Síntese, Assembléia e Caracterização de monocamada Protected Films nanopartículas de ouro para Eletroquímica monocamada Protein

O objetivo geral do experimento a seguir é sintetizar nanopartículas de ouro estabilizadas com alquila, conhecidas como aglomerados protegidos por monocamada ou MPCs, e montar esses materiais em arranjos de filmes finos utilizados como interface de absorção para a eletroquímica de monocamadas de proteínas azarinas. Isso é alcançado primeiramente protegendo coloides de ouro com ligantes orgânicos para criar nanopartículas de ouro cercadas por um filme de alcanofolato. Em seguida, os MPCs são ancorados em substratos de ouro e vidro e conectados em filmes finos multicamadas ligados covalentemente, cujo crescimento é monitorado por meio de medidas ópticas e eletroquímicas, bem como por microscopia de seção transversal.

Em seguida, a proteína de transferência de elétrons azarina é absorvida na interface e é realizada a telemetria cíclica em filme para eletroquímica de monocamada proteica. Os resultados mostram que as interfaces de filme MPC criadas por este procedimento permitem uma análise eletroquímica mais otimizada da proteína adsorvida com base no filme MPC, fornecendo uma interface de adsorção mais homogênea e cinética rápida de transferência de elétrons que não apresenta dependência tradicional com a distância. A principal vantagem desta técnica em relação à eletroquímica proteica tradicional é que os eletrodos modificados com filmes de nanopartículas fornecem uma interface de absorção que resulta em um comportamento eletroquímico mais ideal, conforme medido pela voltametria cíclica.

A demonstração visual deste método é essencial, pois a síntese inclui importantes pistas visuais, enquanto a construção e caracterização do filme envolvem múltiplas etapas complexas e técnicas analíticas. Filmes de NPC podem ser montados sobre eletrodos de ouro modificados ou lâminas de vidro utilizando um método de imersão cíclica com camadas alternadas de MPC e moléculas de ligação bifuncional. Consequentemente, essas camadas podem ser monitoradas eletroquimicamente ou opticamente até a espessura desejada do filme.

Para sintetizar aglomerados de ouro em uma capela com ventilação adequada, comece dissolvendo 1,1 grama de brometo de tetraoctilamônio em 30 mililitros de tolueno e dissolva 0,38 gramas de borohidreto de sódio em cerca de 20 mililitros de água ultrapurificada de 18 megaohms, deixando esfriar em gelo por pelo menos 30 minutos. Em seguida, transfira quantitativamente uma solução aquosa de ácido tetracloroaurico para a solução de brometo de tetraoctilamônio em tolueno, utilizando cinco mililitros adicionais de água ultrapurificada. Para transferir a fase da solução aquosa de ouro para a solução não aquosa, tampe levemente e agite vigorosamente por 30 minutos.

Portanto, as fases aquosa de cor laranja-queimado e não aquosa transparente devem ser bem misturadas. Transfira ambas as fases — a aquosa transparente e a não aquosa de cor laranja-queimado — para um funil de separação. Descarte a camada aquosa e decante a camada não aquosa para um frasco limpo.

Adicione C seis e uma proporção de dois para um à solução não aquosa contendo hidrogênio tetraclororato. Agite por 30 minutos para formar um polímero de ouro um, conforme detectado por uma mudança de cor de laranja avermelhado para uma solução amarelo pálido, quase incolor. Transfira a mistura reacional para um banho de gelo isolado e resfrie até zero graus Celsius por pelo menos 30 minutos com agitação; adicione quantitativa e rapidamente a solução fria de borohidreto de sódio à mistura reacional para reduzir o ouro um a ouro metálico na presença de coxas.

Após a adição, formará instantaneamente uma solução espessa e preta de aglomerados de ouro protegidos por monocamada ou MPCs. Agite a reação durante a noite a zero grau Celsius no dia seguinte. Transfira a mistura reacional para um funil de separação.

Descarte a camada aquosa em um béquer de resíduos e rotavap. Evapore a camada de tolueno não aquosa até quase a secura total, deixando uma borra preta espessa no frasco. Precipite os MPCs adicionando acetonitrila e deixe a solução repousar durante a noite usando um funil de vidro de porosidade média com conexões de borracha e um frasco com braço lateral conectado a um aspirador.

Colete os SMPs por filtração a vácuo e enxágue com uma grande quantidade de acetonitrila. Após montar a célula tipo sanduíche eletroquimicamente, limpe o substrato de ouro realizando voltametria cíclica ou VC nas janelas de potencial de 0,2 a 0,9 volts, 0,2 a 1,2 volts e 0,2 a 1,35 volts a 100 milivolts por segundo em uma solução de ácido sulfúrico 0,1 molar e cloreto de potássio 0,01 molar. Meça a corrente de carga da camada dupla do substrato de ouro limpo e exposto realizando VC em condições padrão, que incluem uma janela de potencial de 0,1 a 0,4 volts versus cloreto de prata, varrida a 100 milivolts por segundo em tampão de fosfato de potássio ou KPB.

Descarte o tampão e lave duas vezes abundantemente com água ultra purificada e etanol. Exponha o substrato de ouro limpo a cerca de 300 microlitros de solução de C seis 5 milimolar em etanol e deixe repousar durante a noite para formar uma camada ordenada de C seis SAM. Descarte a solução de C seis da célula e lave-a duas vezes abundantemente com etanol e água ultra purificada.

Meça a corrente de carregamento da monocamada auto-organizada (SAM) em condições padrão. Descarte o KPB e lave duas vezes em excesso com água ultra purificada e etanol. A corrente de carregamento deve ser acentuadamente reduzida.

Em comparação com as medições do ouro puro, exponha o substrato de ouro modificado com SAM a cerca de 300 microlitros de uma solução de NDT cinco milimolar em etanol e deixe repousar por uma hora para dispersar intercaladamente as moléculas conectoras de NDT dentro do SAM de C seis. Descarte a solução de NDT e lave duas vezes abundantemente e completamente com etanol e água ultra purificada, seguido por uma lavagem com diam metano. Exponha o substrato de ouro a uma solução de MPC em diam metano com agitação, borbulhando lentamente gás nitrogênio por uma hora.

Esta é a camada MPC de ancoragem da montagem do filme. Descarte a solução de MPC e enxágue novamente sucessivamente com diclorometano, água ultra purificada e KPB. Meça a corrente de carregamento da camada de MPC em condições padrão.

Descarte o KPB e enxágue abundantemente com água ultra purificada e metano DIAM. Exponha o substrato de ouro a cerca de 300 microlitros de uma solução de NDT 5 milimolar em metano DIAM com agitação, borbulhando lentamente gás nitrogênio por 20 minutos. Descarte o NDT e enxágue cuidadosamente com metano DIAM para depositar a segunda camada de MPC.

Reimergir o conjunto do filme na solução de MPC de metano DIAM e deixar em repouso com agitação, borbulhando lentamente com gás nitrogênio por uma hora, antes das lavagens. Em seguida, medir novamente a corrente de carga da camada de MPC em condições padrão e lavar novamente usando o mesmo procedimento. Depositar camadas adicionais de MPC, se desejado.

Após a conclusão da película de MPC em rede, lave o substrato modificado com a película com tampão fosfato de potássio (KPB) para absorver a proteína AZ na montagem da película de MPC. Injete cerca de 150 microlitros de uma solução de AZ em KPB na concentração de cinco a 10 micromolar na célula eletroquímica tipo sanduíche e deixe repousar tampada e refrigerada por pelo menos uma hora. Após a célula ECM retornar à temperatura ambiente, lave-a completamente com KPB, reabasteça a célula ECM com KPB e borbulhe o KPB com gás nitrogênio por 10 minutos.

Realize estudos eletroquímicos em monocamada, como voltametria cíclica (CV), na janela de potencial de menos 0,25 volts a 0,25 volts. Varra a 100 milivolts por segundo em KPB. Lave o lâmina de vidro modificada com 3M PT MS com metano DIAM e coloque-a em uma solução MPC de metano DIAM por uma hora, sob agitação em agitador orbital em baixa velocidade. Isso completa a primeira camada MPC da montagem do filme, ancorando os MPCs aos grupos terminais ME captan do sane.

Lave completamente a lâmina com metano Dior, seque-a com gás nitrogênio e obtenha um espectro UV-vis da lâmina após imersão na solução NDT em metano diam. Coloque a lâmina na solução MPC por uma hora, agitando em um agitador a baixa velocidade. Isso conclui a segunda camada MPC da montagem do filme.

Enxágue completamente a lâmina com metano DIAM, seque com gás nitrogênio e registre um espectro UV-vis da lâmina. A absorbância ao longo do espectro deve aumentar à medida que camadas adicionais de MPC são absorvidas no conjunto do filme. Para fixar um filme de MPC montado em uma lâmina de vidro modificada com PT MS 3M em uma lâmina de microscópio padrão.

Prepare a resina epóxi Embed Eight 12 e deixe-a espessar por pelo menos 12 horas. Encha uma cápsula de feixe com a resina epóxi e vire-a sobre a amostra do filme MPC. Aplique pressão sobre a cápsula para que uma bolha suba até o topo da cápsula, criando um selo entre a resina epóxi e a amostra do filme MPC.

Deixe polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 graus Celsius e, em seguida, resfrie as lâminas montadas até a temperatura ambiente. Aqueça as lâminas montadas por 20 segundos em uma placa aquecedora de alumínio fundido a 200 graus Celsius para facilitar a remoção do bloco com o MPC aderido ao filme rápido. Corte a amostra contendo o filme do bloco da cápsula do feixe usando uma serra de ourives, e coloque a parte removida em um molde plano de silicone com o lado do filme MPC voltado para cima, de frente para o interior do silicone.

Encha o reservatório de silicone com resina epóxi à temperatura ambiente e deixe polimerizar por pelo menos 18 horas a 60 graus Celsius. Em seguida, retorne a amostra à temperatura ambiente. Corte seções finas de 60 a 80 nanômetros em um ultramicrótomo Leica UCT utilizando uma lâmina de diamante para cortar seções perpendiculares à borda da lâmina, coloque as seções cortadas em filme de suporte de carbono VAR sobre grades de cobre de 400 malhas e obtenha imagens de TEM de seções transversais das montagens de filme MPC, conforme mostrado.

Aqui estão os resultados do monitoramento da corrente de carga da dupla camada durante o crescimento do filme de MPC, realizado ao longo de um total de cinco ciclos de imersão envolvendo exposição alternada às soluções de MPC e NDT. As correntes de carga aumentam sistematicamente a cada ciclo de imersão. Adição de camadas de MPC ao filme.

Aqui está um ciclo típico de Volta Graham cíclico para adição de AZ em um filme de MPC montado, coletado usando uma janela de potencial de menos 0,25 a mais 0,25 volts, varrido a 100 milivolts por segundo em tampão de fosfato de potássio 4,4 milimolar. É apresentado aqui um monitoramento espectral UV-vis representativo do crescimento de um filme de MPC ligado a um diol sobre uma lâmina de vidro modificada com PT MS 3M. Um ciclo de imersão consiste na exposição da lâmina de vidro à solução do ligador NDT, seguida pela exposição à solução de MPC.

Cada imersão subsequente resulta em um aumento da espessura do filme e um aumento concomitante da absorbância. Esta figura mostra uma análise de imagem de microscopia eletrônica de transmissão em corte transversal de um conjunto de filme MPC ligado por DIA. A inserção mostra uma imagem típica de MET de MPCs funcionalizados com hexa metol utilizados na análise de conjunto de filme por MET.

Utilizando o ImageJ, determinou-se que o diâmetro médio do núcleo de ouro das MPCs é de cerca de dois nanômetros. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como sintetizar, caracterizar e montar filmes de pares estreitos de ouro de MPCs que atuam como uma interface para a absorção e subsequente análise eletroquímica de proteínas redox. O processo de montagem do filme é facilmente adaptável mediante a manipulação do procedimento de síntese das MPCs, bem como do mecanismo de ligação interparticulada, para acomodar a absorção de uma ampla variedade de proteínas.

Embora este método possa fornecer informações sobre a eletroquímica da absorção de proteínas em plataformas sintéticas modificadas, ele também pode ser aplicado ao desenvolvimento de sistemas de modelagem de transferência de elétrons, esquemas de biossensores e materiais sintéticos biocompatíveis.