Geração de Células-tronco pluripotentes induzidas a partir de sangue periférico usando o STEMCCA Lentivirus Vector

O protocolo demonstra como gerar eficientemente células-tronco pluripotentes induzidas humanas a partir de quatro mililitros de sangue periférico. No dia zero, isole e expanda as células mononucleares da amostra de sangue periférico. Transduza as células primárias com o vetor de co-reprogramação de células-tronco.

No nono dia, proceda a semear as células transduzidas sobre fibroblastos embrionários de camundongo inativados e cultive por cerca de três semanas. Escolha as colônias semelhantes a HESC para expansão e caracterização. Resultados da coloração por imunofluorescência para a expressão de marcadores de pluripotência como SS EEA quatro, trial um 60 e trial 180 1.

Demonstre a geração eficiente de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. O uso do vetor antiviral de células-tronco para gerar células-tronco pluripotentes induzidas humanas oferece diversas vantagens em comparação com outros métodos existentes. Talvez o aspecto mais atrativo seja a simplicidade geral da abordagem, pois exige acesso fácil ao tecido doador, e com isso quero dizer fragmentos facilmente obtidos de sangue periférico.

Os atributos mais importantes deste método são a eficiência da reprogramação e a qualidade dos clones de células iPS obtidos. A demonstração do procedimento será realizada por Andrea January Summer, pesquisadora pós-doutoranda no meu laboratório, e Sarah Rozelle, estudante de pós-graduação no laboratório de George Murphy. Tudo no dia zero.

Retire quatro mililitros de sangue periférico para um tubo vacutainer para preparação celular com citrato de sódio. Inverta o tubo de oito a 10 vezes dentro de duas horas após a coleta. Centrifugue a amostra a 1.800 ×g por 30 minutos à temperatura ambiente para coletar as células mononucleares.

Aspire o plasma e pipete o coágulo leucocitário, a camada celular entre a barreira de gel e o plasma. Transfira o coágulo leucocitário para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e complete o volume para 10 mililitros com PBS estéril. Inverta os tubos várias vezes e centrifugue a 300 ×g por 15 minutos.

Reuspenda o pellet celular em 10 mililitros de PBS estéril, realize uma contagem celular e, em seguida, transfira uma a duas vezes 10⁶ células para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Recolha as células por centrifugação e reuspenda o pellet em 2 mililitros de meio de expansão. Em seguida, semeie as células mononucleares isoladas em um poço de uma placa de 12 poços e cultive a 37 °C e 5% de dióxido de carbono.

Colete as células restantes por centrifugação e congele estoques de aproximadamente duas vezes 10 à sexta células por frasco em FBS contendo 10% DMSO nos dias três e seis. Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e lave o poço uma vez com um mililitro de meio de células-tronco QBSF 60. Para coletar as células aderentes.

Colete as células por centrifugação, ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de em. Em seguida, transfira a suspensão celular para um poço de uma placa de 12 poços e retorne a cultura ao incubador no nono dia. Transfira as células para um tubo cônico estéril de 15 mililitros e lave o poço uma vez com um mililitro de meio de células-tronco QB SF 60 para coletar as células aderidas; centrifugue a cultura a 300 ×g por 10 minutos.

Em seguida, ressuspenda o pellet celular em um mililitro de EM fresco contendo cinco microgramas por mililitro de polibrena e lentivírus STEM para uma MOI de um a 10. Em seguida, transfira a suspensão para um poço de uma placa de 12 poços e centrifugue a 2.250 RPM durante 90 minutos a 25 graus Celsius. Adicione um mililitro adicional de EM fresco contendo cinco microgramas por mililitro de polibrena, perfazendo um total de dois mililitros de EM, e coloque a placa no incubador de cultura celular no dia 10.

Após colher as células conforme mostrado anteriormente, ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de meio de cultura EM. As células transduzidas em um poço de uma placa de 12 poços no dia 11 recobrem os poços de uma placa de 6 poços com gelatina 0,1%, em seguida plaque fibroblastos embrionários de camundongo inativados a duas vezes 10 à quinta células por poço em meio meth. Prepare três poços por infecção.

No dia seguinte, colete as células mononucleares transduzidas conforme mostrado anteriormente. Após a centrifugação, re-suspenda o pellet celular em três mililitros de meio metilcelulose contendo BFGF. Ácido ascórbico e fatores de crescimento.

Agora aspire o meio da placa MES com um mililitro das MCs por poço de OFMs. Em seguida, adicione 1,5 mililitro de meio de metilação completo e centrifugue a placa a 500 RPM a 25 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, cultive a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por dois dias a partir do dia 14 em diante.

Reponha o meio a cada dois dias com 2,5 mililitros de meio de metila contendo 10 nanogramas por mililitro de BFGF e 50 microgramas por mililitro de ácido ascórbico, mas sem fatores de crescimento. Por volta do dia 20, quando aparecerem colônias pequenas, alimente as células diariamente com dois mililitros de meio de células-tronco embrionárias humanas entre os dias 30 e 40. Escolha cada colônia e transfira para poços individuais de uma placa de 12 poços previamente revestida com maths inativadas, contendo um mililitro por poço de meio HESC mais inibidor de ROCK; alimente as células diariamente.

Posteriormente, com um mililitro de meio HESC sem o inibidor de ROCK, as células-tronco pluripotentes derivadas de monócitos humanos estão agora prontas para a coloração por imunofluorescência de marcadores de pluripotência e também para a excisão do cassete de reprogramação integrado. Durante este protocolo, as células passam por várias alterações morfológicas, desde os BMCs até a geração de iPSCs humanas. No dia zero, as células mononucleares isoladas do sangue periférico são cultivadas em meio de expansão após nove dias.

Grupos de uvas, semelhantes a aglomerados de células, são observados, sugerindo que as células estão saudáveis e se proliferando antes da transdução. Por volta do dia 21, uma semana após as células serem semeadas nos MA, colônias se formam. No dia 30, as colônias de IPSC exibem morfologia típica de células-tronco embrionárias humanas.

Esta análise de imunofluorescência de CIPs geradas a partir de pbmc mostra a expressão dos marcadores de pluripotência SSEA quatro, trial um 60 e trial 180 1. As CIPs também apresentam coloração positiva para fosfatase alcalina. Essas imagens mostram as etapas para gerar CIPs livres de transgene por meio de transfeção com um plasmídeo coex que expressa a recombinase CRE e um gene de resistência à puromicina, conforme descrito em Summers et al. 2010; em comparação com CIPs antes da transfeção, observa-se morte celular.

Após dois dias de seleção com puromicina, novas colônias surgem a partir de células resistentes cerca de 10 dias após a transfeção. Análises de sangue do sul em colônias selecionadas confirmam a excisão do transgene. As linhas 1, 3, 5 e 7 mostram a presença do transgene em clones de IPSC antes da excisão. Essas bandas estão ausentes nas linhas 2, 4, 6 e 8 após a excisão do transgene. Após assistir a este vídeo, você deverá ser capaz de gerar de forma consistente e robusta células IPS humanas de alta qualidade, normais ou específicas de doenças, a partir de pequenas quantidades de sangue periférico de qualquer indivíduo.

Essa abordagem simplifica o processo de reprogramação de células somáticas para torná-lo amplamente acessível à comunidade de células-tronco. Ao mesmo tempo, fornece uma base para a geração de populações mais homogêneas de linhagens de células-tronco.