Um chip microfluídico simples para crescimento a longo prazo e imagem de Caenorhabditis elegans

A principal vantagem desta técnica é que o animal pode crescer livremente dentro do dispositivo e pode ser preso para imagens de alta resolução. O dispositivo pode ser reutilizado várias vezes. Ao fabricar o dispositivo, a limpeza é o fator mais importante para poder fabricar dispositivos livres de poeira para evitar vazamentos durante as operações do dispositivo.

Para começar o padrão de projeto um para a camada de fluxo e o padrão dois para a camada de controle usando formas retangulares em um software de processamento de texto e imprimir as máscaras fotográficas com a ajuda de um plotter a laser com um tamanho mínimo de oito micrômetros em filme à base de poliéster. Corte as bolachas de silício em pedaços quadrados de 2,5 centímetros de altura e largura. Limpe-os com hidróxido de potássio a 20% por um minuto e enxágue as bolachas em água deionizada.

Use uma bolacha para o fluxo e a outra para a camada de controle. Seque as peças com 14 P-S-I de gás nitrogênio comprimido seguido de desidratação em uma placa quente a 120 graus Celsius por quatro horas. Após o resfriamento, pegue uma peça de silício, coloque-a no mandril de um codificador de rotação e ligue o vácuo para manter a bolacha no lugar.

Coloque aproximadamente 20 microlitros de hexametildisilano na peça de silício e cubra-a usando o codificador de spin a 500 R-P-M por cinco segundos, seguido por 3000 R-P-M por 30 segundos. Para obter uma espessura fotorresistente uniforme de aproximadamente 40 micrômetros específica para a camada de fluxo, cubra a bolacha de silício com aproximadamente 1,5 mililitros de fotorresistência negativa usando um codificador de spin a 500 R-P-M por cinco segundos, seguido por 2000 R-P-M por 30 segundos. Repetir o revestimento da peça de silício com hexametildisilano e fotorresistência negativa para a segunda bolacha para obter uma espessura fotorresistente uniforme de aproximadamente 40 micrômetros específica para a camada de controle.

Alternativamente, para aumentar a espessura da camada de fluxo para aproximadamente 80 micrômetros para animais mais velhos, cubra bolachas de silício com aproximadamente 1,5 mililitros de fotorresistência negativa dois, usando o codificador de spin a 500 R-P-M por cinco segundos, seguido por 2000 R-P-M por 30 segundos. Asse os pedaços de silicone revestidos anteriormente fotorresistentes em uma placa quente a 65 graus Celsius por um minuto, seguido por 95 graus Celsius por 10 minutos. Após o resfriamento, coloque peças de silicone cozidas macias no estágio de exposição do iluminador U-V com a superfície revestida fotorresistente voltada para a lâmpada U-V.

Exponha as duas peças separadamente ao U-V por 15 segundos usando uma lâmpada de 200 watts através de uma máscara fotográfica com padrões um e dois para obter camadas de fluxo e controle, respectivamente. Asse os dois pedaços de silicone expostos, conforme descrito anteriormente, com camadas revestidas voltadas para cima. Após o resfriamento das peças, desenvolva os padrões mergulhando as peças de silicone na solução reveladora fotorresistente por 20 minutos.

Uma vez que o padrão esteja visível, lave as peças com álcool isopropílico puro e seque suavemente usando gás nitrogênio. Mantenha as peças de silicone em um exsicador com a superfície revestida voltada para cima. Exponha as peças a vapores de silano derramando 50 microlitros de T-C-P-F-O-S puro em uma lâmina de vidro.

Coloque a lâmina dentro de um exsicador e incube por duas horas. Faça P-D-M-S em um copo de plástico, misturando a base do elastômero com o agente de cura e mexa constantemente por três minutos. Degaseifique a mistura P-D-M-S em um exsicador por 30 minutos para remover todas as bolhas de ar.

Coloque as bolachas de silício da camada de controle em uma placa de Petri e despeje uma camada de mistura P-D-M-S de cinco milímetros de espessura sobre as peças de silício. Após o processo de derramamento P-D-M-S, repita a desgaseificação da mistura P-D-M-S. Coloque a bolacha de silício com a camada de fluxo voltada para o caminhão rotador aplicando pressão de vácuo de 200 a 500 militorres.

Despeje aproximadamente um mililitro de P-D-M-S sobre a bolacha de silício. Codifique-o usando um revestidor de spin para obter uma camada de aproximadamente 80 micrômetros de espessura. Asse as duas bolachas de silício com o P-D-M-S revestido de spin e despeje as camadas P-D-M-S a 50 graus Celsius em um forno de convecção de ar quente por seis horas.

Depois de esfriar, as peças cortam a camada P-D-M-S de cinco milímetros de espessura da peça de silício ao redor da camada de controle usando uma lâmina afiada e retiram-na do substrato de silício. Perfure dois orifícios de aproximadamente um milímetro de diâmetro usando um perfurador Harris no reservatório do bloco P-D-M-S para conectar as entradas do canal de imobilização e do canal de isolamento às linhas de gás para deflexões de membrana P-D-M-S. Coloque a peça de silício com a camada P-D-M-S revestida por rotação no padrão um com a superfície revestida de P-D-M-S voltada para cima em uma bandeja de plástico.

Mantenha o bloco P-D-M-S perfurado com o padrão dois na bandeja com o lado moldado voltado para cima. Mantenha a bandeja de plástico dentro de um limpador de plasma e exponha as duas superfícies P-D-M-S a 18 watts de plasma a ar por dois minutos aplicando baixo vácuo. Retire os dois blocos tratados com plasma e ligue suavemente os blocos pressionando as superfícies tratadas com plasma dos padrões um e dois juntos.

Asse os padrões colados a 50 graus Celsius por duas horas em um forno de convecção de ar quente. Depois de tirar o dispositivo colado do forno, corte-o da bolacha de silício com o padrão um e o padrão dois e faça furos nos reservatórios de entrada e saída da camada de fluxo usando o perfurador Harris. Coloque o bloco P-D-M-S colado com a camada de fluxo voltada para cima em uma bandeja de plástico e mantenha um vidro de cobertura limpo na mesma bandeja.

Exponha os blocos no vidro da tampa a 18 watts de plasma de ar por dois minutos. Ajuste a pressão de vácuo para ver uma câmara violeta. Coloque o bloco P-D-M-S exposto a plasma no vidro da tampa e asse a estrutura colada em um forno a 50 graus Celsius por duas horas.

Armazene o dispositivo em uma câmara limpa para qualquer experimento futuro. Pegue o dispositivo, coloque-o em um microscópio estéreo e prenda as tubulações. Conecte um tubo microflex a uma linha de gás nitrogênio comprimido e a um conector de três vias na outra extremidade.

Conecte os tubos um e dois dos conectores de três vias ao purgador em membranas isolantes, respectivamente. Conecte dois tubos microflex às duas portas de saída da torneira de três vias. Conecte a outra extremidade dos dois tubos a uma agulha de calibre 18 de oito milímetros de comprimento.

Preencha a camada de fluxo com buffer M-9 usando uma micropipeta através da porta de entrada. Encha ambos os tubos com água deionizada através da extremidade conectada à agulha. Insira as duas agulhas nos orifícios perfurados que ligam a membrana de isolamento e aprisionamento.

Abra o regulador de gás nitrogênio a 14 P-S-I e gire a válvula de três vias do tubo um para empurrar a água para o dispositivo através dos canais microfluídicos nas camadas de controle, ou seja, as membranas de armadilha e isolamento. Libere a pressão usando a torneira de três vias, uma vez que os canais estejam cheios de água e preparados. Remova as bolhas fluindo mídia adicional através do canal de fluxo.

A figura mostra imagens de P-S-3-2-3-9, animal crescendo dentro do chip microfluídico e imobilizado a cada oito a 10 horas para capturar imagens de fluorescência. A variação no padrão de expressão representa um exemplo de regulação genética temporal em que o mesmo gene é expresso em diferentes células em diferentes estágios de desenvolvimento. A imagem do genótipo W-D-I-S-5-1 individual de caenorhabditis elegans mostra arquitetura dendrítica ramificada semelhante a menorá em cada neurônio P-V-D, compreendendo processos primários, terciários secundários e quaternários nos estágios de desenvolvimento L-2, L-2 tardio, L-3 e L-4, respectivamente.

A figura aqui compara o desenvolvimento de P-V-D e os animais cultivados por dispositivos, e aqueles cultivados em placas N-G-M. Os números de S-P e Q-P em diferentes estágios do desenvolvimento do verme aumentaram com a idade. Caenorhabditis elegans foi tratada com uma gota de três levamisol milimolares para causar paralisia suficiente necessária para imagens de alta resolução.

Os valores de S-P não foram significativamente diferentes quando medidos a partir de animais em estádios semelhantes cultivados em placas N-G-M e fotografados usando três levamisol milimolar em uma lâmina de ágar. Além disso, a distância entre os dois corpos celulares P-V-C, um presente na cauda e o segundo presente perto da vulva, aumenta à medida que se afastam tanto em animais cultivados no dispositivo quanto naqueles cultivados em placas N-G-M. A figura representa a imagem de alta resolução dos neurônios receptores de toque de animais que crescem dentro do dispositivo microfluídico.

A montagem representa todo o processo neuronal P-L-M-R em pontos de tempo sucessivos, destacando as mitocôndrias e o processo neuronal. O gráfico representa o comprimento total do processo neuronal, que foi observado para aumentar com uma inclinação de 10,4 micrômetros por hora. O dispositivo microfabricado usa uma fina membrana P-D-M-S desviada na presença de gás nitrogênio de alta pressão para imobilizar e manter os C-elegans no lugar para imagens de alta resolução.

Este procedimento pode permitir estudos longitudinais de processos celulares e subcelulares em C-elegans que necessitam de observações intermitentes durante um longo período de tempo.