Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

O objetivo geral do experimento a seguir é sintetizar nanopartículas de ouro estabilizadas com alquila, conhecidas como clusters protegidos por monocamada ou MPCs, e montar esses materiais em conjuntos de filmes finos que são usados como uma interface de absorção para eletroquímica de monocamada de proteína azarina. Isso é conseguido protegendo primeiro os colóides de ouro com ligantes orgânicos para criar nanopartículas de ouro cercadas por um filme de folato de alcano. Em seguida, os MPCs são ancorados em substratos de ouro e vidro e conectados em rede em filmes finos de várias camadas covalentemente ligados, cujo crescimento é rastreado por meio de medições ópticas e eletroquímicas, bem como microscopia transversal.

Em seguida, a proteína de transferência de elétrons azarina é absorvida na interface e a telemetria da abóbada cíclica é realizada para eletroquímica de monocamada de proteína. Os resultados mostram que as interfaces de filme MPC criadas por este procedimento permitem uma análise eletroquímica mais otimizada da proteína adsorvente com base no filme MPC, fornecendo uma interface de adsorção mais homogênea e cinética de transferência de elétrons rápida que não possui dependência de distância tradicional. A principal vantagem desta técnica sobre a eletroquímica tradicional de proteínas é que os eletrodos modificados quando os filmes de nanopartículas fornecem uma interface de absorção que resulta em um comportamento eletroquímico mais ideal medido por fotometria cíclica.

A demonstração visual desse método é crítica, pois a síntese inclui pistas visuais importantes, enquanto a construção e caracterização do filme envolve várias etapas intrincadas e técnicas analíticas. Os filmes NPC podem ser montados em eletrodos de ouro modificados ou lâminas de vidro usando um método de ciclo de imersão de camadas alternadas de MPC e moléculas de ligação de dilace. E, consequentemente, essas camadas podem ser rastreadas eletroquimicamente ou opticamente até a espessura de filme desejada.

Para sintetizar aglomerados de ouro sob uma capela com ventilação adequada, comece dissolvendo 1,1 gramas de tetraóxido de brometo de amônio em 30 mililitros de tolueno, dissolva 0,38 gramas de hidreto de borah de sódio em cerca de 20 mililitros de água ultrapurificada de 18 mega ohms e deixe esfriar no gelo por pelo menos 30 minutos. Em seguida, transfira quantitativamente uma solução de água tetracloroorating de hidrogênio para a solução de tolueno de brometo de amônio tetraide usando mais cinco mililitros de água ultrapurificada. Para transferir a solução aquosa de ouro para a solução não aquosa, tampe levemente e mexa rigorosamente por 30 minutos.

Portanto, as fases aquosa laranja queimada e não aquosa clara são bem misturadas. Transferir as fases aquosa clara e laranja queimada não aquosa para uma ampola de separação. Rejeitar a camada aquosa e transvasar a camada não aquosa para um balão limpo.

Adicionar C seis e uma proporção de dois para um à tetracloro de hidrogénio ou à taxa contendo a solução não aquosa. Mexa por 30 minutos para formar um polímero dourado, conforme detectado por uma mudança de cor de laranja avermelhado para uma solução amarela pálida, quase incolor. Transfira a mistura de reação para um banho de gelo isolado e leve à geladeira a zero graus Celsius por pelo menos 30 minutos mexendo quantitativamente e adicione rapidamente a solução gelada de borohidreto de sódio à mistura de reação para reduzir o ouro a um ouro metálico na presença de coxas.

Após a adição, formará instantaneamente uma solução preta espessa de aglomerados de ouro protegidos por monocamada ou MPCs. Agite a reação durante a noite a zero graus Celsius no dia seguinte. Transferir a mistura de reacção para uma ampola de separação.

Descarte a camada aquosa em um copo de resíduos e gire. Evaporar a camada de tolueno não aquosa até uma secura quase completa, deixando uma lama preta pesada no frasco. Precipitar os MPCs adicionando aceto nitrilo e deixar a solução descansar durante a noite usando uma frita de vidro de porosidade média com acessórios de borracha e um balão de pistola com um aspirador.

Colete MPCs por filtração a vácuo e enxágue com uma grande quantidade de aceto nitrila. Depois de montar a célula sanduíche eletroquimicamente, limpe o substrato de ouro realizando telemetria de vol cíclico ou CV nas janelas de potencial de 0,2 a 0,9 volts, 0,2 a 1,2 volts e 0,2 a 1,35 volts são 100 milivolts por segundo em uma solução de ácido sulfúrico 0,1 molar e cloreto de potássio 0,01 molar. Meça a corrente de carga de camada dupla do substrato de ouro nu limpo realizando CV em condições padrão, que inclui uma janela de potencial de 0,1 a 0,4 volts versus cloreto de prata escaneado a 100 milivolts por segundo em tampão fosfato de potássio ou KPB.

Descarte o tampão e enxágue duas vezes excessivamente com água ultrapurificada e etanol. Exponha o substrato de ouro limpo a cerca de 300 microlitros de solução de cinco milimolares C seis em etanol e deixe-o descansar durante a noite para formar um C seis Sam ordenado. Rejeitar a solução de C seis da célula e enxaguar duas vezes excessivamente com etanol e água ultrapurificada.

Meça a corrente de carga do SAM em condições padrão. Descarte o KPB e enxágue duas vezes excessivamente com água ultrapurificada e etanol. A corrente de carga deve ser acentuadamente reduzida.

A partir das medições de ouro nu, exponha o substrato de ouro modificado SAM a cerca de 300 microlitros de solução NDT de cinco milimoles em etanol e deixe-o descansar por uma hora para interdispersar as moléculas de ligação NDT dentro do C six Sam. Descarte a solução NDT e enxágue duas vezes excessiva e completamente com etanol e água ultrapurificada do que uma vez com diam metano. Exponha o substrato de ouro a uma solução MPC de metano DIAM com agitação, borbulhando-o lentamente com gás nitrogênio por uma hora.

Esta é a camada MPC de ancoragem do conjunto do filme. Rejeitar a solução de MPC e enxaguar novamente sucessivamente com água ultrapurificada de diclorometano e KPB. Meça a corrente de carga da camada MPC em condições padrão.

Descarte o KPB e enxágue excessivamente com água ultrapurificada e metano DIAM. Exponha o substrato de ouro a cerca de 300 microlitros de uma solução NDT de cinco milimolares em metano DIAM com agitação, borbulhando-o lentamente com gás nitrogênio por 20 minutos. Descarte o NDT e enxágue abundantemente com metano DIAM para depositar a segunda camada de MPC.

Mergulhe novamente o conjunto do filme na solução MPC de metano DIAM e deixe-o descansar com agitação, borbulhando-o lentamente com gás nitrogênio por uma hora de enxágue antes. Em seguida, meça a corrente de carga da camada MPC novamente em condições padrão e enxágue novamente usando o mesmo procedimento. Deposite camadas adicionais de MPC, se desejar.

Após a conclusão do filme MPC em rede, enxágue o substrato modificado com filme com KPB para absorver a proteína AZ no conjunto do filme MPC. Injete cerca de 150 microlitros de solução de AZ de cinco a 10 micromolares em KPB na célula sanduíche E chem e deixe descansar tampada e refrigerada por pelo menos uma hora. Depois que a célula ECM retornar à temperatura ambiente, enxágue-a bem com KPB, reabasteça a célula ECM com KPB e borbulhe o KPB com gás nitrogênio por 10 minutos.

Realize estudos eletroquímicos de monocamada, como CV na janela de potencial de menos 0,25 volts a 0,25 volts. Escaneado a 100 milivolts por segundo em KPB Enxágue uma lâmina de vidro modificada 3M PT MS com metano DIAM e coloque-a em uma solução MPC de metano DIAM por uma hora enquanto agita em um agitador em baixa velocidade. Isso completa a primeira camada MPC da montagem do filme, ancorando MPCs aos grupos finais de captan ME do sane.

Enxágue bem a lâmina com metano Dior, seque-a com gás nitrogênio e obtenha um espectro UV visível da lâmina Depois de mergulhar a lâmina em solução NDT em metano diam. Coloque a corrediça em solução MPC por uma hora enquanto agita em um agitador em baixa velocidade. Isso completa a segunda camada MPC da montagem do filme.

Enxágue bem a lâmina com metano DIAM, seque com gás nitrogênio e obtenha um espectro UV da lâmina. A absorbância em todo o espectro deve aumentar à medida que camadas adicionais de MPC são absorvidas pelo conjunto do filme. Para anexar um filme MPC montado em uma lâmina de vidro modificada 3M PT MS em uma lâmina de microscópio padrão.

Prepare a resina epóxi embed eight 12 e deixe-a engrossar por pelo menos 12 horas. Encha uma cápsula de feixe com resina epóxi e inverta-a em cima da amostra de filme MPC. Coloque pressão na cápsula para que uma bolha suba até o topo da cápsula, criando uma vedação entre a resina epóxi e a amostra de filme MPC.

Deixe-o polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 graus Celsius e, em seguida, resfrie as lâminas montadas até a temperatura ambiente. Aqueça as lâminas montadas por 20 segundos em uma placa quente de alumínio fundido a 200 graus Celsius para facilitar a remoção do bloco com o MPC anexado em filme rápido. Corte a amostra contendo o filme do bloco da cápsula do feixe usando uma serra de joalheiro para a parte removida em um molde plano de silicone com o lado do filme MPC voltado para o interior do silício.

Encha o poço de silício com resina epóxi em temperatura ambiente e deixe-o polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 graus Celsius. Em seguida, leve a amostra à temperatura ambiente. Corte seções de amostra finas de 60 a 80 nanômetros em um micrótomo Leica UCT ultra usando uma faca de diamante para cortar seções perpendiculares à borda da faca, coloque as seções fatiadas no filme de suporte de carbono VAR em grades de cobre de 400 mesh e tire imagens TEM de seções transversais dos conjuntos de filme MPC mostrados.

Aqui estão os resultados do monitoramento da corrente de carga de camada dupla do crescimento do filme MPC para um total de cinco ciclos de imersão envolvendo exposição alternada a soluções MPC e NDT. As correntes de carga aumentam sistematicamente a cada ciclo de imersão. Adicionando camadas de MPC ao filme.

Aqui está um típico Volta Graham cíclico para AZ adicionar absorção a um conjunto de filme MPC coletado usando uma janela potencial de menos 0,25 a mais 0,25 volts escaneado a 100 milivolts por segundo em tampão de fosfato de potássio 4,4 milimolar. Um monitoramento espectral UV vis representativo de um crescimento de filme MPC ligado a diol em uma lâmina de vidro modificada 3M PT MS é mostrado aqui. Um ciclo de imersão consiste na exposição da lâmina de vidro à solução de ligação NDT, seguida pela exposição à solução MPC.

Cada mergulho subsequente resulta em crescimento na espessura do filme e um aumento simultâneo da absorbância. Esta figura mostra uma análise de imagem transversal de microscopia eletrônica de transmissão de um conjunto de filme MPC ligado ao DIA. A inserção mostra uma imagem MET típica de MPCs funcionalizados com hexa metol usados na análise MET de montagem de filme.

Usando a Imagem J, determinou que o diâmetro médio do núcleo de ouro dos MPCs é de cerca de dois nanômetros. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como sintetizar, caracterizar e montar o par estreito dourado MPC de filmes que atuam como uma interface para a absorção e subsequente análise eletroquímica de proteínas redox. O processo de montagem do filme é facilmente adaptável manipulando o procedimento de síntese de MPC, bem como o mecanismo de ligação de partículas internas para acomodar a absorção de uma gama diversificada de proteínas.

Embora este método possa fornecer informações sobre a eletroquímica da absorção de proteínas para plataformas sintéticas modificadas, ele também pode ser aplicado ao desenvolvimento de sistemas de modelagem de transferência de elétrons, esquemas de biossensoriamento e materiais sintéticos biocompatíveis.