Name: RNAi mediada knockdown do gene e In Vivo Ensaio diurese no Feminino Adulto Aedes aegypti Os mosquitos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Aprenda a realizar silenciamento gênico por RNAi e ensaio de diurese in vivo em fêmeas de Aedes aegypti. Este método permite estudar canais de água aquaporinas e funções de genes em mosquitos vetores.

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Os autores agradecem Victoria Carpenter por seus comentários críticos deste protocolo.

Parte I - RNAi mediada knockdown do gene na idade adulta do mosquito Aedes aegypti. Para visão geral experimento veja a Figura 1. 1. Síntese dsRNA <ol><li> Sintetizar dsRNAs específicas contra genes de dsRNAs de juros e controle. Nota: Sugerimos iniciadores em desenvolvimento para os fragmentos de PCR na gama de 300 a 500 pares de bases localizado na extremidade 3 'do cDNA específico 2 e com a sequência de iniciador de T7 ligado na extremidade 5' (5'-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3 '). Singularidade dos fragmentos deve ser confirmado por análise BLASTN 3. </li><li> Utilizar a Ambion Megascript T7 Kit de Transcrição de Alto Rendimento (Ambion, a tabela de reagentes) que utiliza-polimerase de T7 RNA para a reacção de transcrição para sintetizar ARNdc. Nota: Os reagentes semelhantes e kits estão disponíveis em outros lugares. </li><li> Para purificar ARNdc, precipitado com cloreto de lítio, seguindo as instruções com o kit de Megascript. </li><li> Depois purificatiónica, dissolver o sedimento ARNdc em água estéril. Para assegurar a viscosidade adequada para microinjecção, a concentração de ARNdc não deve exceder 2 ug / uL. </li></ol> 2. Preparação de injecção <ol><li> Um simples micro injector pode ser construído utilizando tubos, uma tesoura, uma agulha de metal, uma seringa de 1 ml, e uma 1 ml em plástico pipeta de ponta (ver Figura 2). O tubo deve ser cortado para ~ 40 cm de comprimento. Alternativamente, um injector automático de micro pode ser usado como Drummond Nanojet II 4. <ol><li> Cortar a ponta da seringa (cubo de agulha) em 2 ml marca escala e remover a cabeça do êmbolo de borracha a partir do êmbolo. </li><li> Faça um furo com uma agulha de metal na cabeça do êmbolo de borracha e coloque a cabeça do êmbolo de borracha de volta no centro da agulha. </li><li> Coloque o cubo da agulha em uma extremidade do tubo e colocar uma ponta de pipeta de 1 ml de plástico na outra extremidade, a qual será usada como a peça para a boca (alternativamente, um 10 ml syRinge pode ser usado para produzir a pressão de ar necessária para a injecção). </li></ol></li><li> Colocar uma agulha capilar de vidro, no furo na cabeça do êmbolo de borracha e quebrar a ponta da agulha fora de modo a largura é suficientemente grande para líquido a fluir através dele. Nota: O tamanho óptimo da ponta da agulha tem de ser determinada empiricamente -, se a largura da agulha é demasiado grande isso irá resultar em trauma e uma elevada taxa de mortalidade de mosquito, se a largura da agulha é muito pequeno, será impossível para penetrar o exoesqueleto de mosquito. </li><li> Submergir a agulha de injecção na amostra ARNdc preparada e extrair a amostra de líquido para dentro da agulha de injecção por sucção o líquido para cima com a peça de boca (ou uma seringa). Nota: Este passo é idêntico para todos os reagentes líquidos que são injectados nos mosquitos, incluindo tampão PBS, que é utilizado in vivo no protocolo de ensaio de diurese (ver abaixo). </li></ol> 3. Coletar e Anestesie mosquitos <ol><li> Coleçãomosquitos de t com um aspirador alimentado por bateria para um frasco de coleta. Coloque uma tampa sobre o frasco de coleta e coloque o frasco em uma almofada limpa CO 2 para anestesiar os mosquitos. Nota: Como alternativa os mosquitos podem ser anestesiados em gelo. </li></ol> 4. Injeção de Mosquito <ol><li> Abra o frasco de coleta e colocar os mosquitos diretamente no bloco de CO 2 e esperar até os mosquitos são anestesiados. </li><li> Descarte todos os homens. </li><li> Alinhar os mosquitos no lado para permitir um acesso mais fácil para injecção. </li><li> Agarre mosquitos pelas pernas ou asas para evitar ferimentos. Você também pode usar um pincel fino ou pena para manipular os mosquitos. </li><li> Quando pronto para injectar o mosquito em primeiro lugar, suavemente suportar um lado do tórax com a pinça e inserir a ponta da agulha para o outro lado do tórax (Figura 2). É melhor injetar uma porção fina da cutícula e evitar empurrar a agulha paraó profundo no tórax. </li><li> Uma vez que a agulha está no lugar, soprar o líquido para dentro do mosquito. A quantidade desejada pode ser determinada através da monitorização do menisco de líquido na agulha. O número de milímetros necessárias para um volume específico pode ser determinada por cálculo do volume do cilindro da agulha capilar de vidro (πr 2 h). A quantidade eficaz de ARNdc que é tipicamente usada para injecção é de 1 ug. </li><li> Uma vez que o líquido é injectado mosquito, cuidadosamente retrair a agulha. Se um formas líquidas grandes gotículas do lado de fora do tórax, o mosquito deve ser descartado. Em seguida, repita esse processo com o mosquito que vem. </li></ol> 5. Recuperação Mosquito e Armazenamento <ol><li> Após a injecção, colocar os mosquitos em um recipiente para armazenagem. Por exemplo, uma cera de forrado pint copos de papelão (copos de sopa) com malha de recobrimento protegido com a tampa de cartão. A tampa tem uma parte cortada para a malha que cobre a ser exposto. Uma vez que todo o mosquitoes são colocados no recipiente, colocar o recipiente numa câmara de ambiente controlado, após a incubação e fornecer os mosquitos com uma fonte de alimento, tal como 20% de sacarose bolas de algodão embebidas colocados em cima da cobertura de malha. Antes de realizar o ensaio in vivo de diurese, privar os mosquitos dsRNA com injeção de uma fonte de água por 12 horas para normalizar o estado de hidratação de cada mosquito. </li><li> A eficiência de ARNdc mediada knockdown do gene pode ser variável. Silenciamento gênico pode começar um dia após a injeção e pode durar até 6 dias após a injecção 4. O tempo ideal para atingir knockdown gene máxima tem de ser determinada empiricamente para cada gene utilizado. Geralmente, temos que esperar 3 dias após a injeção do dsRNA antes de prosseguir. </li></ol> Parte II - In vivo ensaio diurese em adulto do mosquito Aedes aegypti Nota: Este protocolo foi desenvolvido pelos autores eutilizado para RNAi mediada knockdown de proteínas Aquaporin no mosquito da febre amarela Aedes aegypti 1. Para evitar a variabilidade entre os mosquitos individuais, mosquitos devem ser analisadas em grupos. Por razões técnicas, recomendamos grupos de 5 mosquitos por tratamento - há uma quantidade limitada de tempo para realizar a medição de peso antes de mosquitos começam a excretar urina após a injeção. 6. Coletar e Anestesie mosquitos <ol><li> Antes da coleta dos mosquitos, registrar o peso de um frasco coleção vazia com uma tampa com uma balança de precisão analítica. Este frasco vai ser utilizado para todas as medições subsequentes. </li><li> Collect 5 mosquitos fêmeas para dentro do frasco de recolha pesados ​​com um aspirador. Coloque a tampa sobre o frasco de coleta e deixá-lo sentar-se no bloco de CO 2 por alguns segundos para anestesiar os mosquitos. </li></ol> 7. Pesagem inicial <ol><li> Tome tele medição de peso inicial dos 5 mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão. </li><li> Calcular o peso do grupo de 5 mosquitos, tendo o peso dos mosquitos e do frasco com tampa de recolha e subtraindo o peso do frasco de recolha vazio com tampa. </li><li> Abrir o frasco de recolha e colocar os mosquitos directamente sobre a almofada de 2 CO após a gravação do peso dos mosquitos. Se os mosquitos estão começando a acordar durante as medições de peso, definir o frasco no bloco de CO 2 por alguns segundos antes de abri-lo e colocar os mosquitos no teclado. </li></ol> 8. Preparação de injecção <ol><li> Configure o injector micro seguindo as instruções dadas no protocolo knockdown RNAi mediada por gene. </li><li> Colocar uma agulha capilar de vidro, no injector micro e quebrar a ponta da agulha fora de modo a largura é suficientemente grande para liquid para fluir. </li><li> Agulha submergir o em tampão PBS e desenhar o tampão para dentro da agulha de injecção, a quantidade desejada a utilizar para este protocolo é de 1,25 ul de PBS para cada mosquito. Nota: Este montante imita a quantidade média de plasma sanguíneo que é absorvido por um mosquito fêmea 5. </li></ol> 9. Injeção de Mosquito <ol><li> Alinhe-se os mosquitos para permitir um acesso mais fácil com o injector micro. </li><li> Uma vez que a agulha está no lugar, fundir tampão PBS para o mosquito. </li><li> Uma vez que o líquido é injectado no mosquito, uma gotícula pode formar no lado de fora do tórax. Este gotícula tem de ser cuidadosamente removido antes do passo seguinte. </li><li> Repita este processo de injeção com o mosquito que vem. Com a experiência, a taxa de sobrevivência do mosquito será quase 100% após a injeção. </li></ol> 10. Os mosquitos de pesagem <ol><li> Após a injeção, coloque delicadamente os mosquitos no vidro de coletae cap. Fazer a medição de peso primeiro dos 5 mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão. </li><li> Calcular o peso do grupo de 5 mosquitos, tendo o peso dos mosquitos e do frasco com tampa de recolha e subtrair o peso do frasco de recolha vazio com tampa. Nota: os mosquitos começam a excretar urina dentro de 2 minutos após a remoção do bloco de anestesia CO 2, por isso é importante para fazer a medição de peso antes de começar a excretar. </li><li> Coloque mosquitos em um pequeno recipiente onde eles começarão a excretar urina. </li></ol> 11. Segundo e subsequentes medidas de peso Nota: As medidas de peso dos mosquitos devem ser tomadas em intervalos de 30 minutos, mas este pode ser ajustado para intervalos mais curtos ou mais longos, dependendo taxas de excreção. <ol><li> Após 30 minutos, recolher o group de 5 mosquitos com um aspirador para o frasco mesma coleção com tampa. Fazer a medição de peso próximo dos mosquitos, colocando o frasco de recolha contendo os mosquitos, com a tampa sobre a balança de precisão. </li><li> Após a medição, colocar os mosquitos no recipiente mesma exploração para os próximos 30 minutos. </li><li> Repetir este processo para um período de tempo desejado. </li></ol> 12. Taxa de excreção de determinar Mosquito <ol><li> A quantidade total de líquido que foi injectado no grupo de 5 mosquitos pode ser calculado subtraindo o peso inicial dos mosquitos a partir do peso imediatamente após a injecção. </li><li> A quantidade de urina, que foi excretada pelo grupo de mosquitos em um ponto de tempo específico pode ser calculado subtraindo o peso inicial dos mosquitos a partir do peso dos mosquitos no ponto de tempo específico. </li><li> A taxa de excreção, num ponto de tempo específico pode ser calculado por diviDing a quantidade de urina excretada, neste ponto do tempo pela quantidade total de líquido injectado (Tabela 1). </li></ol> 13. Os resultados representativos RNAi mediada knockdown do gene e in vivo ensaio diurese têm sido utilizados pelo laboratório Hansen para estudar os efeitos de aquaporinas em Aedes aegypti diurese mosquito. Três aquaporinas que são expressas em Aedes aegypti Malpighian túbulos foram derrubados com efeitos significativos sobre a taxas de excreção comparados para controlar mosquitos 1. A Figura 4 mostra resultados representativos de uma experiência em que o ensaio de diurese foi utilizado para comparar taxas de excreção entre Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus a temperaturas diferentes. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Fluxograma do ensaio RNAi / diurese. 5 grupos de 10 mosquitos each são injectados com ARNdc de um gene específico e de outros cinco grupos de dez mosquitos são injectados com o controle de ARNdc. Outro grupo de mosquitos injectados com 200 uM HgCl 2 em PBS é usado como um controlo positivo. Estes mosquitos são pesados ​​antes da injecção, e após a injecção, em trinta minutos de intervalo durante 3 horas. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Um dispositivo de injeção simples micro para o knockdown do gene RNAi mediada e ensaio in vivo de diurese. A. As agulhas capilares de vidro utilizado para injecção. O triângulo cinza representa os incrementos de milímetro desenhadas na agulha para indicar a quantidade de líquido injectado no mosquito. B. 1 seringa ml usado para construir o injector micro. O triângulo branco representa o cubo da agulha e do triângulo preto representa a cabeça do êmbolo de borracha ligado ao êmbolo na seringa. C. O tubo usado para prender o porta-voz parao injector. D. 1 ml ponta de pipeta descartável (ponta azul), que é utilizado como o bocal do dispositivo de microinjecção. E. O dispositivo microinjeção que incorpora partes AD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3479/3479fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver maior figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 3"> Figura 3. Local da injecção óptima do mosquito. A. Fêmea Aedes aegypti injectados com uma agulha capilar de vidro entre as escalas grandes no tórax. A barra preta indica 1 mm para comparação de tamanho. B. Um desenho do tórax mosquito fêmea e as manchas brancas representam as escamas brancas no exoesqueleto de mosquito. A agulha de injeção deve furar o mosquito entre os pontos para minimizar a taxa de mortalidade durante a injeção. <img src="/files/ftp_upload/3479/3479fig4.jpg" alt="Figura 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Figura 4"> Figura 4. Efeitos da temperaturasas de Culex quinquefasciatus e diurese Aedes aegypti. O ensaio de diurese foi realizada com duas espécies de mosquitos, Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus, a temperaturas diferentes. A taxa de excreção durante a primeira hora após a injecção é dada em percentagem. <table border="1"><tbody><tr><td> Grupo </td><td> TARA (G) </td><td> não injectada (G) </td><td> após a injecção (G) </td><td> 1h após a injecção (G) </td><td> peso médio (mg) </td><td> quantidade injectada (Ul) </td><td> quantidade excretada (Ul) </td><td> % Excretado </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 7,5938 </td><td> 7,6057 </td><td> 7,6104 </td><td> 7,6096 </td><td> 2,38 </td><td> 0,94 </td><td> 0,16 </td><td> 17,0 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7,8252 </td><td> 7,8349 </td><td> 7,8415 </td><td> 7,8403 </td><td> 1,94 </td><td> 1,32 </td><td> 0,24 </td><td> 18,2 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 7,8896 </td><td> 7,9026 </td><td> 7,9077 </td><td> 7,906 </td><td> 2,6 </td><td> 1,02 </td><td> 0,34 </td><td> 33,3 </td></tr></tbody></table> Tabela 1. Aedes aegypti em resultados do ensaio in vivo diurese. Dados brutos de ensaio in vivo de diurese realizada com Aedes aegypti fêmea mosquitos a 4 ° C.

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<li>Beyenbach, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+mechanisms+of+diuresis+in+Malpighian+tubules+of+insects%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Transport mechanisms of diuresis in Malpighian tubules of insects.</a> J. Exp. Biol. 206 (Pt 21), 3845-3856 (2003).</li>
<li>Coast, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+recording+of+excretory+water+loss+from+Musca+domestica+using+a+flow-through+humidity+meter%3A+hormonal+control+of+diuresis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+insect+physiology%22%5BJournal%5D)">Continuous recording of excretory water loss from Musca domestica using a flow-through humidity meter: hormonal control of diuresis.</a> Journal of insect physiology. 50, 455-468 (2004).</li>
<li>Kersch, C. N., Pietrantonio, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+Aedes+aegypti+%28L.%29+leucokinin+receptor+is+critical+for+in+vivo+fluid+excretion+post+blood+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+letters%22%5BJournal%5D)">Mosquito Aedes aegypti (L.) leucokinin receptor is critical for in vivo fluid excretion post blood feeding.</a> FEBS letters. 585, 3507-3512 (2011).</li>
<li>Hays, A. R., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+protein+produced+by+the+vitellogenic+fat+body+and+accumulated+in+mosquito+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Genes+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">A novel protein produced by the vitellogenic fat body and accumulated in mosquito oocytes.</a> Development Genes and Evolution. 199, 114-121 (1990).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

O protocolo utilizado RNAi foi desenvolvido no laboratório de Alexander Raikhel da Universidade da Califórnia Riverside 6,7 e é semelhante a um protocolo publicado por Garver e Dimopoulos 4. A abordagem experimental mostrado neste protocolo de vídeo pode ser usado para estudar os genes envolvidos na diurese de insectos em uma configuração em in vivo. Os órgãos excretores dos insetos, os túbulos de Malpighi, têm atraído o interesse de gerações de pesquisadores como um sistema modelo &quot;s...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente ou equipamento </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> MEGAscript T7 Kit de Alto Rendimento </td><td> Ambion, Inc. </td><td> AM1334 </td><td></td></tr><tr><td> Tampão PBS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de plástico </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td> PVC </td></tr><tr><td> 1 ml de plástico pipeta </td><td> VWR </td><td> 83007-376 </td><td> Azul ponta </td></tr><tr><td> 1 ml da seringa </td><td> Becton, Dickinson and Company </td><td> 309602 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agulha de metal </td><td> Carolina Biologicals </td><td> 654307 </td&gt; <td> Tamanho 5 </td></tr><tr><td> Fly pad </td><td> Genesee Científico </td><td> 789060 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentado por bateria aspirador frasco w / coleção </td><td> UPMA Labs </td><td> IPMM 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Belas pinça de ponta </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 14095 </td><td></td></tr><tr><td> Agulhas capilares de vidro </td><td> Instrumentos de precisão do mundo </td><td> 1B200-6 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio de dissecção Stereo </td><td> Leica Microsystems </td><td> S6D </td><td></td></tr><tr><td> Balança de precisão analítica </td><td> Mettler Toledo </td><td> AB54S </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84097 </td><td></td></tr><tr><td> Um litro encerado copos de papelão forradas </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td> Fabricados copos de sopa </td></tr><tr><td> Rede de malha </td><td> Fornecedor local </td><td></td><td> gaze mosca plástico </td></tr></tbody></table>

rnai mediada knockdown do gene e<em&gt; in vivo</em&gt; ensaio diurese no feminino adulto<em&gt; aedes aegypti</em&gt; os mosquitos

RNAi-mediated Gene Knockdown and In Vivo Diuresis Assay in Adult Female Aedes aegypti Mosquitoes

Este protocolo vídeo demonstra uma técnica eficaz para knockdown um determinado gene em um inseto e realizar um bioensaio romance para medir a taxa de excreção. Este método pode ser usado para obter uma melhor compreensão do processo de diurese em insectos e é especialmente útil no estudo da diurese no sangue de alimentação-artrópodes que são capazes de assumir uma grande quantidade de líquido em uma farinha de sangue única. Este gene knockdown RNAi mediada combinado com um ensaio in vivo de diurese foi desenvolvido pelo laboratório Hansen para estudar os efeitos de RNAi mediada knockdown de genes Aquaporin sobre Aedes aegypti diurese mosquito 1. O protocolo é configurado em duas partes: a primeira demonstração ilustra como a construção de um dispositivo de injeção simples mosquito e como preparar e injetar dsRNA para o tórax de mosquitos para RNAi mediada knockdown do gene. A demonstração segundo ilustra como determinartaxas de excreção em mosquitos usando um bioensaio in vivo.

Neste protocolo combinamos RNAi mediada silenciamento de genes com um<em&gt; In vivo</em&gt; Ensaio diurese para estudar a knockdown efeitos dos genes de interesse tem sobre a excreção de fluido do mosquito.

RNAi mediada knockdown do gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio diurese no Feminino Adulto<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Os mosquitos

Este protocolo em vídeo demonstra uma técnica eficaz para realizar o knockdown de um gene específico em um inseto e conduzir um novo bioensaio para medir a excreção...

Este protocolo em vídeo demonstra uma técnica eficaz para silenciar um gene específico em um inseto e realizar um bioensaio inovador para medir a taxa de excreção. A técnica que vamos demonstrar hoje combina o silenciamento gênico mediado por RNAi com um ensaio de diurese in vivo. Pode ser utilizada para estudar a diurese em diferentes espécies de insetos, e foi desenvolvida especificamente para investigar a função dos canais de água aquaporinas em duas espécies diferentes de mosquitos.O protocolo que demonstrarei hoje está organizado em duas partes. A primeira demonstração ilustra como construir um dispositivo simples para injeção em mosquitos e como preparar e injetar RNA de fita dupla no tórax de mosquitos para silenciamento gênico mediado por RNA. A segunda demonstração mostra como medir as taxas de excreção em mosquitos utilizando um bioensaio in vivo como primeira etapa para realizar o silenciamento gênico mediado por RNAi; neste procedimento, são sintetizados RNAs de fita dupla específicos contra genes de interesse e RNAs de fita dupla controlados. Equipamentos e materiais adicionais necessários incluem um aspirador com frasco de coleta para a captura de mosquitos.Pinzas de ponta fina, placa para moscas com conexão a um cilindro de gás CO₂, etanol para limpar a placa, microscópio estereoscópico com fonte de luz, puxador de agulhas, se necessário. Agulhas de capilar de vidro com marcações de um milímetro, um microinjetor para injetar mosquitos, um recipiente para acomodar os mosquitos após a injeção e uma fonte alimentar para os mosquitos após a injeção, como solução de sacarose a 20%, bola de algodão embebida em água ou passas embebidas em água. Um microinjetor simples pode ser construído utilizando uma tesoura.Uma agulha de metal, uma capilar de vidro, uma seringa de um mililitro, uma ponteira plástica de pipeta de um mililitro e tubo cortado com cerca de 40 centímetros de comprimento. A extremidade do alojamento da agulha da seringa é cortada na marca de escala de 0,2 mililitro e a extremidade de borracha do êmbolo é removida. Uma agulha de metal é usada para furar um orifício na extremidade do êmbolo.Um capilar de vidro é colocado no orifício e a ponteira é recolocada na seringa. A ponta da seringa é então inserida em uma das extremidades do tubo e uma ponteira plástica de pipeta de um mililitro é colocada na outra extremidade. Isso será usado como bocal.Alternativamente, uma seringa de 10 mililitros pode ser usada para produzir a pressão de ar necessária para a injeção. Em seguida, coloque uma agulha de capilar de vidro no orifício da cabeça do êmbolo de borracha e quebre a ponta da agulha para que a largura seja suficientemente grande para permitir a passagem do líquido. Mergulhe a agulha de injeção na amostra de D-S-R-N-A preparada e aspire a amostra líquida para dentro da agulha de injeção sugando o líquido com um bocal ou uma seringa.Colete os mosquitos com um aspirador acionado por bateria em um frasco de coleta. Coloque uma tampa no frasco e posicione-o sobre uma placa de CO₂ limpa para anestesiar os mosquitos. Alternativamente, os mosquitos podem ser anestesiados em gelo.Descarte todos os machos antes de iniciar o processo de injeção. Eles podem ser manipulados na placa de CO2 utilizando uma pena ou pincel. Segure os mosquitos pelas pernas ou asas com pinça para evitar lesões.Quando estiver pronto para injetar o primeiro mosquito, apoie suavemente um lado do tórax com a pinça, inserindo a ponta da agulha no outro lado do tórax. É preferível injetar em uma porção fina da cutícula e evitar empurrar a agulha muito profundamente no tórax. Uma vez que a agulha esteja posicionada, sopre o líquido para dentro do mosquito.Fita dupla. O RNA se dispersa no hemolinfa e é absorvido pelas células, desencadeando uma inibição mediada por RNA de interferência dos genes-alvo. Após a injeção, os mosquitos são colocados em um recipiente para armazenamento.Por exemplo, uma linha de cera de um pinto, copo de papelão com cobertura em malha fixada com tampa de papelão. Após todos os mosquitos serem colocados no recipiente, este deve ser colocado em uma câmara com ambiente controlado para incubação, e os mosquitos também devem receber uma fonte alimentar, como sacarose a 20%, sabão e bolas de algodão colocadas sobre a cobertura em malha por gerações. A diurese em insetos atrai pesquisadores como um sistema modelo simples para estudo nos dias atuais.Técnicas como RNAi podem ser usadas para estudar a diurese em nível molecular. As técnicas demonstradas neste vídeo devem fornecer uma maneira simples de estudar a diurese in vivo. Mosquitos fêmeas começam a excretar urina dentro de dois minutos após a injeção com tampão PBS, portanto é importante realizar as medições de peso antes que eles comecem a excretar.Para a segunda parte deste protocolo, demonstrarei como realizar um ensaio de diurese in vivo em mosquitos Jedi. Materiais e equipamentos adicionais que não foram necessários no protocolo de derrubamento, mas que serão necessários neste protocolo, são solução tampão RPBS e uma balança analítica de precisão para realizar medidas de peso; a balança deve ser capaz de precisão de um décimo de miligrama. Antes da coleta dos mosquitos, registre o peso de um frasco de coleta vazio com tampa utilizando a balança analítica de precisão. Este frasco será usado para todas as medições subsequentes.Meça o peso inicial de cinco fêmeas colocando o frasco contendo os mosquitos, com a tampa, na balança de precisão. Após anestesiar cinco mosquitos fêmeas, você deve alinhá-los sobre a placa de CO₂ para facilitar o acesso com a microinjetora. Quando a agulha for inserida no tórax, você injetará o tampão PBS no mosquito.Após a injeção, coloque cuidadosamente os mosquitos no frasco de coleta e tampe-o. Realize a primeira medição de peso dos cinco mosquitos injetados colocando o frasco de coleta de campo com tampa na balança de precisão. O peso do grupo de cinco mosquitos pode ser calculado tomando-se o peso do frasco de coleta de campo com tampa e subtraindo o peso do frasco de coleta vazio com tampa.As medições do mosquito devem ser realizadas em intervalos de 30 minutos, mas isso pode ser ajustado para intervalos mais curtos ou mais longos, dependendo das taxas de excreção. Após 30 minutos, colete o grupo de cinco mosquitos com um aspirador no mesmo frasco de coleta com tampa. Em seguida, realize a próxima medição de peso colocando o frasco de coleta de campo com tampa na balança de precisão.O ensaio de diurese foi realizado em diferentes temperaturas utilizando duas espécies de mosquito ADA aegypti e kyx kti. A taxa de excreção durante a primeira hora após a injeção é expressa em porcentagem. O gráfico mostra um acentuado aumento da diurese à medida que a temperatura aumenta.Também observamos uma diferença nas taxas de excreção entre as duas espécies de mosquitos. Há uma ampla gama de aplicações futuras para o ensaio de diurese in vivo apresentado aqui. Além dos métodos de genética reversa, como RNAi, ele pode ser utilizado para estudar os efeitos de fármacos sobre a diurese em insetos, por exemplo, inibidores da transdução de sinal, entre outros.É também um ensaio poderoso para estudar o processo de eliminação de xeno-bióticos na instância-alvo.

rnai-mediated-gene-knockdown-vivo-diuresis-assay-adult-female-aedes

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório de James para injetar dsRNA em fêmeas de mosquitos A. aegypti, que abrigam o vírus da dengue. A técnica para a calibração de agulhas de injeção, manipulando a configuração da injeção, e injetando dsRNA no tórax é ilustrado.

Injeção de dsRNA em Mosquitos Feminino A. aegypti

Reversa abordagens genéticas têm-se revelado extremamente útil para determinar quais genes de resistência a patógenos underly vetor em mosquitos. Este protocolo de vídeo ilustra um método utilizado pelo laboratório Dimopoulos para injetar dsRNA em mosquitos Anopheles gambiae, que abrigam o parasita da malária. A técnica de manipular a configuração da injeção e injetar dsRNA no tórax é ilustrado.

Protocolo para Ensaios RNAi em mosquitos adultos (A. gambiae)

RNA-Seq as análises estão se tornando cada vez mais importantes para identificar os fundamentos moleculares de características adaptativas em organismos não modelo. Aqui, um protocolo para identificar genes diferencialmente expressos entre mosquitos Aedes albopictus diapausados e não diapausados é descrito, desde a criação de mosquitos até o sequenciamento de RNA e análises de bioinformática de dados de RNA-Seq.

Uma Experimental e Bioinformática Protocolo de Análises de RNA-seq de fotoperiódicas diapausa no Tigre Asiático Mosquito, Aedes albopictus

Aqui, descrevemos um processo para a inibição da função do gene em vectores mosquitos doença através do uso de quitosano / interferindo nanopartículas de RNA que são ingeridos pelas larvas.

A quitosana / RNA de interferência Nanoparticle Mediated silenciamento gênico na Doença Vector Mosquito Larvas

A interferência de RNA (RNAi) é uma ferramenta extremamente valiosa para descobrir a função do gene. No entanto, a capacidade de direcionar genes usando RNAi durante os estágios pré-adultos é limitada no principal vetor da malária humana, Anopheles gambiae. Descrevemos um protocolo de RNAi para reduzir a função do gene por meio de injeção direta durante o desenvolvimento da pupa.

RNAi gatilho para o interior<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; As pupas

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle, Dermestes maculatus

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Uso de um Mosquito recombinante Densovirus como um vetor de entrega do Gene para a análise funcional de Genes em larvas do Mosquito

Este protocolo descreve uma metodologia de microinjeção que temos padronizado e utilizado por vários anos para entregar quantidades específicas de ácidos nucleicos diretamente a hemolinfa de mosquitos e moscas domésticas. Este protocolo resulta em mortalidade de injeção mínima e permite medições de dose correlacionado de fecundidade.

Reprodutível dsRNA Microinjection e Bioassay de oviposição em mosquitos e moscas domésticas

Fornecemos um protocolo detalhado para a interferência mediada por eletroporação no RNA em insetos da ordem Odonata (libélulas e damselflies) usando a damselfly de cauda azul(Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) e a libélula de skimmer pied(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Método de interferência de RNA mediado por eletroporação em Odonata

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Administração eficaz de interferência oral de RNA (RNAi) para mosquitos anofeeles gâmbias adultos

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RNAi mediada knockdown do gene e

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