Time-lapse imagens de fluorescência de crescimento de raiz Arabidopsis com Manipulação acelerada do meio root usando o RootChip

Este artigo fornece um protocolo para o cultivo de mudas de Arabidopsis no RootChip, uma plataforma microfluídica imagem que combina controle automatizado das condições de crescimento com acompanhamento raiz microscópica e FRET baseado em medição de níveis de metabólitos intracelulares.

Para fornecer rendimentos máximos, as plantas precisam receber um conjunto de nutrientes, deficiências nutricionais, estresses como frio ou calor extremo, seca ou patógenos que causam perdas maciças no rendimento das culturas todos os anos. A origem de muitos desses problemas geralmente está no subsolo. A raiz é a âncora física da planta, mas também é o órgão responsável pela absorção de água e pela absorção de nutrientes minerais como nitrogênio, sulfato de fósforo e muitos oligoelementos.

Se quisermos desenvolver abordagens sustentáveis para produzir alto rendimento agrícola, precisamos entender melhor como as raízes se desenvolvem, como absorvem esse amplo espectro de nutrientes e como interagem com organismos simbióticos e patogênicos. Para fazer isso, precisamos ser capazes de explorar as raízes no nível microscópico Por razões óbvias. Estudar a biologia das raízes sempre foi mais desafiador do que o estudo das partes aéreas da planta.

Como as raízes geralmente estão escondidas no subsolo, elas não são facilmente acessíveis para estudos microscópicos. A remoção do solo causa danos graves ao sistema radicular e, portanto, não é uma boa maneira de estudar seu comportamento. Uma solução para tornar as raízes mais acessíveis é cultivá-las em jeed ou é mostrado neste exemplo em meio hidropônico.

Planos de cultivo em meio gelatinoso ou em meio hidropônico têm sido usados com muito sucesso em muitos estudos de raízes, mas com esses métodos, ainda é muito difícil estudar raízes em detalhes microscópicos e por longos períodos de tempo para chegar o mais próximo possível da raiz em crescimento e evitar qualquer estresse físico da preparação para a imagem, Construímos uma plataforma que nos permite cultivar e criar imagens de raízes e, ao mesmo tempo, nos permite controlar e modificar o microambiente das raízes com altíssima precisão e velocidade. Essa plataforma chamamos de chip raiz. O chip raiz é um dispositivo microfluídico fabricado a partir de PDMS, um polímero orgânico à base de silicone.

O chip possui câmaras de observação para o crescimento e imagem de raízes de mudas de opsis de coelho. As sementes germinam primeiro em cones de plástico fabricados a partir de pontas de pipeta de plástico, que enchemos com meios sólidos. A ponta da raiz então cresce através do meio e atinge a câmara, onde experimenta um fluxo contínuo de meio líquido, mantendo as condições na câmara.

Válvulas micromecânicas constantes desenvolvidas pelo laboratório de Steve Quake na Universidade de Stanford aqui são mostradas em controle vermelho. O fluxo Como o chip é montado em uma lamínula transparente, como normalmente usado para microscopia, todos os processos na câmara de observação podem ser monitorados em um microscópio invertido. A estrutura do canal bifurcado que guia o fluxo de fluido pode ser vista ao microscópio.

O chip raiz consiste em duas camadas, uma camada de controle contendo as válvulas em uma camada de fluxo contendo os canais através dos quais as soluções de teste de meios de crescimento fluem para as câmaras de observação. O volume dessas câmaras é de aproximadamente 400 nanolitros. Isso significa que apenas quantidades muito pequenas de solução são necessárias e as condições podem ser alteradas muito rapidamente.

Este protocolo descreve como as raízes vivas de oito ou mudas de Arabidopsis são preparadas para imagens microscópicas paralelas no chip da raiz e observadas por até três dias, começando com o preenchimento de uma placa de Petri de 10 milímetros com meio de crescimento contendo 1% de ágar enquanto o meio ainda é líquido. Encha as pontas da pipeta de 10 microlitros com cinco microlitros de meio da placa de Petri usando uma pipeta multicanal. As ponteiras cheias são armazenadas na caixa da ponteira da pipeta até que o meio esteja sólido.

Em seguida, corte em cones de plástico de quatro milímetros de comprimento e coloque na vertical em uma placa de Petri contendo meio de crescimento sólido. Após a esterilização da superfície, sementes individuais são colocadas em cima dos cones cheios de mídia. O prato é então selado com fita micropore e o prato é armazenado a quatro graus para sincronizar a germinação.

Após três dias, as placas são transferidas para um gabinete de crescimento para iniciar a germinação. Nossas condições de crescimento neste experimento são de 23 graus. Em um destaque de 16 horas, ciclo de escuridão de oito horas entre cinco e sete dias após a germinação, a muda deve estar pronta para transferência para o comprimento da raiz da plântula e, se aplicável, a expressão de um marcador fluorescente deve ser verificada em um microscópio de dissecação.

Assim que as pontas das raízes das mudas atingirem a saída inferior do cone de plástico, as mudas individuais são marcadas para transferência para o chip. 10 ou mais mudas de plantas devem ser selecionadas caso uma seja danificada durante a transferência para esterilizar o chip da raiz. Para experimentos de longo prazo, o dispositivo é envolto em tecido, colocado em uma placa de Petri de vidro e autoclave.

Este chip acabou de ser autoclavado antes. O experimento após o resfriamento do chip é revestido com meio de crescimento líquido. O chip deve estar completamente coberto, mas o nível do fluido não deve ser superior a três milímetros sobre a superfície do chip.

Uma pipeta de 20 microlitros é usada para puxar o meio através da entrada da raiz e da saída da câmara. Isso enche a câmara de observação. Com a mídia, os cones de plástico selecionados agora são conectados ao chip raiz.

O cone deve se encaixar perfeitamente nas entradas. Como o chip raiz é montado em uma fina camada de vidro óptico, deve-se ter cuidado para não aplicar muita pressão no chip. Durante esta etapa, o chip agora está preparado para uma incubação noturna dentro do meio líquido para evitar que o chip flutue.

Duas lâminas de vidro, uma cortada ao meio, são colocadas no chip. Uma barra de agitação magnética é adicionada e o prato é fechado. O conjunto agora é transferido para uma agitação magnética, que agitará suavemente o meio para facilitar o crescimento das raízes em direção às saídas.

O chip de raiz. As entradas são perfuradas em um ângulo para apoiar ainda mais o crescimento na direção desejada. Incline levemente o conjunto levantando o lado do cavaco oposto às saídas.

O chip é iluminado com anel lamp Conectado a um interruptor de temporizador para manter o ritmo claro e escuro. Após a incubação durante a noite, o meio de crescimento líquido é preparado em um frasco pressurizável selável. As etapas a seguir devem ser executadas rapidamente e sem interrupção para evitar o ressecamento das mudas.

O chip agora é removido do meio líquido e colocado de cabeça para baixo na abertura inferior do porta-chips, que também está invertido. O chip deve ser orientado de forma que o lado que contém as entradas da camada de controle esteja voltado para o lado da linha de pressão. Dois conectores grandes na parede lateral do suporte.

A lamínula na parte inferior do chip é seca por lenço de papel e afixada no suporte. Com a fita, todo o conjunto é invertido. Os conectores da tubulação são preenchidos com água usando uma seringa e cada conector da tubulação é conectado à entrada correspondente.

No chip. A tubulação é conectada à mídia e à solução. Os frascos e o ar são então removidos das linhas aplicando pressão na solução bile com seringa de ar, o transportador é coberto com plástico transparente.

Para manter a alta umidade no conjunto, o suporte é colocado na platina do microscópio. Deve caber exatamente nos entalhes do palco. As válvulas de cavaco, bem como o fluxo do meio através do cavaco, são controlados pela pressão do ar.

Duas linhas com reguladores são ramificadas de uma linha de pressão principal. Um é usado para controlar o fluxo de fluido e o outro é conectado a válvulas de ar solenóides. Essas válvulas são operadas a partir do computador por meio do controlador de válvula USB e são responsáveis por acionar as válvulas no chip.

Ambos os reguladores de pressão devem ser fechados antes que o chip seja conectado. Tubos, conectores e frascos de solução agora estão conectados às linhas de pressão correspondentes. Alguns mililitros de água são adicionados aos reservatórios do transportador.

Esta etapa pode precisar ser repetida ao longo de experimentos mais longos. Para manter a umidade alta, mantenha a carga de volume para minimizar a quantidade potencial de líquido que pode ser derramada no microscópio. A luz do anel é movida para a posição sobre o chip para manter o ciclo claro e escuro até o início do experimento.

As válvulas no chip são fechadas aplicando pressão neste caso, abrindo as válvulas solenóides de ar. A interface de visualização de laboratório permite o controle das válvulas clicando no botão abaixo do número da válvula. Verde brilhante indica aplicação de pressão e fechamento de uma válvula de cavaco.

Este esquema ilustra a organização do sistema de válvulas, enquanto as válvulas quatro a oito atuam como válvulas únicas, válvula zero a três. Em grupos com este sistema, uma câmara individual pode ser abordada ativando uma combinação de válvulas, por exemplo, para guiar o fluxo de fluido exclusivamente para a terceira câmara a partir das válvulas superiores zero, três e quatro devem ser fechadas. Além disso, as válvulas seis, sete e oito controlam qual solução é usada para lavar as entradas A, B e C agora ativam todas as três válvulas de entrada da solução para fechá-las.

A interface do controlador possui um loop de feedback, que permite o monitoramento do status do sistema. Este recurso pode ser ativado clicando no botão de leitura. O regulador de pressão para a camada de controle é aberto primeiro e ajustado para 15 PSI.

Em seguida, o regulador para a camada de fluxo é aberto e ajustado para cinco PSI. A válvula de entrada para o meio de crescimento de escolha é aberta e as câmaras são lavadas com caminhos de fluxo de mídia devem ser verificados ao microscópio. Na maioria dos casos, o ar fica preso nos canais e deve ser removido.

Além disso, os canais do ar de controle ainda contêm ar que deve ser forçado para fora e substituído pela água dos conectores da tubulação. Esse processo é chamado de preenchimento sem saída. Ambas as tarefas são realizadas lavando cada uma das oito câmaras várias vezes até que todo o ar seja forçado dos canais para o PDMS.

O sistema pode ser programado para automatizar experimentos. Essas rotinas também podem ser usadas para desgaseificar o chip. O objetivo principal do chip raiz é combinar uma plataforma de imagem E um sistema de profusão em um único dispositivo.

Para demonstrar a manipulação do microambiente das raízes, lavamos as câmaras com corante e medimos a troca de fluido dentro das câmaras. Na pressão recomendada de cinco PSI, medimos uma troca completa em 10 segundos a uma taxa de fluxo calculada de aproximadamente 1,5 microlitros por minuto. Também observamos o crescimento radicular de mudas, neste caso cultivadas no escuro e supridas com glicose 10 milimolar como fonte de energia externa.

Dependendo das condições de crescimento, como luz e composição do meio, as plantas podem ser observadas no chip radicular por até três dias. Este sistema tem sido usado para monitorar os níveis intracelulares de glicose e galactose em raízes que expressam nanossensores geneticamente codificados. Esses sensores baseados na primeira transferência de energia ou transferência de energia de ressonância ou traste foram desenvolvidos no laboratório de Fromer.

Para este experimento, as raízes do chip foram perfundidas com pulsos quadrados de solução de glicose ou galactose. Os níveis intracelulares de açúcares foram monitorados e são mostrados aqui, expressos como uma razão entre a intensidade do aceptor fluoro quatro citrino e a intensidade do ECFP do doador à esquerda. Observamos a quantidade de sensores citrinos na imagem métrica do meio ou da proporção da ponta da raiz e, à direita, rastreamos a quantidade de açúcar como resposta a três pulsos quadrados repetidos de glicose em verde e galactose mostrados em vermelho.

O aumento na proporção indica um acúmulo de açúcar. As principais vantagens do chip radicular em relação aos métodos convencionais de crescimento são a preparação minimamente invasiva para microscopia, a capacidade de alterar reversível e repetidamente o ambiente radicular e a capacidade de observação contínua de tecidos fisiologicamente saudáveis e competentes para o desenvolvimento durante um período de dias. Outra vantagem realmente importante é que apenas quantidades mínimas de líquido são necessárias para fornecer às raízes todos os nutrientes necessários ao longo do tempo.

Isso torna o chip de raiz muito econômico, especialmente quando reagentes caros são aplicados. Continuamos a otimizar o chip de raiz e estender sua usabilidade porque acreditamos que, ao tornar esse importante órgão mais acessível para tratamentos e observação, ferramentas microfluídicas como o chip de raiz abrirão potencialmente novas dimensões de pesquisa de plantas. Mais informações sobre como construir um sistema de chip raiz podem ser encontradas em nosso site.

Os chips podem ser encomendados na Stanford Foundry.