><tr><td> Instrumentos de dissecação, incluindo fórceps de ponta fina, tesoura primavera </td><td> Precision Instruments mundo </td><td></td></tr><tr><td> Colagenase tipo 2 mg / ml I </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 0 Ca 2 + tampão Tyrode (140 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> 2.5mm Ca 2 + tampão Tyrode (140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl 2, 5 mM KCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl 2, pH 7,2, 290 mOsm) </td><td> Sigma </td><td></td></tr><tr><td> Temperatura controlável agitador orbital </td><td> New Brunswick ou equivalente </td><td></td></tr><tr><td> Delta Dish TPG </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1207133 </td></tr><tr><td> LSM microscópio confocal 510 com uma empresa de laser UV 80 mW ou microscópio confocal equivalente </td><td> Zeiss </td><td></td></tr><tr><td> FM1-43-64 ou FM4 corantes </td><td> Invitrogen </td><td></td></tr><tr><td> Borosilicato Tamanho Capilares 0,8-1,0 X 100 mm </td><td> PYREX </td><td> Peça n º 9530-2 </td></tr><tr><td> Micropipeta extrator </td><td> Sutter Instruments </td><td> modelo P-97 </td></tr><tr><td> 3 micromanipulador eixo </td><td> Narishige </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Radiance 2100 microscópio de varredura a laser confocal ou microscópio equivalente </td><td> BioRad </td><td> MHW-3 </td></tr><tr><td> Saponina </td><td> Sigma </td><td> 47036 </td></tr></tbody></table>

visualização de mg53 mediada repair membrana celular usando in vivo e in vitro sistemas

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Reparação de lesão aguda para a membrana celular é um processo elementar de fisiologia celular normal, e com defeito de reparo de membrana tem sido associada a muitas doenças degenerativas humanas. A recente descoberta de MG53 como um componente chave da máquina resealing membrana permite um melhor entendimento molecular da biologia básica de reparação tecidual, bem como para potenciais aplicações translacional em medicina regenerativa. Aqui detalhamos os protocolos experimentais para explorar a função in vivo de MG53 no reparo de lesão muscular, utilizando protocolos de exercício em esteira em modelos de mouse, para testar a capacidade de reparação ex vivo de membrana, medindo entrada corante em fibras musculares isoladas, e para monitorar o processo dinâmico de MG53 mediada tráfico vesícula e reparação da membrana celular em células de cultura de células vivas usando microscopia confocal.

Aqui descritos são protocolos utilizados para visualizar o processo dinâmico de MG53 mediada por reparação de membrana celular em animais inteiros e em nível celular. Estes métodos podem ser aplicados para investigar a biologia das células do plasma resealing membrana e medicina regenerativa.

Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

A reparação de lesões agudas na membrana celular é um processo fundamental da fisiologia celular normal, e a reparação membranar defectuosa tem sido associada a muitas...

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a capacidade de reparo da membrana em animais e em células isoladas. Fibras musculares esqueléticas isoladas são coletadas e envolvidas em meio contendo o corante FM 1-43. Um laser de luz ultravioleta é então usado para irradiar e danificar uma porção da membrana celular, permitindo a entrada do corante no interior da célula. Células isoladas são transfectadas com DNA plasmidial expressando GFP MG 53, que se localizará na membrana plasmática e no citosol da célula. Em seguida, a ponta de um microeletrodo é inserida na membrana C2C12 para induzir dano. Por fim, podem ser obtidos resultados que demonstram a translocação da GFP MG 53 para o local da lesão.A demonstração visual deste método é essencial, pois envolve práticas necessárias para dominar as técnicas de penetração com microeletrodos e isolamento de fibras musculares. A demonstração do procedimento será realizada pelo Dr. Lin, nosso gerente de laboratório, Dr. Wazu, um pesquisador pós-doutorando, Matt Orange, um estudante de pós-graduação, e Dra. Shaza, professora assistente de pesquisa do nosso departamento. Para começar, coloque uma bandeja ou um suporte laboratorial azul sob a esteira para coletar os resíduos dos animais durante o experimento.Em seguida, ajuste o ângulo da superfície da esteira. Algumas esteiras possuem um dispositivo integrado para ajustar a inclinação, enquanto outras exigem que a esteira seja elevada por outros meios. Geralmente, utiliza-se uma superfície plana ou um ângulo entre sete e 15 graus em subida ou descida.Acostume os camundongos colocando-os na esteira com a grade elétrica desligada e o motor do cinto ligado, mas sem movimento, por 15 minutos. Após o período de aclimatação, ligue a grade elétrica de motivação. Inicie a esteira com uma velocidade inicial de aproximadamente cinco metros por minuto. Aumente a velocidade de um a dois metros por minuto a cada minuto, permitindo que o animal tenha um período de aquecimento de cinco minutos.Repita este período de aquecimento diariamente por três a dez dias para aumentar a adesão durante os testes. Para realizar um exercício agudo até a exaustão, aumente a velocidade da esteira ao longo do tempo até atingir a velocidade máxima e observe sinais de exaustão.Um animal é considerado exausto quando passa mais da metade do tempo fora da esteira ou cinco segundos consecutivos sobre a grade. Remova o camundongo exausto e registre o tempo total de corrida. Treinamento de resistência.Os protocolos de corrida iniciam com o mesmo procedimento de aquecimento. No entanto, a velocidade máxima geralmente é menor e os tempos de corrida podem ser bastante longos. Retorne os camundongos para suas gaiolas de origem após o teste e limpe a esteira com etanol 70%.Isole a camada superficial do músculo flexor digitorum brevis do pé para análises posteriores. Primeiro, corte a pele da sola ao longo da linha mediana, tomando cuidado para não danificar o músculo subjacente. Em seguida, faça cortes horizontais e remova a pele.Identifique o tendão branco e achatado do músculo FDB ligado ao osso calcâneo. Use uma pinça para separar e, em seguida, seccionar o tendão próximo ao local de inserção. Puxe suavemente o tendão para cima enquanto corta os tecidos conjuntivos adjacentes.Localize onde os tendões distais se dividem nos dedos individuais. Corte os tendões no ponto em que se conectam à camada mais profunda do músculo e remova o FDB. Coloque o feixe muscular FDB em um mililitro de solução de colagenase pré-aquecida a 37 graus Celsius.Fixe o tubo horizontalmente em um agitador orbital a 37 graus Celsius e agite a 200 RPM por 65 minutos. A digestão suficiente é indicada por aparência frouxa e cor pálida. Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de um mililitro para permitir que o fragmento digerido passe através dela.Transfira facilmente o feixe para um tubo de centrífuga contendo cerca de 600 microlitros de Tyro de cálcio 2,5. Vire suavemente o tubo para agitar as fibras soltas do feixe.Em seguida, corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 30 microlitros de modo que o diâmetro seja apenas ligeiramente menor que o do feixe muscular. Use essa ponteira para aspirar o feixe para dentro da pipeta e, em seguida, empurre-o de volta para a solução. Repita este processo até que a maioria das fibras esteja dissociada do feixe.Misture as fibras dissociadas girando suavemente o tubo. Remova a quantidade desejada e deposite sobre um prato delta T com fundo de vidro. Armazene as fibras restantes a quatro graus Celsius por aproximadamente seis horas para uso e estudos adicionais.Deixe o recipiente em repouso, sem perturbação, por cinco minutos. Isso permite que as fibras adiram ao fundo de vidro do recipiente. Coloque o recipiente com fundo de vidro em um microscópio confocal equipado com um laser de ultravioleta.Observe as fibras em microscopia de contraste de fase com aumento superior a 100 x para verificar a presença de um padrão de estriação normal e uma forma reta semelhante a uma haste. Adicione FM 1 43 ou FM 4 64 estireno perineo corantes à solução até uma concentração final de 2,5 micromolar. Oriente a fibra em um ângulo de 45 graus, do canto superior esquerdo do campo de visão até o canto inferior direito, para induzir dano.Irradie uma área de cinco por cinco pixels da membrana plasmática. Usando um laser UV ajustado na potência máxima durante cinco segundos, a região irradiada deve dividir a membrana plasmática de modo que metade da caixa de cinco por cinco fique dentro da fibra, enquanto o restante deve permanecer fora da fibra. Capture imagens da entrada do corante na fibra em intervalos de cinco segundos cada, durante até cinco minutos. Apenas três fibras podem ser irradiadas por placa, pois o corante fluorescente eventualmente será endocitado pela fibra e poderá complicar qualquer análise de dados.Após o uso de três fibras, um novo recipiente deve ser preparado. Utilizando um software de análise, calcule a variação na intensidade de fluorescência em uma área de aproximadamente 200 micrômetros quadrados para comparação entre as fibras. O seguinte cálculo deve ser realizado para cada quadro: delta F dividido por F zero, em que F zero é a fluorescência média da região de interesse no primeiro quadro capturado e delta F é a variação da fluorescência em cada quadro subsequente.Utilize métodos padrão para transfectar células com DNA plasmidial expressando GFP MG 53. Em seguida, prepare as micropipetas. Coloque uma capilar de Pyrex em uma micropipeta.Puxar e puxar por programa predefinido. Prenda a micropipeta a um manipulador micrométrico de três eixos. O meio é removido do recipiente delta T e substituído por tampão de Tyrode com cálcio 2,5 milimolar.Coloque a placa contendo as células transfectadas sobre um microscópio confocal de varredura a laser com objetivo de imersão a óleo de 40 x 1,3 NA. Induza dano agudo em células vivas inserindo a micropipeta na membrana celular e, em seguida, retrai rapidamente a micropipeta para fora da célula. Colete imagens consecutivas de células vivas em intervalos de 1,54 segundos por quadro para a perturbação da membrana induzida pela troponina.PERFU 0,005% de troponina a uma taxa de aproximadamente um mililitro por minuto diretamente acima da célula em observação. A esteira pode ser usada para medir uma redução na capacidade de corrida. Os camundongos knockout para MG 53 mostrados aqui apresentam capacidade de corrida reduzida devido a danos no músculo esquelético.O grau de dano causado pelo laser UV depende da capacidade de reparo da membrana da fibra observada. Aqui está uma fibra antes da lesão em um camundongo normal. Esta imagem foi capturada 200 segundos depois e mostra uma lesão leve.Uma fibra muscular derivada de camundongos com deleção do MG 53 e capacidade de reparo de membrana comprometida exibirá entrada mais acentuada de corante após lesão. Abaixo, tem-se um exemplo de um miotubo C2C12 não danificado, transfectado com GFP-MG 53. A seta nesta imagem aponta para vesículas contendo GFP-MG 53 que se movem em direção aos locais de dano.Neste exemplo, a saponina foi utilizada para danificar a membrana plasmática. Observe a translocação do GFP MG 53 do citosol para a membrana celular após a lesão. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de isolar boas fibras musculares com membranas sarcolemal lisas e padrões de estriação definidos.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a capacidade de reparo da membrana muscular e da cultura, as células.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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