Name: Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprenda o método Ice-Cap para genotipagem de alta vazão em Arabidopsis thaliana e tomate usando placas de 96 poços. Esta técnica permite isolar tecido radicular para extração de DNA de milhares de plantas em um único dia.

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Este trabalho foi financiado por uma bolsa da National Science Foundation (conceder número MCB-0447750).

<ol><li>Clark, K. A., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol%3A+An+improved+high-throughput+method+for+generating+tissue+samples+in+96-well+format+for+plant+genotyping+%28Ice-Cap+2.0%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0).</a> Plant Methods. 3, 8-8 (2007).</li>
<li>Krysan, P. I. ce-cap <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+capturing+plant+tissue+samples+for+genotype+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis.</a> Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).</li>
<li>Jander, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+map-based+cloning+in+the+post-genome+era%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era.</a> Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).</li>
<li>Liljegren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHATTERPROOF+MADS-box+genes+control+seed+dispersal+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis.</a> Nature. 404, 766-770 (2000).</li>
<li>Buechel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+A-type+ARABIDOPSIS+RESPONSE+REGULATORS+in+meristem+maintenance+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration.</a> Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).</li>
<li>Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+kinase+gene+family+encodes+essential+positive+regulators+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis.</a> Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).</li>
<li>Bush, S. M., Krysan, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iTILLING%3A+a+personalized+approach+to+the+identification+of+induced+mutations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis.</a> Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).</li>
<li>Comai, L., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING%3A+practical+single-nucleotide+mutation+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery.</a> Plant J. 45, 684-694 (2006).</li>
<li>Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TILLING.+Traditional+mutagenesis+meets+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics.</a> Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).</li>
<li>McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+induced+local+lesions+IN+genomes+%28TILLING%29+for+plant+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics.</a> Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

O método Ice Cap-apresentada aqui permite que um cientista para coletar amostras de tecido de centenas ou mesmo milhares, de plantas individuais em um único dia e eficiente extrair o DNA genômico das amostras para uso em reações de genotipagem. Dando um cientista individual a capacidade de genótipo milhares de mudas em um curto período de tempo, o método Ice Cap-tem o potencial para facilitar uma série de experiências genéticas que não seriam práticos para executar. Vários exemplos são fornecidos abaixo. <ol><li> Mapeamento genético. Numa escala de mapeamento genético pode ser acelerada se o pesquisador é capaz de identificar eventos de recombinação dentro de um intervalo específico ao longo do cromossomo 3. Se este intervalo envolve uma distância muito curta genética, então os eventos de recombinação será relativamente raros na população de mapeamento segregação. Por esta razão, pode ser necessário para milhares de tela de plantas individuais para encontrar a desejada reindivíduos combinant. Este processo pode ser bastante acelerada com a utilização de Ice Cap-. Mesmo na era do genoma re-seqüenciamento, é ainda necessário demonstrar diretamente que uma mutação é diretamente responsável por um fenótipo de interesse. Nestes casos, será necessário segregar as mutações de interesse longe de outras mutações intimamente ligada a fim de provar uma mutação candidato é realmente causador. Nestas situações, Ice Cap-se proporcionar um método eficiente para a quebra de ligação entre um par de mutações intimamente ligados. </li><li> Multi-mutantes. Tornou-se comum para pesquisadores que estudam Arabidopsis para combinar alelos mutantes de vários loci distintos em um único indivíduo, a fim de superar a redundância funcional 4-6. Como exemplo, considere um caso em que se deseja combinar alelos mutantes de quatro loci diferentes em uma única planta por meio de cruzamento genético. Para este projeto, será necessário para gerar umn indivíduo que é heterozigoto para estas quatro loci como parte do esquema de cruzamento. Quando isso quadruple-heterozigoto semente sets, o homozigoto quadruple é esperado para estar presente a uma taxa de um em cada 256 na população resultante da progênie. Triagem para essa pessoa rara pelos métodos tradicionais seria muito trabalhoso. Por comparação, usando Ice Cap-para este projeto proporcionaria o cientista com uma estratégia eficiente para identificar o homozigoto rara quadruplicar em uma única geração. </li><li> iTILLING. Nosso laboratório descreveu recentemente uma nova abordagem para screening para a presença de mutações induzidas em genes de interesse em 7 Arabidopsis. Este método é uma variação de uma técnica estabelecida chamado Tilling que é usado para localizar mutações em populações ordenada de indivíduos tratados com um agente mutagénico química 8-10. Nós chamamos nosso método iTILLING porque é uma versão individualizada de cultivo que permite que um indcientista ividual para realizar algo que tradicionalmente tem exigido uma equipe de pesquisa grande para ser concluído. Ice Cap-faz parte integrante do método iTILLING 7, conforme descrito abaixo. </li></ol> A idéia por trás iTILLING é produzir uma população mutante efêmera, que contrasta com as populações duráveis ​​mutante criado para projetos de Tilling tradicionais. Para iTILLING, sementes de uma população bulked M2 são semeadas em 5-10 blocos Ice Cap, e DNA é extraído utilizando o método de Ice Cap-. Arabidopsis mudas são então colocadas a 4 ° C, enquanto triagem de mutação é realizada utilizando o DNA Ice Cap- preps. Mudas de tomate são armazenadas a 12 ° C.. Uma vez que mudas de portadores de mutações desejadas tenham sido identificadas, elas são recuperadas das placas Ice Cap-e transferidos para o solo. iTILLING não se destina a fornecer uma população mutante de longa duração para uma comunidade de pesquisa toda a tela. Em vez disso, iTILLING fornece uma estratégia pela qualum cientista pode tela de uma população mutante personalizado para mutações em um punhado de genes com rapidez, eficiência e com um custo relativamente baixo. Foram encontradas Ice Cap-de ser um método eficaz para o cultivo e genotipagem Arabidopsis, tomate e arroz. Esperamos que outras espécies de plantas devem também ser passíveis de Ice Cap-. Uma limitação na variedade de espécies que podem ser acomodados por Ice-Cap é o tamanho das sementes. Apenas as plantas com sementes pequenas o suficiente para caber em poços de uma placa de 96 poços será compatível com Ice Cap-na sua configuração actual.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comments (opcional) </td></tr><tr><td> GenoGrinder </td><td> Spex / CertiPrep, Metuchen, NJ </td><td> 2000 Geno / Grinder </td><td> Máquina para agitar Placas Root para a extração de DNA </td></tr><tr><td> ABgene Thermo-Sealer </td><td> ABgene EUA </td><td> AB-0384 </td><td> Manual da máquina de vedação térmico utilizado para Placas Root antes de rompimento do tecido </td></tr><tr><td> Centrífuga equipado com portadores de microplacas balançando </td><td> Beckman Coulter </td><td> Allegra 25R </td><td> Qualquer centrífuga com as operadoras de microplacas balançando seria adequado </td></tr><tr><td> Micropartículas Dispenser de microplacas </td><td> Biotek www.biotek.com </td><td> AF1000A </td><td> Dispensador de líquido automatizado para microplacas enchimento </td></tr><tr><td> Bialetti marca17x11 polegadas assadeira comerciais de grande porte </td><td> Alvo Department Store </td><td> www.bialetti.com </td><td> Esta folha de cookie específico tem a profundidade ideal para Ice Cap- </td></tr><tr><td> Custom Made rack de metal </td><td> Loja de hardware </td><td></td><td> Veja o texto para descrição completa </td></tr><tr><td> 33 caixa de armazenamento Litro de plástico </td><td> Alvo Department Store </td><td> Sterilite Marca </td><td> Para Ice Cap-Fountain. Caixa de armazenamento de plástico grande o suficiente para segurar a assadeira 17x11 cm </td></tr><tr><td> 30 litros por hora Bomba Fountain </td><td> Sunterra </td><td> 104506 </td><td> Bomba submersível pequena fonte disponível em lojas da fonte do jardim </td></tr><tr><td> Mangueira para bomba da fonte </td><td> Qualquer empresa de fornecimento de laboratório </td><td></td><td> Mangueira compatível com a bomba da fonte </td></tr><tr><td> Braçadeira de plástico </td><td> Loja de hardware </td><td></td><td> Braçadeira para segurar mangueira para cookiesfolha </td></tr><tr><td> Limpar as tampas de plástico da Falcon fundo Microtest plana de 96 poços placas de poliestireno </td><td> BD Falcon www.bdbiosciences.com </td><td> 351172 </td><td> Limpar as tampas de plástico para cobrir Placas Ice Cap-Mudas </td></tr><tr><td> 3M esparadrapo micropore </td><td> Fisher Scientific </td><td> 19-027-761 </td><td></td></tr><tr><td> 3/32-inch diâmetro esferas de aço inoxidável </td><td> Hartford Technologies, Rocky Hill, CT </td><td> 034-006-1K </td><td> Usada para romper o tecido da raiz após a colheita </td></tr><tr><td> 3 polegadas elásticos de cabelo </td><td> Mercearia local </td><td></td><td> Usado para proteger Placa de raiz para Placa de Mudas </td></tr><tr><td> 4 milímetros de diâmetro espetos de madeira </td><td> Mercearia local </td><td></td><td> Estes espetinhos são tipicamente usados ​​para preparar espetinhos </td></tr><tr><td> Fisher Scientific Nunc marca de 1 ml placas de filtro sem fritas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 278012 </td><td> Placas de 96 poços de Mudas com furos no fundo. </td></tr><tr><td> Fisherbrand 96-Bem Chimney Tall-Placa PCR </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-230-242 </td><td> Placas de 96 poços Root </td></tr><tr><td> Agar - cultura de células testados </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1296 </td><td></td></tr><tr><td> 4 Morpholinoethanesulfonic ácido (MES) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2933 </td><td></td></tr><tr><td> Murashige e Skoog (MS) mistura de sal basal </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-5524 </td><td></td></tr><tr><td> Calor Peel fácil vedação folha </td><td> ABgene EUA </td><td> AB-0745 </td><td> Filme calor de vedação para vedação placas Root antes de rompimento do tecido </td></tr><tr><td> Duck Tape Embalagem Marca Extra Wide, 3,00 &quot;x 54,6 m </td><td> OfficeMax www.officemax.com </td><td> Item no. 21242139 </td><td> Fita adesivavedação de microplacas contendo extratos de DNA para o armazenamento </td></tr><tr><td> Rolo de vedação </td><td> Bio-Rad </td><td> MSR-0001 </td><td> Mão ferramenta de rolamento para pressionar fita de vedação adesiva para microplacas </td></tr><tr><td> De 96 poços bloco de metal térmica </td><td> Cole-Parmer </td><td> 36400-66 </td><td> Usado para congelar as Placas de raiz para a colheita de tecidos </td></tr><tr><td> Papel de filtro Whatman </td><td> Whatman Internacional </td><td> 1002 090 </td><td> Usado para esterilização de sementes de superfície </td></tr><tr><td> Descartáveis ​​Pasteur Pipeta </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-6A </td><td> 5 ¾ &quot;descartáveis ​​pipeta Pasteur utilizado para a transferência de sementes para Placa de Mudas </td></tr><tr><td> Pyrex assadeira (20 cm x 30 cm) </td><td> Alvo Department Store </td><td></td><td> Usado para construir um banho de gelo / etanol seco. </td></tr></tbody></table>

ice cap: um método para crescer arabidopsis plantas e tomate em placas de 96 poços para high-throughput genotipagem

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

Está se tornando comum para os cientistas de plantas para desenvolver projetos que requerem a genotipagem de grande número de plantas. O primeiro passo em qualquer projeto de genotipagem é coletar uma amostra de tecido de cada planta individual. A abordagem tradicional para essa tarefa é para as plantas uma amostra-at-a-tempo. Se alguém deseja centenas genótipo ou milhares de indivíduos, no entanto, usando esta estratégia resulta em um gargalo significativo no pipeline genotipagem. O método Ice Cap-que descrevemos aqui oferece uma solução de alto rendimento a este desafio, permitindo que um cientista para coletar o tecido de vários milhares de mudas em um único dia, 1,2. Este nível de vazão é tornada possível pelo fato de que o tecido é colhido a partir de plantas 96-at-a-tempo, ao invés de um-em-um-tempo. O método Ice Cap-fornece uma plataforma integrada para a realização de um crescimento de mudas, a colheita de tecidos e extração de DNA. A base para Ice Cap-se o crescimento de seedlings em um par empilhadas de placas de 96 poços. Os poços da placa superior contêm fichas de ágar em que o crescimento de mudas individuais germinar. As raízes crescem para baixo através dos meios de ágar, sair da placa superior através de um buraco, e passar para uma água mais baixo da placa que contém. Para a colheita de tecidos para a extração de DNA, a água na parte inferior da placa contendo tecido raiz é rapidamente congelado, enquanto as mudas na placa superior permanecer em temperatura ambiente. A placa superior é, então, descoladas da placa inferior, resultando em um prato com 96 amostras de raízes tecido congelado em gelo e uma placa com 96 mudas viáveis. A técnica é chamada de &quot;Ice Cap-&quot; porque usa gelo para capturar o tecido radicular. A placa de 96 poços contendo as mudas pode, então, embrulhados em papel alumínio e transferidos para baixa temperatura. Este processo suspende um maior crescimento das mudas, mas não afeta a sua viabilidade. Pois a análise de genótipo foi concluída, as mudas com o genótipo desejado pode ser transferido do p de 96 poçostarde para o solo para a propagação ainda mais. Temos demonstrado a utilidade do método de Ice Cap-usando Arabidopsis thaliana, tomate, arroz e mudas. Esperamos que o método deve também ser aplicável a outras espécies de plantas com sementes pequenas o suficiente para caber nas cavidades da placas de 96 poços.

O método Ice Cap-permite cultivar plantas em placas de 96 poços e não-destrutiva do tecido raiz colheita de cada muda. DNA extraído dessa raiz tecido pode ser usado para reações de genotipagem. Descobrimos que Ice Cap-funciona bem para<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt;, Tomate, mudas e arroz.

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

Está se tornando comum que cientistas de plantas desenvolvam projetos que exijam a genotipagem de um grande número de plantas. A primeira etapa de qualquer genotipagem...

O objetivo geral deste experimento é isolar amostras de tecido radicular de plântulas cultivadas em placas de 96 poços para extração de DNA e genotipagem. Isso é realizado primeiramente germinando plântulas em placas especiais de 96 poços que contêm meio de crescimento com ágar e possuem orifícios na base de cada poço. O segundo passo é empilhar a placa com as plântulas sobre uma placa padrão de 96 poços preenchida com água.Uma vez que as raízes tenham crescido para dentro da placa inferior de 96 poços, as placas empilhadas são colocadas em um bloco congelador para congelar a água na placa inferior. O passo final é destacar a placa superior da placa inferior, quebrando as raízes, que ficam congeladas na placa inferior. Em última análise, as amostras resultantes de tecido radicular podem ser usadas para extrair amostras de DNA de cada planta individual para análise de genótipo.A principal vantagem do ice cap em comparação com métodos alternativos é que ele permite isolar DNA de milhares de plantas em um único dia. Esse nível de produtividade é possível porque, com o ice cap, as plantas são manipuladas 96 de cada vez, ao invés de uma a uma, conforme o método tradicional. Alguns exemplos de como o ice cap pode ser utilizado incluem a triagem de grandes populações de plantas para identificar recombinantes raros entre genes ligados, a geração de plantas que carregam um grande número de mutações diferentes e mapeadas, e a realização de seleção assistida por marcadores em espécies de cultivo.Basicamente, qualquer experimento que envolva custos com genotipagem, envolvendo grande número de plantas individuais, pode potencialmente se beneficiar do vaso icecap. Desenvolvemos originalmente o icecap para uso com o coelho com abcesso, mas também obtivemos sucesso ao utilizá-lo para coletar tecido de plântulas de arroz e tomate. Esperamos que o ice cap também seja eficaz em outras espécies, desde que suas sementes sejam pequenas o suficiente para caber em uma placa de 96 poços.Primeiro, enrole as placas de plântulas em papel alumínio e autoclave ao mesmo tempo. Após a conclusão do ciclo de autoclave, mergulhe as tampas plásticas transparentes das placas de plântulas em etanol 95%, deixando as placas e as tampas secarem completamente em uma cabine de fluxo laminar. Uma vez que as placas estejam totalmente secas, aplique fita adesiva na parte inferior de cada placa de plântula e feche firmemente utilizando um rolo compressor.Em seguida, utilize um dispensador de microplacas microfill ou uma pipeta multicanal para dispensar 450 microlitros de meio de crescimento fundido nos poços de cada placa de plântulas. Cubra as placas com tampas plásticas e deixe o meio de crescimento solidificar à temperatura ambiente. Polvilhe sementes secas sobre papel filtro Watman e cubra completamente cada semente com etanol 95%.Em seguida, deixe as sementes secarem completamente ao ar. Depois, transfira as sementes para as placas de plântulas tocando primeiro a extremidade selada ao fogo de uma pipeta de vidro modificada na superfície do meio de ágar. Isso umedece a ponta da pipeta e permite que uma única semente seja facilmente coletada e transferida para a superfície do ágar.Depois que cada poço contiver uma semente, cubra cada placa de plântulas com uma tampa de plástico transparente e feche com fita cirúrgica microporosa. Envolva as placas empilhadas com papel alumínio e armazene a quatro graus Celsius por quatro dias para estratificar as sementes e sincronizar a germinação. Após quatro dias, coloque as placas de plântulas sob luz fluorescente a 18 a 20 graus Celsius por mais quatro dias.Para iniciar a germinação, monte a fonte de gelo em uma prateleira da sala de crescimento de plantas, de modo que a superfície da fonte de gelo receba iluminação fluorescente direta. Para montar, primeiro coloque a estrutura personalizada de suporte dentro de uma caixa plástica de armazenamento e, em seguida, coloque uma assadeira em cima dessa estrutura.Use as porcas de nivelamento para ajustar o nível da assadeira. Em seguida, coloque uma bomba submersível na caixa de armazenamento e conecte a mangueira de saída da bomba à lateral da assadeira usando um grampo com mola. Depois, encha a fonte de gelo com uma mistura de três partes de água destilada para uma parte de água da torneira.Deve-se adicionar água até que a bomba submersível fique alguns centímetros abaixo do nível da água. Marque o nível final da água na caixa plástica de armazenamento usando fita adesiva laboratorial e uma caneta marcadora. Prepare as placas de raiz adicionando uma esfera de aço inoxidável a cada poço de uma placa de raiz de 96 poços.Em seguida, distribua 340 microlitros de uma mistura de três partes de água destilada para uma parte de água da torneira em cada poço da placa de raiz. Remova o filme adesivo da parte inferior das placas de plântulas e retire as tampas de plástico transparentes.Coloque cada placa de plântulas em uma placa de raiz contendo uma esfera metálica e água e fixe as placas emparelhadas juntas usando duas tiras elásticas. Em seguida, coloque as placas empilhadas na fonte de gelo. O par de placas deve permanecer na fonte de gelo por 10 a 14 dias.Durante este período, mantenha o nível de água na fonte de gelo represando com água destilada. Quando a maioria das plântulas tiver tecido radicular que tenha penetrado nas placas de raiz, remova as placas da fonte de gelo para preparar a coleta do tecido radicular. Após a remoção das placas da fonte de gelo, insira três palitos de madeira entre os poços das placas empilhadas de plântulas e raízes.Os palitos vão elevar as pontas das placas de plântulas para fora dos poços das placas de raiz. Deixe as placas empilhadas do tipo "ice cap" com os palitos de madeira inseridos em repouso durante a noite sob luzes. Esta incubação permite uma leve evaporação do líquido nas placas de raiz, o que facilita os processos subsequentes de congelamento e separação das placas.No dia da coleta do tecido, prepare um banho de congelamento. Coloque um bloco térmico metálico de 96 poços em uma placa de Pyrex com uma mistura de gelo seco e etanol a 95%. Deixe o bloco térmico atingir o equilíbrio térmico por cerca de 20 minutos.Coloque as placas empilhadas do disco de gelo com palitos de madeira sobre o bloco térmico gelado e incube por cinco minutos. Durante esse tempo, a água na placa de raiz congelará completamente. Retire as placas empilhadas do disco de gelo do banho de congelamento e coloque-as sobre a bancada do laboratório em temperatura ambiente; remova as tiras elásticas e os palitos de madeira das placas empilhadas.Pressione firmemente a parte superior da placa de plântulas para quebrar as placas. Em seguida, separe cuidadosamente a placa de raízes da placa de plântulas. Deixe a água nas placas de raízes descongelar à temperatura ambiente.Caso contrário, o descongelamento pode ser acelerado incubando as placas de raiz em um bloco térmico. Ajuste a temperatura para 25 graus Celsius enquanto as placas de raiz descongelam. As placas de plântulas podem ser preparadas para armazenamento.Para fazer isso, feche a parte inferior da placa de plântulas com fita adesiva. Em seguida, coloque uma tampa de plástico transparente sobre a placa de plântulas e fixe com fita microporo. Empilhe as placas com as plântulas, envolva-as com papel alumínio e coloque as plântulas de arabidopsis a quatro graus Celsius. As plântulas podem ser armazenadas nessas temperaturas por várias semanas sem afetar a viabilidade. Certifique-se de que a água nas placas de raiz tenha descongelado completamente.Antes de realizar o procedimento de extração de DNA, inspecione também as placas para determinar se algum poço contém significativamente menos água do que a média; pipete água destilada nos poços que necessitarem de água adicional. Em seguida, pipete 25 microlitros de solução de TRISS 500 milimolar, EDTA 50 milimolar em cada poço da placa de raízes. Em seguida, feche os poços das placas de raízes utilizando folha de vedação térmica e uma máquina de vedação a quente.Coloque as placas seladas de raízes na máquina geno grinder com a extremidade selada das placas voltada para baixo. Agite as placas no geno grinder por três minutos e meio a 1.350 golpes por minuto. Transfira as placas para uma centrífuga com porta-placas de microplacas e centrifugue as placas por 10 minutos a 3.500 RPM a quatro graus Celsius para formar um pellet do tecido radicular pulverizado.Usando uma pipeta multicanal, transfira 20 microlitros de sobrenadante de cada poço da placa de raízes para uma placa fresca de 96 poços que contém 80 microlitros de água milli Q em cada poço. Esse extrato diluído contém DNA genômico que pode ser diretamente utilizado na reação de PCR de genotipagem de acordo com protocolos padrão. Uma vez que o genótipo de cada plântula tenha sido identificado, remova as placas de plântulas do armazenamento refrigerado e prepare potes com mistura de solo saturada com água usando ar pressurizado e uma mangueira de borracha; aplique pressão suave de ar no orifício pequeno do poço da placa de plântulas para fazer com que a bucha de ágar e a plântula saiam da placa e caiam sobre a bancada do laboratório.Faça um pequeno orifício no solo com aproximadamente o mesmo tamanho do disco de ágar. Em seguida, coloque o disco de ágar no solo e pressione o solo úmido ao redor dele para fixar a plântula no lugar. Coloque as plântulas transplantadas sob luz, a uma temperatura de 18 a 22 graus Celsius.Cubra cada vaso com uma tampa de plástico pelos primeiros dois dias após o transplante. Em seguida, remova a tampa e cultive a planta em condições padrão de crescimento. Esta imagem ilustra plântulas de Arabidopsis cultivadas na fonte de gelo por duas semanas e prontas para a coleta de tecido.Cada um dos dois poços contém uma plântula de arabidopsis. Esta vista lateral dos mesmos dois poços da placa de raízes mostra as raízes torcendo-se ao redor da superfície interna dos poços. Um domínio alcançado. Esta técnica pode ser usada para processar até 40 placas icecap em um dia de oito horas.Isso permite que um cientista produza preparações de DNA de mais de 3.800 plântulas individuais em um único dia. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar-se de transferir as placas com as plântulas para a fonte de gelo assim que as plântulas germinarem. Verifique as placas diariamente para não perder o momento correto da transferência. Boa sorte com seus experimentos.

ice-cap-method-for-growing-arabidopsis-tomato-plants-96-well-plates

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O ensaio de inundação de mudas facilita a rápida triagem das adesões de tomate selvagem para a resistência à bactéria Pseudomonas seringae. Este ensaio, usado em conjunto com o ensaio de crescimento bacteriano de mudas, pode auxiliar na caracterização da resistência subjacente à bactéria, e pode ser usado para mapear populações para determinar a base genética da resistência.

Identificação de alta duração da resistência a Pseudomonas syringae pv. Tomate no Tomate usando Ensaio de Inundação de Mudas

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

Aqui, descrevemos uma ferramenta avançada projetada para o monitoramento da biossíntese de clorofila durante os estágios iniciais da desetiolação de plântulas de Arabidopsis . A nova metodologia fornece imagens não invasivas de fluorescência da clorofila em tempo real com alta resolução espacial e temporal.

Ensaio Não Invasivo para Determinação da Cinética de Biossíntese de Clorofila durante os Estágios Iniciais da Desetiolação de Arabidopsis

Aprenda o método Ice-Cap para genotipagem de alta vazão em Arabidopsis thaliana e tomate usando placas de 96 poços. Esta técnica permite isolar tecido radicular para extração de DNA de milhares de plantas em um único dia.

Ice Cap: Um Método para Crescer Arabidopsis Plantas e tomate em placas de 96 poços para High-Throughput Genotipagem

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