Monitorização das células-autônomas Ritmos relógio circadiano de expressão genética dos Repórteres Bioluminescência luciferase

Este protocolo detalha a geração de linhagens celulares repórter de luciferase e o subsequente monitoramento dos ritmos circadianos autônomos celulares de expressão de bioluminescência. Primeiro, construa repórteres de expressão de luciferase lentiviral e produza partículas lentivirais, prossiga para infectar as células de interesse e amplificar as culturas selecionadas. Em seguida, monitore a expressão de bioluminescência em células repórter sincronizadas usando um dispositivo de registro apropriado.

Em última análise, o registro de bioluminescência é usado para demonstrar ritmos circadianos autônomos celulares. A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a transfecção transitória e a proteção da linha germinativa, é que o VIR é mediado. O gene fornece integração estável ao genoma das células, bem como maior eficiência e versatilidade.

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da pesquisa do relógio cied. Por exemplo, existem relógios circadianos específicos para tecidos? Em caso afirmativo, quais são as propriedades dos relógios circadianos específicos do tecido?

Embora esse método possa fornecer informações sobre mecanismos de relógio. Também pode ser aplicado a outros sistemas, como dinâmica do ciclo celular, tumorgênese, etc. Tivemos a ideia para esse método pela primeira vez quando decidimos estudar relógios de fixação específicos de tecidos ou tipos de células.

Demonstrando o procedimento estarão a Dra. Chita Norm Napkin, bolsista de pós-doutorado, e Sandra, uma estudante de pós-graduação do meu laboratório Atory. Normalmente, uma construção repórter circadiana de mamífero contém uma fita de expressão na qual um promotor circadiano é fundido com o gene da luciferase. Neste repórter lentiviral, a luciferase desestabilizada está sob o controle do camundongo por dois promotores.

Para obter instruções detalhadas sobre a construção de vetores repórteres por reação de recombinação, consulte o manuscrito que acompanha a transfecção eficiente. Comece com uma cultura de células renais embrionárias humanas de baixo número de passagem que sejam 90 a 100% confluentes. Agora, para revestir seis, bem placas de cultura.

Para a transfecção, adicione um mililitro de licina 0,001% poli L a cada um, incube bem em temperatura ambiente por 20 minutos e enxágue uma vez com PBS. Em seguida, colha as células usando tripsina e semeie as células em cada poço das placas pré-revestidas. Agite as placas para obter uma distribuição uniforme das células.

Verifique se as células semeadas atingiram a confluência de 80 a 90% em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Preparar a mistura de transfecção de plasmídeo de um plasmídeo repórter lentiviral, ADN e os três vectores de embalagem como controlo da transfecção e da infecção subsequente. Inclua um poço adicional para um vetor de expressão de GFP lentiviral que abriga a proteína fluorescente verde aprimorada sob o controle do promotor do CMV.

Em seguida, adicione 100 microlitros de cloreto de cálcio 0,25 molar aos plasmídeos e misture bem. Em seguida, adicione 100 microlitros de duas soluções XBBS e misture delicadamente, mas completamente. Incube a mistura de DNA em temperatura ambiente por 15 minutos.

Enquanto espera, substitua o meio das células 2 9 3 T por dois mililitros de meio fresco. Retorne a placa à incubadora por pelo menos 10 minutos para equilibrar o pH médio. Em seguida, de forma gota, adicione a mistura de transfecção às células, gire a placa e observe suavemente a formação de partículas sob um microscópio e, em seguida, coloque as células em uma incubadora durante a noite.

Cerca de 16 horas após a transfecção, reabasteça o meio com dois mililitros de DMEM fresco e cultura durante a noite. Em seguida, para avaliar a eficiência da transfecção, avalie a expressão de EGFP nas células de controle de transfecção. A eficiência de transfecção de 90 a 100% com alta expressão de EGFP é um preditor confiável de uma boa preparação viral.

Colher o meio que contém as partículas virais infecciosas secretadas, centrifugar para remover as células T residuais 2 9 3 e recolher o vírus contendo o sobrenada. No terceiro dia, semeie aproximadamente 12.003 células T três em uma cultura de placa de 12 poços durante a noite para 20 a 30% de fluência e observe as células no quarto dia. Ainda no quarto dia, adicione policérebro ao meio coletado contendo partículas virais e misture bem pipetando.

Agora aspire o meio das três células T três e adicione um mililitro de mistura viral por poço. Incubado a 37 graus Celsius durante a noite após lavar as células uma vez com PBS, reabastecer o meio e incubar as células a 37 graus Celsius durante a noite para recuperação e crescimento. Quando confluentes, dividiu as células e a cultura durante a noite no dia seguinte.

Para iniciar a seleção das células infectadas, adicione meio fresco contendo 10 microgramas por mililitro. Blástica à parte, o ácido da explosão no carro de morte precisa ser determinado empiricamente para cada linha celular. Reabasteça o meio contendo blastina a cada dois ou três dias para seleção contínua de células resistentes a antibióticos.

Expressando repórteres de relógio. Depois de propagar a cultura de células repórter resistentes à blastina em placas de cultura de 35 milímetros até serem confluentes, geralmente preparamos três ou mais placas para cada linha de células repórter sob cada condição para o fenótipo sarcy. Após uma lavagem com PBS, adicione DMEM contendo 10 forina micromolar ou dexametasona 200 nanomolar incubada a 37 graus Celsius por uma hora para sincronizar as células.

Agora coloque as células em um meio de gravação recém-feito. Cubra as placas de cultura com lamínulas estéreis de 40 milímetros e sele com graxa a vácuo para evitar a evaporação. Carregue os pratos no luminômetro de ciclo lumous e inicie a bioluminescência em tempo real.

Gravação Para gravar 96 placas antigas. Com o GSR dois dispositivos de gravação, consulte o manuscrito que o acompanha. Registramos facilmente o ritmo por cinco a sete dias no programa de análise do ciclo de vida.

A primeira linha de base ajusta os dados brutos. Em seguida, use os dados subtraídos da linha de base para ajustar a uma onda senoidal e determinar os parâmetros necessários para amostras que mostram ritmos persistentes. Uma qualidade de pés para cima de dados de 90% é facilmente alcançada devido ao alto transiente Luminate.

Sentido e mudança média. Geralmente excluímos o primeiro ciclo de dados de nossa análise para a apresentação de dados. Plote dados brutos em relação ao tempo quando necessário.

Plote os dados subtraídos da linha de base para comparar a amplitude e a fase na transfecção transitória de 2 9 3 células T e na infecção de linhagens celulares. Imagens fluorescentes das células que expressam GFP transfectadas e transduzidas indicam que o sistema de entrega de genes mediado por lentivírus é altamente eficiente. O ciclo de feedback central de um relógio circadiano consiste em fatores transcricionais que atuam nos elementos intensificadores circadianos para produzir expressão gênica rítmica.

Aqui, quatro construções repórteres diferentes em três células T três produzem fases distintas de expressão do repórter. Novas fases intermediárias podem ser geradas com regulação combinatória por múltiplos elementos circadianos usando knockdown de genes via RNAi e compostos farmacologicamente ativos. Este experimento usou o luminômetro de ciclo lum para registro de bioluminescência de células em pratos de 35 milímetros em células U2 OS.

Irna foi usado para iluminar os efeitos de knockdown dos genes cry one e cry two. Aqui, um luminômetro de sinergia foi usado para registro de bioluminescência de células. Em uma placa de 96 poços em três células T três repórteres.

Os RNAs foram usados para avaliar os efeitos do knockdown trino nos ritmos celulares. Neste exemplo, o sistema UX e um luminômetro tecan foram usados para registro de bioluminescência de células em 3 84. Enquanto as placas indicadas são selecionadas, pequenas moléculas podem atingir farmacologicamente e perturbar a função da proteína nos ritmos celulares das células repórter do U2 OS.

Após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisas no campo da biologia circadiana para explorar os mecanismos e a fisiologia do relógio em diferentes tipos de células e tecidos. Depois de assistir a este vídeo, ele deve ter uma boa compreensão de como gerar Lúcifer, relatar linhas celulares e monitorar os volumes.

E não se esqueça que trabalhar com o VIR pode ser ordens extremamente perigosas, e a precursão, como proteções pessoais e descontaminação viral, deve sempre ser tomada durante a realização deste procedimento.