Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Este protocolo descreve a geração de linhagens celulares repórter de luciferase e o subsequente monitoramento de ritmos circadianos autônomos celulares na expressão de bioluminescência. Primeiro, construa repórteres de expressão de luciferase por meio de vírus lentivirais e produza partículas lentivirais, prossiga então para infectar as células de interesse e amplifique as culturas selecionadas. Em seguida, monitore a expressão de bioluminescência em células repórter sincronizadas utilizando um dispositivo de registro apropriado.

Por fim, a gravação da bioluminescência é utilizada para demonstrar ritmos circadianos autônomos celulares. A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como a transfeção transitória e a proteção da linhagem germinativa, é que a integração é mediada por vírus. O gene proporciona integração estável no genoma celular, além de maior eficiência e versatilidade.

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do relógio circadiano. Por exemplo, existem relógios circadianos específicos de tecido? Se sim, quais são as propriedades dos relógios circadianos específicos de tecido?

Embora este método possa fornecer informações sobre os mecanismos do relógio biológico, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como a dinâmica do ciclo celular, tumorigênese, entre outros. Tivemos pela primeira vez a ideia deste método quando decidimos estudar relógios biológicos específicos de tecidos ou tipos celulares.

Quem demonstrará o procedimento será a Dra. Chita Norm Napkin, pesquisadora pós-doutoranda, e Sandra, estudante de pós-graduação do meu laboratório Atory. Normalmente, um construto repórter circadiano de mamífero contém um cassete de expressão no qual um promotor circadiano é fundido ao gene da luciferase. Neste repórter lentiviral, a luciferase instável está sob o controle do promotor do gene per dois de camundongo.

Para instruções detalhadas sobre a construção de vetores repórter por reação de recombinação, consulte o manuscrito acompanhante para transfeção eficiente. Inicie com um cultivo de células renais embrionárias humanas de número de passagem baixo que estejam de 90 a 100% confluentes. Agora, revestir placas de cultura de seis poços.

Para a transfeção, adicione um mililitro de poli-L-lisina a 0,001% a cada poço, incube por 20 minutos em temperatura ambiente e lave uma vez com PBS. Em seguida, recolha as células utilizando tripsina e semeie-as em cada poço das placas pré-revestidas. Agite suavemente as placas para obter uma distribuição uniforme das células.

Verifique se as células semeadas atingiram uma confluência de 80 a 90% em um tubo microcentrífuga de 1,5 mililitro. Prepare a mistura de transfeção do plasmídeo contendo um plasmídeo repórter lentiviral, DNA e os três vetores de empacotamento como controle para a transfeção e infecção subsequente. Inclua um poço adicional para um vetor de expressão lentiviral de GFP que contenha a proteína verde fluorescente melhorada sob o controle do promotor CMV.

Em seguida, adicione 100 microlitros de cloreto de cálcio 0,25 molar aos plasmídeos e misture completamente. Depois, adicione 100 microlitros da solução two XBBS e misture suave, porém completamente. Incube a mistura de DNA à temperatura ambiente por 15 minutos.

Enquanto espera, substitua o meio das células 293T por dois mililitros de meio fresco. Retorne a placa ao incubador por pelo menos 10 minutos para equilibrar o pH do meio. Em seguida, de forma gota a gota, adicione a mistura de transfeção às células, agite suavemente a placa, observe a formação de partículas ao microscópio e, então, coloque as células no incubador durante a noite.

Aproximadamente 16 horas após a transfeção, reponha o meio com dois mililitros de DMEM fresco e cultive durante a noite. Em seguida, para avaliar a eficiência da transfeção, analise a expressão de EGFP nas células controle da transfeção. Uma eficiência de transfeção entre 90 e 100% com alta expressão de EGFP é um indicador confiável de um bom preparo viral.

Colete o meio contendo partículas virais infecciosas secretadas, centrifugue para remover as células 293T residuais e recolha o sobrenadante contendo o vírus. No terceiro dia, semeie aproximadamente 12.003 células T três em uma placa de 12 poços, cultive durante a noite até atingir 20 a 30% de confluência e observe as células no quarto dia. Ainda no quarto dia, adicione polibrena ao meio coletado contendo partículas virais e misture bem por pipetagem.

Agora aspire o meio dos três T três e adicione um mililitro da mistura viral por poço. Incube a 37 graus Celsius durante a noite; após lavar as células uma vez com PBS, reponha o meio e incube as células a 37 graus Celsius durante a noite para recuperação e crescimento. Quando as células estiverem confluentes, divida-as e cultive durante a noite no dia seguinte.

Para iniciar a seleção de células infectadas, adicione meio fresco contendo 10 microgramas por mililitro. O ácido blástico, no entanto, precisa ser determinado empiricamente para cada linhagem celular. Reponha o meio contendo blasticina a cada dois ou três dias para a seleção contínua de células resistentes ao antibiótico.

Expressão de repórteres do relógio. Após propagar a cultura de células repórteres resistentes à blastina em placas de cultura de 35 milímetros até atingir confluência, geralmente preparamos três ou mais placas para cada linhagem celular repórter sob cada condição para o fenótipo sarcíneo. Após uma lavagem com PBS, adicione DMEM contendo 10 micromolares de forolina ou 200 nanomolares de dexametasona e incube a 37 graus Celsius por uma hora para sincronizar as células.

Agora coloque as células em meio de registro recém-preparado. Cubra as placas de cultura com lamínulas estéreis de 40 milímetros e feche-as com graxa de vácuo para prevenir evaporação. Coloque as placas no luminômetro de ciclo luminescente e inicie a bioluminescência em tempo real.

Gravação Para gravar 96 placas antigas. Com o GSR, dois dispositivos de gravação, consulte o manuscrito complementar. Gravamos facilmente o ritmo por cinco a sete dias no programa de análise do ciclo lum.

Primeiro, ajuste os dados brutos à linha de base. Em seguida, utilize os dados subtraídos da linha de base para ajustar uma onda senoidal e determinar os parâmetros necessários para amostras que apresentam ritmos persistentes. Uma boa adequação dos dados acima de 90% é facilmente alcançada devido à alta luminosidade transitória.

Ativar o sensor e trocar o meio. Geralmente excluímos o primeiro ciclo de dados da nossa análise para a apresentação dos dados. Plote os dados brutos em função do tempo quando necessário.

Plote os dados subtraídos da linha de base para comparar a amplitude e a fase tanto na transfeção transitória de células 293T quanto na infecção de linhagens celulares. Imagens fluorescentes das células transfectadas e transduzidas que expressam GFP indicam que o sistema de entrega gênica mediado por lentivírus é altamente eficiente. O circuito de retroalimentação central de um relógio circadiano consiste em fatores transcricionais que atuam sobre os elementos reguladores circadianos para produzir expressão gênica rítmica.

Aqui, quatro construtos repórter diferentes em células T três produzem fases distintas de expressão do repórter. Fases intermediárias inéditas podem ser geradas com regulação combinatória por múltiplos elementos circadianos utilizando silenciamento gênico por RNAi e compostos farmacologicamente ativos. Este experimento utilizou o luminômetro lum cycle para gravação de bioluminescência de células em placas de 35 milímetros em células U2 OS.

Irna foi utilizado para iluminar os efeitos de silenciamento dos genes cry um e cry dois. Aqui, um luminômetro de sinergia foi usado para o registro da bioluminescência de células em uma placa de 96 poços com três células repórter T três.

Os RNAs foram utilizados para avaliar os efeitos do silenciamento triuno sobre os ritmos celulares. Neste exemplo, o sistema UX e um luminômetro TECAN foram usados para o registro de bioluminescência de células em 3 placas de 84 poços. Embora as placas indicadas tenham sido selecionadas, moléculas pequenas podem farmacologicamente direcionar e perturbar a função proteica nos ritmos celulares de células repórter U2 OS.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da biologia circadiana, permitindo explorar mecanismos do relógio biológico e a fisiologia em diferentes tipos celulares e tecidos. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar linhagens celulares com repórter de luciferase e monitorar os ritmos.

E não se esqueça de que trabalhar com o VIR pode ser extremamente perigoso, e as precauções, como proteção pessoal e descontaminação viral, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.