Name: Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Aprenda a preparar bibliotecas de sequenciamento Illumina mRNA-Seq a partir de apenas 10 nanogramas de RNA total usando amplificação linear T7. Este método permite análise de expressão gênica em amostras limitadas.

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Este trabalho foi financiado por fundos do Instituto Morgridge de Pesquisas e da Universidade de Wisconsin Foundation. Agradecemos a Krista Eastman para a assistência editorial.

<ol><li>Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+transcriptome+profiling+using+selective+hexamer+priming+for+cDNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis.</a> Nature Methods. 6, 647-649 (2009).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRT-seq+amplification-free%2C+strand-specific+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing.</a> Nature Methods. 5, 130-132 (2010).</li>
<li>Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+consistent%2C+fully+representative+mRNA-Seq+libraries+from+ten+nanograms+of+total+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA.</a> Biotechniques. 49, 898-904 (2010).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome.+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).</li>
<li>Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+gene+expression+estimation+with+read+mapping+uncertainty%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty.</a> Biotechniques. 26, 493-500 (2010).</li>
<li>Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn">http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn</a> Forthcoming.</li>
<li>ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.epibio.com/item.asp?id=578">http://www.epibio.com/item.asp?id=578</a> Forthcoming.</li>
</ol>

Os autores revelam que JAT é um dos fundadores, stockowner, consultor e membro do conselho da Cellular Dynamics International (CDI). Ele também atua como assessor científico e tem interesses financeiros em Tactics II Ventures células-tronco.

Protocolos atuais para fazer bibliotecas final emparelhados exigem entre 1 mg 9-2,5 mg 10 montante inicial de RNA total. Aqui apresentamos a nossa linear de amplificação T7 método (T7LA) com base para preparar a única bibliotecas final ler e emparelhado Illumina seqüenciamento e mostrar que este método permite a geração de bibliotecas de tão baixo quanto 10 ng de RNA total, produzindo dados que é comparável à de minimamente amplificado (MinAmp) bibliotecas feitas a partir de 1000 o material de partida vezes mais (10 mg RNA total). As 10 bibliotecas ng não só identificar semelhante o número total de genes, mas também produzem assinaturas de expressão gênica que são semelhantes (Figuras 3a e b). Além disso, tanto o single bibliotecas final ler e pares produzidas pelo método T7LA são muito semelhantes entre si (Figura 3c), que permite aos pesquisadores comparar os dados gerados pelas bibliotecas feitas a partir de qualquer protocolo. Uma vez que essas bibliotecas foram preparados a partir de RNA humano de células-tronco embrionárias, buscamosde 30 genes de células-tronco específicas entre as bibliotecas e descobrir que quase todos esses genes (93-100%) são identificadas pelas bibliotecas feita a partir de pelo menos 10 ng de RNA total de partida (Figura 4), validando o nosso protocolo. Acreditamos que o nosso protocolo seria muito útil para pesquisadores, especialmente em circunstâncias como as células de fluxo classificados ou a laser micro-dissecados tecidos onde o material de partida é limitante. Em tais circunstâncias, o nosso protocolo permitiria a geração de dados de expressão gênica comparável às bibliotecas feita a partir de quantidades muito maiores de partida desde o nosso protocolo produz perfis de expressão comparáveis ​​entre pelo menos 3 ordens de magnitude de RNA de partida.

<table border="1"><tbody><tr><td> Companhia </td><td> Kit / Reagente </td><td> Catalogo </td><td> Comentários especiais </td></tr><tr><td> Ambion </td><td> O reagente de fragmentação </td><td> AM8740 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> A acrilamida Liner </td><td> AM9520 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> MEGAscript T7 Kit </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion </td><td> DEPC não tratados água livre de nuclease </td><td> AM9932 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTP set </td><td> R0181 </td><td></td></tr><tr><td> Fermentas </td><td> dNTPs metilado </td><td> R0431 </td><td> Para preparação de amostras Único Somente leitura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq SR Cluster Generation kit v5 </td><td> GD-203-5001 </td><td> Para preparação de amostras Único Somente leitura </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq Seq Kit v5 36 ciclos </td><td> FC-104-5001 </td><td></td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Chip Amostra Seq Prep Kit </td><td> IP-102-1001 </td&gt; <td> Para preparação de amostras Único Somente leitura. Pode ser substituído por amostra NEB prep DNA Mix Master Set 1 Cat # E6040S </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> TruSeq PE Cluster Generation kit v5 </td><td> PE-203-5001 </td><td> Para prep emparelhado final amostra apenas </td></tr><tr><td> Illumina </td><td> Emparelhado End Sample Prep Kit </td><td> PE-102-1001 </td><td> Para prep emparelhado final amostra apenas </td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> 1kb ladder mais </td><td> 10787-018 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli Rnase H </td><td> 18021-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Rnase Out </td><td> 10777-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Tampão vertente 2 5x </td><td> 10812-014 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA polimerase </td><td> 18010-017 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E-gel SYBR 2% seguro </td><td> G521802 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Sobrescrito III (com 5X FS buffer e DTT 0,1 M) </td><td> 18080-085 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Trizol </td><td> 12183555 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> RNA ensaio quibit kit </td><td> Q32852 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> dsDNA HS qubit ensaio kit </td><td> Q32851 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> E. coli DNA ligase </td><td> 18052-019 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Polimerase DNA T4 </td><td> 18005-025 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Ultra Pure Dnase água Rnase </td><td> 10977-015 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Sobrescrito II dupla kit síntese de cDNA encalhado </td><td> 11917-020 </td><td></td></tr><tr><td> Invitrogen </td><td> Primer aleatório (Invitrogen) </td><td> 48190-011 </td><td> Para prep emparelhado final amostra apenas </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Not1Nonamer cartilha B </td><td> N / A </td><td> Para Single Leia samsoas prep apenas </td></tr><tr><td> IDT </td><td> Oligo dT T7 </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> NEB </td><td> Not1 kit digestão </td><td> R0189S </td><td> Para preparação de amostras Único Somente leitura </td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy Minelute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> RNEasy Mini Kit (50) </td><td> 74104 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Kit de purificação de gel </td><td> 28604 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> DNase set </td><td> 79254 </td><td></td></tr><tr><td> Qiagen </td><td> Rneasy MinElute kit </td><td> 74204 </td><td></td></tr><tr><td> Zymo Research </td><td> DNA limpo e concentrador (250X) </td><td> D4014 </td><td></td></tr></tbody></table>

leia única e emparelhados end mrna-seq bibliotecas illumina de 10 nanogramas rna total

Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA

Seqüenciamento do transcriptoma inteiro por mRNA Seq-se amplamente utilizado para realizar a expressão gênica global, mutação, expressão alelo-específico e outras análises genômicas. mRNA-Seq ainda abre o portão para a análise de expressão gênica de genomas seqüenciados não. mRNA Seq oferece alta sensibilidade, uma grande gama dinâmica e permite a medição do número de cópias transcrição em uma amostra. Analisador Illumina genoma realiza sequenciamento de um grande número (&gt; 10 7) da seqüência relativamente curta lê (&lt;150 pb). O &quot;emparelhado fim&quot; abordagem, em que uma leitura única e longa é seqüenciado em ambas as extremidades a sua, permite o rastreamento junções splice alternativo , inserções e deleções, e é útil para a montagem de transcriptoma novo. Um dos grandes desafios enfrentados pelos pesquisadores é uma quantidade limitada de matéria-prima. Por exemplo, em experimentos onde as células são colhidas por laser micro-dissecção, disponível a partir de RNA total de may medida em nanogramas. Preparação de mRNA Seq-bibliotecas a partir de tais amostras foram descritas 1, 2, mas envolve a amplificação por PCR significativo que pode introduzir viés. Outros RNA-Seq procedimentos de construção da biblioteca com a amplificação PCR mínima foram publicados 3, 4, mas requerem quantidades micrograma de RNA total de partida. Aqui nós descrevemos um protocolo para a plataforma Illumina Genome Analyzer II para mRNA Seq-seqüenciamento para a preparação de biblioteca que evita a amplificação PCR significativa e requer apenas 10 nanogramas de RNA total. Embora este protocolo foi descrito anteriormente e validado para um único fim de seqüenciamento 5, onde foi mostrado para produzir bibliotecas direcional sem introduzir viés de amplificação significativa, aqui nós validá-lo para utilização como um protocolo final emparelhados. Nós seletivamente amplificam RNA mensageiro polyadenylated de iniciar RNA total usando o T7 com base Eberwine método de amplificação linear, cunhado &quot;T7LA &quot;(T7 amplificação linear). Amplificada O poli-A mRNAs são fragmentados, reverso transcrito e adaptador ligado para produzir a biblioteca seqüenciamento final. Para ambos única corre final ler e emparelhado, as seqüências são mapeados para o transcriptoma humano 6 e normalizados para que dados de várias execuções podem ser comparados. Relatamos a medida de expressão gênica em unidades de transcrições por milhão (TPM), que é uma medida superior a RPKM quando se comparam amostras 7.

Aqui nós descrevemos um método para a preparação de ambos única leitura e emparelhado final Illumina mRNA Seq-libraries seqüenciamento para análise de expressão gênica com base na amplificação T7 RNA linear. Este protocolo requer apenas 10 nanogramas de começar RNA total e gera bibliotecas altamente consistentes representando transcrições todo.

Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total

O sequenciamento do transcriptoma completo por mRNA-Seq é atualmente utilizado extensivamente para realizar a expressão gênica global, mutações, expressão alelo-específica e outras...

O objetivo geral deste procedimento é gerar bibliotecas de sequências de mRNA Illumina a partir de pequenas quantidades de material inicial. O primeiro passo do procedimento é a transcrição reversa de RNA total com primers DTT sete para produzir CD NA. O CD NA é utilizado para amplificação de RNA por transcrição in vitro. Posteriormente, o RNA amplificado é submetido à fragmentação aleatória.A transcrição reversa do RNA fragmentado produz DNAc, que passa por ligação de adaptadores, seleção por tamanho e amplificação por PCR. Em última análise, este protocolo revela o perfil de expressão gênica da amostra por meio da medição dos números de cópias gênicas. A principal vantagem desta técnica é que ela requer apenas 10 nanogramas de RNA total inicial.Isso é várias ordens de grandeza menor do que o necessário em outros protocolos existentes. Além disso, pode gerar bibliotecas pareadas a partir de quantidades tão pequenas de RNA inicial. Este método permitirá que cientistas explorem novas questões na biologia, possibilitando a determinação de perfis de expressão gênica a partir de populações celulares difíceis de obter, como aquelas derivadas de microdissecção a laser ou de citometria de fluxo.Tivemos inicialmente a ideia de desenvolver este método quando precisamos analisar a expressão gênica a partir de um número muito limitado de células diferenciadas de células-tronco amnióticas humanas. A demonstração visual deste método é fundamental, pois as etapas de manipulação de RNA são difíceis de aprender devido à quantidade muito pequena de RNA, que pode ser facilmente degradada. O procedimento será demonstrado por Angela Elwell, Jennifer Bolen e Baal Kimm Wynn do meu laboratório.O método para preparar bibliotecas de sequenciamento de leitura simples e de extremidade pareada em paralelo é um procedimento multietapas, conforme mostrado neste fluxograma. Primeiro, o RNA total é isolado das células ou tecidos de interesse e utilizado para preparar o CD NA de fita dupla. Os RNAs mensageiros poliadenilados são então amplificados seletivamente a partir do CD NA utilizando o método de amplificação linear ewin baseado em T sete. Em seguida, o poli A A amplificado é fragmentado aleatoriamente.Após a limpeza do RNA fragmentado, ele é transcrito reversamente em CDNA. O CDNA é reparado nas extremidades e bases A são adicionadas à extremidade três prima dos fragmentos de DNA. Em seguida, realiza-se a ligação de adaptadores ao DNA e não é realizada digestão. No caso da biblioteca de leitura simples, a biblioteca de DNA é então isolada por purificação em gel e amplificada por PCR para ligar os adaptadores Illumina.Por fim, após a quantificação da biblioteca de DNA, ela estará pronta para o sequenciamento. Para os fins deste vídeo, apenas procedimentos selecionados dentro deste protocolo serão demonstrados. A transcrição reversa dos RNAm poliA fragmentados em cDNA envolve a síntese da fita simples e a síntese da segunda fita.Para a síntese da primeira fita da biblioteca de leitura simples, adicione os seguintes reagentes em um tubo de PCR: 10 microlitros de poli mRNA fragmentado e um microlitro de um iniciador aleatório de nove nucleotídeos não um. A sequência do iniciador de nove nucleotídeos não um é mostrada aqui. A sequência próxima à extremidade 5' mostrada em verde é o sítio de restrição não um.Embora a sequência mostrada em azul seja o complemento reverso da sequência do adaptador B da illumina do kit de sequenciamento de chip, incubar a mistura a 70 graus Celsius por cinco minutos no termociclador e, em seguida, resfriar rapidamente em gelo. Mantendo a mistura em gelo, adicionar os seguintes reagentes do kit superscript três: quatro microlitros de tampão de primeira fita 5 x, dois microlitros de DTT e 1,5 microlitro da mistura de DNTP. Na mistura de DNTP, usar cinco metil DCTP em vez de DCTP. Colocar o tubo no termociclador a 42 graus Celsius por dois minutos e, em seguida, adicionar um microlitro de superscript três, transcriptase reversa, e incubar a 42 graus Celsius por uma hora.Em seguida, prepare a reação para a síntese da primeira fita da biblioteca para fim paralelo. Adicione os seguintes reagentes em um tubo de PCR: 10 microlitros de poli NNA fragmentado e um microlitro de iniciador hexâmero aleatório. Incube a 65 graus Celsius por cinco minutos no termociclador e, em seguida, resfrie rapidamente em gelo.Mantendo o tubo no gelo, adicione os seguintes reagentes do kit Superscript Three: quatro microlitros de tampão para primeira fita 5x, dois microlitros de DTT e 1,5 microlitros de dNTPs. Incube no termociclador a 45 graus Celsius por um minuto. Em seguida, adicione um microlitro de Superscript Three, transcriptase reversa, e incube a 45 graus Celsius por uma hora. Após uma hora.Ambas as reações estão prontas para a síntese da segunda fita. Adicione a cada uma das misturas em gelo os seguintes reagentes do kit Superscript Two: 91 microlitros de água livre de nucleases, 30 microlitros de tampão 5x para segunda fita, três microlitros de dNTPs, um microlitro de DNA ligase de E. coli, quatro microlitros de DNA polimerase de E. coli e um microlitro de RNase H de E. coli. Misture cada tubo por inversão, em seguida centrifugue brevemente e incube a 16 graus Celsius por duas horas.Para o reparo de extremidades do cDNA da biblioteca de leitura simples, adicione a 40 microlitros de cDNA purificado os seguintes reagentes: cinco microlitros de tampão T4 DNA ligase com 10 milimolar de ATP, dois microlitros de mistura de dNTPs, um microlitro de polimerase T4 DNA, um microlitro de enzima klino e um microlitro de T4 PNK para o reparo de extremidades do cDNA. Para a biblioteca de leitura pareada, adicione a 30 microlitros de cDNA purificado estes reagentes: 45 microlitros de RNAs, água livre de DNAses.10 microlitros de tampão T4 DNA ligase com 10 milimolar. A TP quatro microlitros de mistura 10 milimolar de dNTPs, cinco microlitros de T4 DNA polimerase, um microlitro de enzima klino e cinco microlitros de T4 PNK. Incubar ambos os tubos no termociclador a 20 graus Celsius por 30 minutos após o reparo de extremidades.O próximo passo neste protocolo é adicionar bases de adenina à extremidade três prima dos fragmentos de DNA para a biblioteca de leitura simples. Prepare a seguinte mistura de reação: 34 microlitros da amostra de DNA, cinco microlitros de tampão klino, 10 microlitros de DATP e um microlitro de klino exo. Para a biblioteca de leitura pareada, prepare a seguinte mistura de reação: 32 microlitros da amostra de DNA, cinco microlitros de tampão clin out.Dez microlitros de DATP e três microlitros de clin out exo; incubar ambas as misturas de reação a 37 graus Celsius por 30 minutos antes de montar as reações para a ligação do adaptador. Descongelar os adaptadores em gelo e diluí-los na proporção de um para 20 para a biblioteca de leitura simples. Utilizar o kit de preparação de amostras de sequência do chip Illumina para preparar a seguinte mistura de reação: 10 microlitros da amostra de DNA, um microlitro da mistura de oligos do adaptador, 15 microlitros de tampão DNA Ligase 2X e quatro microlitros de DNA Ligase; incubar por 15 minutos.À temperatura ambiente para a biblioteca de leitura emparelhada, utilize o kit de preparação de amostras emparelhadas da Illumina para preparar a seguinte reação. Misture 10 microlitros da amostra de DNA, 10 microlitros da mistura de oligos do adaptador PE, 25 microlitros do tampão de ligase 2X e 5 microlitros de ligase de DNA; incube por 15 minutos a 20 graus Celsius ao final das respectivas incubações. Purifique ambas as reações de ligação utilizando colunas XMO.Elua, a biblioteca de leitura simples e 44 microlitros de água eluem a biblioteca de leitura pareada com seis microlitros de tampão de eluição, seguido por outra eluição em cinco microlitros de eb. Realize uma digestão não uma única vez, apenas para a biblioteca de leitura simples. Incube de duas horas a durante a noite a 37 graus Celsius após purificar a reação utilizando uma coluna ZY IMO.Elua a biblioteca de leitura simples com seis microlitros de tampão EB, seguido por uma segunda diluição com cinco microlitros de EB. Os DNA com adaptadores ligados, para ambas as bibliotecas, agora estão prontos para a seleção de tamanho. O procedimento de seleção de tamanho para o DNA com adaptadores ligados é realizado usando um gel de Cyber Safe EE 2% da In Vitrogen; para iniciar este procedimento, execute o programa zero pré-executado por dois minutos.Após a pré-eletroforese, carregue 10 microlitros do marcador de um KB plus e das amostras de 2D NA. Preencha as lacunas vazias com 10 microlitros de água e execute o programa. Um egel 2% corre por 28 minutos.Quando a corrida estiver concluída, selecione as fatias de gel de 200 a 300 pares de bases com uma lâmina de barbear nova. O número de genes identificados pelas diversas bibliotecas foi avaliado, e esta tabela mostra informações sobre os números de agrupamentos. Genes identificados com taxa de erro e porcentagem de alinhamento das bibliotecas de leitura simples e de extremidades pareadas, tanto para bibliotecas de leitura simples quanto de extremidades pareadas.As bibliotecas T sete LA de 10 nanogramas identificaram quase o mesmo número de genes que as bibliotecas não amplificadas de 10 microgramas com um TPM de 10 ou mais. No caso das bibliotecas de leitura única, a biblioteca T sete LA de 10 nanogramas identificou 100% dos 8.500 genes identificados pela biblioteca não amplificada de 10 microgramas para bibliotecas paradigmáticas. A biblioteca T sete LA de 10 nanogramas identificou 86% dos genes identificados pela biblioteca não amplificada de 10 microgramas.Bibliotecas feitas com menos de 10 nanogramas não foram capazes de identificar tantos genes. Por exemplo, no protocolo de leitura simples, a biblioteca T sete LA de um nanograma identificou apenas cerca de 50% dos genes identificados pela biblioteca min amp de 10 microgramas. Portanto, a menor quantidade de RNA total para uso com o protocolo T sete LA deve ser limitada a 10 nanogramas no mapeamento de um gene de manutenção.A DH GA mostra que todas as bibliotecas LA T sete feitas com pelo menos 10 nanogramas de RNA inicial identificaram todos os éxons, incluindo o éxon cinco primo extremo. A barra de escala à esquerda para as bibliotecas de leitura única indica 350 leituras no total. A barra de escala no centro para as bibliotecas DEN indica 5.000 leituras no total.Uma comparação das bibliotecas de leitura simples e de extremidades pareadas de 10 nanogramas de T seven LA com as bibliotecas min amp mostra um alto grau de similaridade. Obteve-se uma correlação de Spearman de 0,90 entre a biblioteca de leitura simples de 10 nanogramas de T seven LA e a biblioteca min amp de 10 microgramas, e uma correlação de 0,95 entre a biblioteca PEREN de 10 nanogramas de T seven LA e a biblioteca min amp de 10 microgramas. Além disso, foi realizada uma comparação entre as duas bibliotecas de leitura simples e PEREN preparadas a partir de 10 nanogramas de RNA total, e o coeficiente de correlação muito elevado demonstra que ambos os tipos de bibliotecas produzidos pelo protocolo T seven LA geram uma assinatura de expressão gênica muito semelhante.Por fim, uma vez que essas bibliotecas foram preparadas a partir de RNA de células-tronco embrionárias humanas, genes específicos foram pesquisados entre as bibliotecas. Quase todos esses genes foram identificados pelas bibliotecas feitas a partir de pelo menos 10 nanogramas de RNA total inicial, validando assim este protocolo. Ao realizar este protocolo, é importante lembrar-se de manipular as amostras de RNA de pequeno porte com extrema cautela para evitar degradação.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma compreensão muito boa de como preparar bibliotecas Illumina, leitura simples Mr.Aeq e bibliotecas Paradigm a partir de quantidades muito pequenas de material inicial.

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Biologia

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