Isolamento e cultivo de células da crista neural do tubo neural embrionário murino

Isolamento de crista neural embrionário a partir do tubo neural facilita o uso de

Reserve três horas para conduzir este protocolo. Uma vez que você tenha experiência, este protocolo deve levar entre uma hora e meia e duas horas para ser concluído, dependendo do número de embriões dissecados. Este protocolo descreve como tirar um embrião de 9,5 dias após o corte do córtex no código da placa ótica média e pode quatro para isolar o tecido contendo o tubo neural vagal. Corte.

Com isso, os ácaros 16 e 22 isolarão o tecido que contém o tubo neural do tronco. A crista neural vagal migra do tubo neural vagal. Enquanto a crista neural do tronco migra do tubo neural do tronco, o tecido dissecado será digerido enzimaticamente em uma solução de dis colagenase, lavada no espaço e a epiderme e o mesoderma não neurais serão dissecados.

O tubo neural isolado será lavado mais duas vezes e depois banhado em meio auto-renovado. Eu sou Elise Graph, do Laboratório Bosky da Universidade Vanderbilt. Hoje estarei demonstrando como isolar a crista neural do tubo neural na cultura explan.

Esta técnica permitirá que você estude as características da crista neural In vitro. Vamos começar. Comece diluindo 100 microlitros de um mg por mil fibronectina em 3,2 mililitros de DPBS estéril.

Coloque o suficiente da solução de fibronectina de 30 microgramas por mililitro para cobrir o fundo de cada poço de uma placa de quatro poços. Bata suavemente nos cantos da placa de quatro poços para garantir que todos os poços sejam cobertos uniformemente. Deixe a placa de lado enquanto você faz e filtra sua mídia.

O prato deve descansar por pelo menos 15 minutos. Colete os seguintes reagentes Para preparar sua mídia. Os meios são feitos em um armário de biossegurança antes do uso.

Certifique-se de usar a técnica estéril em todos os momentos. Retire o nin de fibra do prato de quatro poços e deixe secar com a tampa na parte de trás do capô. Demora cerca de 15 minutos para o nin de fibra secar.

Quando a placa estiver seca, adicione 500 microlitros de meio auto-renovado a cada uma. Bem, coloque a placa de 37 graus em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono imediatamente antes de iniciar a dissecção misture 50 microlitros de espaço do disco de colagenase em cinco mililitros de DPBS. Certifique-se de adicionar toda a colagenase dispa para garantir uma digestão eficiente.

Use um filtro de seringa de 0,2 mícron para filtrar a solução de colagenase dispa em três poços de uma placa de 12 poços. Cada poço deve receber um terço da pipeta de solução de cinco mililitros aproximadamente um mililitro de meio de lavagem em cada um dos poços restantes. Coloque o prato no gelo até que esteja pronto para digerir o tecido isolado.

Em seguida, corte a ponta de uma ponta de pipeta P 20 logo abaixo da borda chanfrada com uma lâmina de barbear estéril. Mergulhe a ponta em meio de lavagem para embriões e pedaços de tecido isolado. Não grude nas pontas enquanto estiver sendo transferido entre as soluções.

Faça o mesmo com a ponta de um P 1000 de um acoplamento cronometrado. Remova o útero da barragem. Complete a dissecção em DPBS estéril.

Esterilize suas ferramentas de dissecação usando qualquer método, como esterilização por calor. Se a DPBS ficar turva, mova o embrião com o corte P 1000 para um novo prato de DPBS estéril começando no tecido cortado. Gentilmente, afaste o tecido uterino da decídua.

Em seguida, remova suavemente o embrião de dentro da decídua. A localização do embrião é indicada aqui com um desenho animado. Depois de isolar um embrião 9,5 dias após o coum, remova suavemente o saco vitelino com agulhas de insulina.

Se a genotipagem for uma parte necessária do seu protocolo, lave o saco vitelino e qualquer tecido embrionário restante em DPBS limpo e estéril. Coloque o tecido em um tubo de 1,5 mililitro e armazene o tubo a 80 graus Celsius negativos até que esteja pronto para isolar o DNA. Oriente-se para a anatomia do embrião.

Você estará cortando no código PLA OTIC médio em SOMITES quatro 16 e 22. Você precisará ajustar o foco do seu microscópio para contar os somitos. Faça o primeiro corte no código PLA ótico médio.

Use as agulhas como as lâminas de uma tesoura sem danificar o resto do tubo neural. Faça o segundo corte depois do ácaro quatro. Em seguida, corte para o ácaro 15 e corte imediatamente depois.

Faça o corte final Depois de tão ácaro 22 ou o último, então ácaro. Se o embrião tiver desenvolvimento mais cedo. Este tecido contém o tubo neural do tronco para isolar o tecido que contém o tubo neural vagal.

Corte o coração do tecido entre o platô ótico médio e o quarto ácaro. Observe a diferença de tamanho entre os pedaços de tecido isolado. A peça que contém o tubo neural vagal é mais larga que a outra.

Essa distinção física permite que você processe as duas peças juntas. Use o ponto de corte P 20 para transferir o tubo neural para o espaço de colagenase. O tecido restante pode ser mantido para genotipagem.

Como dito anteriormente, coloque os pedaços de tecido isolado em um dos poços com colagenase dis space. Agora em temperatura ambiente. Deixe descansar por 10 minutos.

Durante a incubação de 10 minutos, você pode começar a dissecar o próximo embrião. Após 10 minutos, remova o tecido isolado do espaço de colagenase e lave pipetando para cima e para baixo em meio de lavagem, coloque o tecido digerido em DPBS. É assim que o tecido deve ficar após a digestão.

O próximo passo envolve a remoção da derme não neural e do mesoderma. Primeiro, a derme não neural é afastada do tubo neural. Em seguida, o mesoderma pode ser removido do tubo neural.

Para demonstrar a remoção da derme não neural e do mesoderma, vamos nos concentrar no tubo neural vagal. O mesmo processo pode ser feito com o tubo neural do tronco. Comece segurando o tecido não neural com uma agulha.

Use o outro para remover suavemente a derme não neural. Em seguida, remova suavemente os somitos adjacentes ao tubo neural para remover os restos de qualquer tecido não neural. Itere suavemente com a ponta da pipeta P 20 cortada.

Lave o tubo neural duas vezes com meio de lavagem. Coloque o tubo neural em um meio de auto-renovação e, em seguida, coloque em um quatro preparado. Bem prato.

Coloque a placa de quatro poços em uma câmara de hipóxia. Certifique-se de que a câmara esteja selada. Conecte um analisador de oxigênio E ligue a fonte de gás misturado.

Use uma mistura de 1% de oxigênio, 6% de dióxido de carbono e 93% de nitrogênio. Carregue a câmara de hipóxia até que esteja a 3% de oxigênio. Desligue o gás misturado e coloque a câmara de hipóxia a 37 graus Celsius.

24 horas depois. Olhe para o exemplo do tubo neural. As células da crista neural devem ter migrado do tubo neural delineado com a linha sólida para evitar a contaminação com tecido da crista não neural cortado ao redor da parte externa do tubo neural com uma agulha de insulina.

Em seguida, remova o tubo neural da explicação e quaisquer células de crista não neurais restantes. Substitua o meio por um novo meio de auto-renovação e retorne as placas à câmara de hipóxia. Carregue-o e coloque-o a 37 graus Celsius.

Após 24 horas em cultura, a crista neural migrará para longe do tubo neural. A extensão do crescimento é mostrada com uma linha tracejada. Este crescimento da crista neural destacado por setas é aproximadamente 96% puro e as células expressam P 75 SOX 10 e Fox D três.

Os experimentos que podem ser conduzidos com essas células de crista cultivadas incluem, mas não estão limitados ao seguinte. Às vezes, culturas menos ideais não produzirão conseqüências eficientes se isso ocorrer. Verifique novamente as condições hipóxicas, as concentrações de fibronectina e a quantidade de tempo que o tecido foi digerido na colagenase DYS Space hoje Eu demonstrei o básico por trás da cultura da crista neural do tubo neural.

Boa sorte com seus experimentos.