Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

O perfil do microbioma é o primeiro passo para definir o papel do microbioma na saúde e na doença. Aqui, estamos descrevendo um procedimento simples para isolar o DNA bacteriano de alta qualidade da biblioteca de preparação de amostras fecais, realizando rna 16SR e uma análise de dados meta genômicos e microbiomas. Este protocolo ajudará pesquisadores novos no campo do microbioma, bem como pesquisadores que trabalham no campo do microbioma no estabelecimento do gasoduto de microbioma em seu laboratório. Este protocolo pode ser estendido para o perfil do microbioma de outros biobiomas, como amostras nasais, orais ou de pele de indivíduos animais e humanos. A colheita de contas é o passo mais importante, pois todos os passos a jusante dependem de DNA de alta qualidade. A vedação adequada da placa de preservação é importante, pois a vedação incompleta pode levar ao oprimimento do produto amplificado, resultando em dados de sequenciamento de baixa qualidade. Para começar, esterilize as caixas divisoras com 70% de etanol. Coloque os ratos em caixas de divisor esterilizadas e deixe-os defecar normalmente por até uma hora. Use fórceps estéreis para coletar as pelotas fecais em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro vazio pré-rotulado. Inclua o tubo com segurança. Esterilize os fórceps com 70% de etanol, seguido de um extrato germicidal descartável, após a coleta de fecal de cada rato. Pesar 200 miligramas de pelotas fecais em um tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitro, com contas de vidro de 0,1 mililitro, e colocar o tubo de contas em um homogeneizador de contas e homogeneizar as amostras por 45 segundos à temperatura ambiente, a uma velocidade de 4,5 metros por segundo. Extrair DNA de acordo com as instruções do fabricante do kit e DNA elute em um tubo de micro centrífugas de 1,5 mililitro. Depois de isolar o DNA, quantifique o DNA isolado carregando 1 microliter do DNA em um fluorômetro. Configuração 16S repartição do gene RNA PCR1 em uma placa PCR de 96-Well, usando um volume de reação de 25 microliter. Usando uma pipeta multicanal, adicione 40 nano gramas de DNA, 13,5 micro litros de mistura de enzimas de polimerase de alta fidelidade 2X, contendo tampão, além de DNTPs no primer dianteiro e reverso. Sele a placa PCR corretamente da parte superior até a parte inferior ao longo de todas as quatro bordas. E centrífuga a 1000 vezes G em 20