Visualização de MG53 mediada Repair Membrana Celular Usando In vivo E In vitro Sistemas

O objetivo geral deste procedimento é avaliar a capacidade de reparo da membrana em organismos inteiros e em células isoladas. Fibras musculares esqueléticas isoladas são coletadas e envolvidas por meio contendo o corante FM 1 43. Um laser de UV é então usado para irradiar e danificar uma porção da membrana celular, permitindo a entrada do corante na célula.

Células isoladas são transfectadas com DNA plasmidial que expressa GFP MG 53, a qual se localizará na membrana plasmática e no citosol da célula. Em seguida, a ponta de um microeletrodo é inserida na membrana C dois C 12 para induzir dano. Por fim, podem ser obtidos resultados que mostram a translocação da GFP MG 53 para o local da lesão.

A demonstração visual deste método é essencial, pois envolve práticas necessárias para dominar as técnicas de penetração com microeletrodos e isolamento de fibras musculares. A demonstração do procedimento será realizada pelo Dr. Lin, nosso gerente de laboratório, Dr. Wazu, um pesquisador pós-doutorando, Matt Orange, um estudante de pós-graduação, e Dra. Shaza, professora assistente de pesquisa do nosso departamento. Para começar, coloque uma bandeja ou um suporte azul de laboratório sob a esteira para coletar os resíduos dos animais durante o experimento.

Em seguida, ajuste o ângulo da superfície da esteira. Algumas esteiras possuem um dispositivo integrado para ajustar a inclinação, enquanto outras precisam ser elevadas por outros meios. Geralmente, utiliza-se uma superfície plana ou um ângulo entre sete e 15 graus em subida ou descida.

Acostume os camundongos colocando-os na esteira com a grade elétrica desligada e o motor do cinto ligado, mas sem movimento, por 15 minutos. Após o período de aclimatação, ligue a grade elétrica de estímulo. Inicie a esteira com uma velocidade inicial de aproximadamente cinco metros por minuto. Aumente a velocidade de um a dois metros por minuto a cada minuto, permitindo que o animal tenha um período de aquecimento de cinco minutos.

Repita este período de aquecimento diariamente por três a dez dias para aumentar a adesão durante os testes. Para realizar um exercício agudo até a exaustão, aumente a velocidade da esteira ao longo do tempo até atingir uma velocidade máxima e observe sinais de exaustão.

Um animal é considerado exausto quando passa mais da metade do tempo fora da esteira ou cinco segundos consecutivos sobre a grade. Remova o camundongo exausto e registre o tempo total de corrida. Treinamento de resistência.

Os protocolos de corrida iniciam com o mesmo procedimento de aquecimento. No entanto, a velocidade máxima geralmente é menor e os tempos de corrida podem ser bastante longos. Retorne os camundongos para suas gaiolas de origem após o teste e limpe a esteira com etanol 70%.

Isole a camada superficial do músculo flexor digitorum brevis do pé para análises posteriores. Primeiro, corte a pele da sola ao longo da linha mediana, tomando cuidado para não danificar o músculo subjacente. Em seguida, faça cortes horizontais e remova a pele.

Identifique o tendão branco e plano do músculo FDB, preso ao osso calcâneo. Use uma pinça para separar e, em seguida, seccionar o tendão próximo ao local de inserção. Puxe suavemente o tendão para cima enquanto corta qualquer tecido conjuntivo.

Localize onde os tendões distais se dividem nos dedos individuais. Corte os tendões no ponto em que se ligam à camada mais profunda do músculo e remova o FDB. Coloque o feixe muscular FDB em um mililitro de solução de colagenase pré-aquecida a 37 graus Celsius.

Fixe o tubo horizontalmente em um agitador orbital a 37 graus Celsius e agite a 200 RPM por 65 minutos. A digestão suficiente é indicada por aparência turva e cor pálida. Corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de um mililitro para permitir que o fragmento digerido passe através dela.

Transfira facilmente o feixe para um tubo de centrífuga contendo cerca de 600 microlitros de Tyro de Cálcio 2,5. Vire suavemente o tubo para agitar as fibras soltas do feixe.

Em seguida, corte a extremidade de uma ponteira de pipeta de 30 microlitros para que o diâmetro seja apenas ligeiramente menor que o do feixe muscular. Use essa ponteira para aspirar o feixe para dentro da pipeta e, em seguida, empurre-o de volta para a solução. Repita este processo até que a maioria das fibras esteja dissociada do feixe.

Misture as fibras dissociadas girando suavemente o tubo. Remova a quantidade desejada e deposite em uma placa delta T com fundo de vidro. Armazene as fibras restantes a quatro graus Celsius por aproximadamente seis horas para uso e estudos adicionais.

Deixe o recipiente em repouso, sem perturbar, por cinco minutos. Isso permite que as fibras adiram ao fundo de vidro do recipiente. Coloque o recipiente com fundo de vidro em um microscópio confocal equipado com um laser UV.

Observe as fibras em microscopia de contraste de fase com aumento superior a 100 x para verificar a presença de um padrão de estriação normal e de uma forma reta semelhante a uma haste. Adicione FM 1 43 ou FM 4 64 styro perineum dies à solução até uma concentração final de 2,5 micromolar. Oriente a fibra em um ângulo de 45 graus, do canto superior esquerdo ao canto inferior direito do campo de visão, para induzir dano.

Irradie uma área de cinco por cinco pixels da membrana plasmática. Usando um laser UV ajustado na potência máxima por cinco segundos, a região irradiada deve cortar a membrana plasmática de modo que metade da caixa de cinco por cinco fique dentro da fibra, enquanto o restante deve permanecer fora da fibra. Capture imagens da entrada do corante na fibra em intervalos de cinco segundos cada, durante até cinco minutos. Apenas três fibras podem ser irradiadas por placa, pois o corante fluorescente eventualmente será endocitado pela fibra e poderá complicar qualquer análise de dados.

Após o uso de três fibras, um novo recipiente deve ser preparado. Utilizando um software de análise, calcule a variação na intensidade de fluorescência em uma área de aproximadamente 200 micrômetros quadrados para comparação entre as fibras. O seguinte cálculo deve ser realizado para cada quadro: delta F dividido por F zero, em que F zero é a fluorescência média da região de interesse no primeiro quadro capturado e delta F é a variação da fluorescência em cada quadro subsequente.

Utilize métodos padrão para transfectar células com DNA plasmidial expressando GFP MG 53. Em seguida, prepare as micropipetas. Coloque uma capilar de Pyrex em uma micropipeta.

Puxe e repita conforme programa predefinido. Fixe a micropipeta a um manipulador micrométrico de três eixos. O meio é removido do recipiente delta T e substituído por tampão Tyrode com cálcio 2,5 milimolar.

Coloque a placa contendo as células transfectadas sobre um microscópio confocal de varredura a laser com objetiva de imersão a óleo de 40 x 1,3 NA. Induza dano agudo em células vivas inserindo a micropipeta na membrana celular e, em seguida, retrai rapidamente a micropipeta para fora da célula. Colete imagens consecutivas de células vivas em intervalos de 1,54 segundos por quadro para a perturbação da membrana induzida pela troponina.

PERFU 0,005% de troponina a uma taxa de aproximadamente um mililitro por minuto diretamente acima da célula em imagem. A esteira pode ser usada para medir uma redução na capacidade de corrida. Os camundongos knockout para MG 53 mostrados aqui apresentam capacidade de corrida reduzida devido a danos no músculo esquelético.

O grau de dano causado pelo laser UV depende da capacidade de reparo da membrana da fibra observada. Aqui está uma fibra antes da lesão em um camundongo normal. Esta imagem foi capturada 200 segundos depois e mostra uma lesão leve.

Uma fibra muscular derivada de camundongos com deleção do gene MG 53, cuja capacidade de reparo da membrana está comprometida, apresentará entrada mais acentuada de corante após lesão. Abaixo, temos um exemplo de um miotubo C2C12 não danificado, transfectado com GFP MG 53. A seta nesta imagem aponta para vesículas contendo GFP MG 53 que se movem em direção aos locais de dano.

Neste exemplo, a saponina foi utilizada para danificar a membrana plasmática. Observe a translocação do GFP MG 53 do citosol para a membrana celular após a lesão. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de isolar boas fibras musculares com membranas sarcolemáticas lisas e padrões de estriação bem definidos.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como avaliar a capacidade de reparo da membrana muscular e da cultura, as células.