Usando tomografia de tórax para visualizar a estrutura tridimensional e Função da Usina Vasculatura

O objetivo geral deste procedimento é utilizar a tecnologia de microtomografia de raios-x baseada em síncrotron para explorar a estrutura e a função do transporte vascular nas plantas. Isso é feito preparando primeiro as amostras para instalação em um suporte de mandril ou no suporte de planta viva, garantindo que a porção a ser escaneada esteja o mais vertical possível e fazendo as medições fisiológicas preliminares necessárias. O segundo passo é colocar as amostras preparadas ou plantas vivas na gaiola A LS Beamline 8.3 0.2 e proteger a gaiola para digitalização. Próximo.

Após o posicionamento adequado da amostra, a varredura é iniciada. A etapa final é utilizar os computadores da estação de trabalho para normalizar, reconstruir e avaliar a qualidade da varredura antes de passar os dados para um VISO para o processo de visualização 3D. Em última análise, a microtomografia de raios-x é usada para revelar detalhes finos das interconexões e do estado funcional da vasculatura condutora de água nas plantas.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como seccionamento em série e microscopia de luz, é que o tecido vegetal pode ser explorado em qualquer orientação com resolução sem precedentes. Este método pode nos ajudar a entender questões-chave no campo da biologia vegetal, desde aspectos fundamentais do transporte de água nas plantas até a seca e tolerância ao congelamento até como os patógenos se movem sistemicamente nas plantas hospedeiras. Este protocolo, conforme descrito, foi projetado para trabalhar na fonte de luz avançada.

8,3 0,2. Adaptações de linha de luz podem ser necessárias para trabalhos em outras instalações síncrotrons. Certifique-se de seguir o treinamento de segurança e radiação necessário para o uso dessas instalações para iniciar a preparação de amostras para plantas vivas.

Primeiro cultive as plantas em vasos de aproximadamente 10 centímetros de diâmetro, garantindo que o caule principal ou outra parte da planta a ser escaneada esteja o mais centralizada possível e orientada verticalmente no vaso. As dimensões físicas do instrumento de TCAR Hutch limitam as plantas vivas a cerca de um metro de altura. Como consequência, a imagem de plantas vivas é melhor realizada em mudas ou mudas.

Cultivado em vasos pequenos, use um suporte de vaso de alumínio rígido feito sob medida para montar as plantas vivas em vasos. A altura da placa superior deve ser ajustada para acomodar uma variedade de alturas de vasos. Aqui, a parte superior da placa é projetada para se alinhar com a parte superior da superfície do solo e a planta se projeta do centro da placa de duas partes.

Uma vez montado no suporte, meça o potencial de água do caule usando uma câmara de pressão estilo módulo de pouso SHO ou um parâmetro de folha de encaixe para determinar o estado fisiológico da planta antes da varredura. Torça um pequeno pedaço de fio de cobre ao redor do caule para servir como fiduciário para garantir uma localização consistente de digitalização nas plantas que serão digitalizadas repetidamente. Agora, coloque um cilindro de acrílico de parede fina sobre a planta em cima do suporte de alumínio e prenda-o no lugar com parafusos para estabilizar a amostra.

Toalhas de papel de filme plástico adicionais e fita adesiva devem ser usadas para minimizar ainda mais a vibração e o movimento das partes da planta, o que pode causar distorções na imagem. Prenda o suporte de pote personalizado ao rolamento de ar stage e trave-o no lugar posicionado entre a fonte de raios X e o sensor de imagem e o equipamento da câmera. Certifique-se de posicionar a haste o mais verticalmente possível e centralizar a amostra na base do mandril magnético para garantir que ela permaneça no campo de view Durante a rotação, o material vegetal fresco, normalmente caules ou animais de estimação, pode ser escaneado após a remoção imediata de uma planta viva.

Se a intenção do experimento é visualizar a totalidade da rede de xilemas, a água dentro dos vasos deve primeiro ser evacuada e substituída por ar. Para fazer isso, monte a amostra em uma câmara de pressão estilo calúnia e empurre ar comprimido ou nitrogênio através da amostra em baixa pressão por aproximadamente cinco minutos. As espécies serão diferentes no tempo necessário para evacuar a rede de embarcações.

Se a intenção é avaliar a extensão da formação de embolia no tecido fresco da planta, retire amostras da planta usando uma lâmina de barbear nova, fazendo os cortes debaixo d'água. Em seguida, envolva a amostra em uma camada de paraforma para evitar a dessecação durante a varredura, monte a amostra em um mandril fixado a uma placa de metal aparafusada no centro do estágio do rolamento de ar e oriente a amostra verticalmente conforme descrito anteriormente para garantir que a amostra permaneça no campo de visão. Para preparar amostras de tecido lenhoso seco, comece cortando amostras de aproximadamente seis centímetros de comprimento.

Selecione amostras que sejam o mais retas possível na região de varredura de destino e tenham um diâmetro de cerca de um centímetro. O próximo passo é desidratar lentamente toda a amostra para garantir a visualização ideal da amostra de tecido e o contraste da imagem. Coloque a amostra de tecido lenhoso em um forno de secagem em baixa temperatura para secar lentamente a amostra sem causar rachaduras ou rachaduras no tecido.

Em algumas situações, pode ser desejável ter um marcador fiduciário anexado à amostra. Isso garante que a dissecção e visualização subsequentes utilizando microscopia eletrônica de varredura possam ser orientadas para pontos específicos na imagem da TCAR. Para fazer isso, fixe uma conta ou fio de metal ou vidro na parte externa da haste usando parfum.

Por fim, monte a amostra na verificação de perfuração e centralize conforme descrito acima antes da digitalização. Determine a ampliação que funcionará melhor para sua aplicação. A linha de luz A LS 8.3 0.2 usada aqui tem a capacidade de escanear com lentes com ampliações de dois x cinco x e 10 x.

Defina a energia de raios-x para 15 quilo elétron-volts. Os tempos de exposição geralmente dependem da espessura e densidade da amostra e variam de 100 a 1000 milissegundos. Escolha um incremento angular apropriado para sua aplicação.

As amostras são giradas 180 graus durante uma varredura, e o número de imagens tiradas durante a rotação pode ter um impacto significativo no tamanho do conjunto de dados, na duração do intervalo de varredura e na qualidade final da imagem. As varreduras típicas são realizadas em incrementos de 0,25 graus, resultando em 513 imagens por varredura. Intervalos de varredura mais curtos podem ser alcançados usando a configuração de tomografia contínua durante a qual a amostra gira continuamente enquanto as imagens são capturadas para cada varredura, imagens de campo claro e campo escuro também devem ser coletadas.

Imagens de campo claro são imagens sem a amostra no feixe. Estes são frequentemente coletados antes e depois da varredura da amostra, traduzindo horizontalmente a amostra. Os campos escuros são coletados fechando o obturador de raios-x.

Isso mede a quantidade de sinal que a câmera mostra sem raios-x. Quando a verificação estiver concluída, transfira as imagens TIFF 2D brutas do computador de aquisição para um servidor de arquivos e, em seguida, exporte para um computador a ser usado para processamento de dados. Em seguida, as imagens devem ser convertidas em uma escala de transmissão percentual.

A Linha de Luz 8.3 0.2 possui um plugin de normalização de fundo personalizado que pode ser baixado e usado com os pacotes de software disponíveis gratuitamente. Imagem J ou Fiji carregam as imagens normalizadas no pacote de software octopus e, em seguida, reconstroem um conjunto de dados 3D a partir dos arquivos de imagem TIFF brutos 2D usando as etapas de processamento designadas. Em seguida, a pilha de imagens pode ser visualizada em uma variedade de pacotes de software.

Aqui, o pacote de software aviso é usado, carrega conjuntos de dados na memória do sistema e exibe a amostra em orientações de fatia transversal, longitudinal ou radial virtual Devido aos atributos 3D do conjunto de dados, as fatias virtuais através da amostra podem ser giradas em qualquer plano para se alinhar com as regiões de interesse. Uma vez realizada a segmentação, é possível quantificar as estruturas da planta-alvo ou mudanças funcionais em volume, comprimento, largura, presença ou ausência de água, ar, etc. As tomografias síncrotron foram implementadas com sucesso em uma ampla variedade de tecidos e espécies vegetais usando a linha de luz 8.3 0.2 e forneceram novos insights sobre a estrutura e a função do xilema vegetal em resolução sem precedentes em 3D.

As capacidades de visualização e exploração fornecidas pelas reconstruções 3D, como visto aqui, permitem a determinação precisa da localização e orientação das estruturas com as redes do xilema em amostras de extirpação e em plantas vivas. Aqui vemos uma reconstrução 3D do caule da sequóia submetido ao estresse hídrico e exibindo traqueias cheias de ar e água Uma vez dominada, esta técnica pode ser executada em minutos se feita corretamente Seguindo este procedimento. Outros métodos, como a microscopia eletrônica de varredura, podem ser usados para validar as estruturas que vemos dentro das plantas e chegar a limites de tamanho, que são então alimentados nos programas de processamento que usamos para a análise de dados.