Manutenção de C. elegans

<em>C. elegans</em> Maintenance

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Maintenance

3.2: Drosophila Maintenance

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10:54 min

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May 10, 2013

Overview

Ceanorhabditis elegans tem sido, e ainda é, usado para grande sucesso como um organismo modelo para estudar uma variedade de fenômenos de desenvolvimento, genéticos, moleculares e até físicos. A fim de usar C. elegans em todo o seu potencial, o cuidado adequado e a atenção para a manutenção básica deste poderoso organismo é essencial.

Neste vídeo você aprenderá os requisitos básicos de habitação e alimentação de C. elegans, como manusear e manipular corretamente worms usando uma picareta de vermes e como congelar e recuperar importantes estoques de vermes. No final do vídeo visitaremos algumas aplicações de modificação da habitação, alimentação e manipulação desses animais importantes.

Procedure

O cuidado correto e a manutenção dos elegans de Caenorhabditis são essenciais para experiências bem sucedidas.

Eles exigem muito pouco espaço, são baratos para casa, têm alta fecundidade, e são fáceis de manipular. Mas só porque eles são simples de manter por perto não significa ciência covarde. Na verdade, Sydney Brenner famosamente chamou C. elegans de “presente da natureza para a ciência”, e desde sua introdução em 1974 o verme tem sido destaque em uma série de experimentos ganhadores do Prêmio Nobel.

Neste vídeo, demonstraremos métodos básicos para manter C. elegans no laboratório, incluindo: habitação e alimentação, manuseio, bem como congelamento e descongelamento de vermes.

Na natureza, C. elegans são encontrados no solo e se alimentam de matéria vegetal em decomposição. No laboratório, é importante manter nematoides o mais felizes possível, e assim nós casamos e os alimentamos usando métodos muito específicos.

C. elegans podem ser cultivados a 16, 20 ou 25 °C, dependendo dos requisitos do experimento, e podem ser cultivados em mídia sólida ou líquida. Em ambos os casos eles são alimentados OP50, uma cepa padronizada de E. coli usada especificamente para a cultura nematode em todos os laboratórios de vermes ao redor do mundo.

Quando cultivados a 25 °C, c. elegans completam seu ciclo de vida 2,1 vezes mais rápido do que quando cultivado a 16 °C. Um ciclo de vida mais rápido significa que os vermes amadurecem mais rápido, colocam mais ovos e consomem mais alimentos. Se os vermes podem morrer de fome ou ficar muito lotados, eles entram em um estágio larval chamado o estágio dauer. Larvas dauer são resistentes ao estresse e não envelhecem.

Quando mantidos em mídia sólida, C. elegans são cultivados em placas de ágar preparadas com mídia de crescimento nematode ou mídia NGM. Um dia antes de fazer placas, inoculado mídia lb líquido com uma única colônia de OP50 E. coli. Incubar a mídia a 37 °C durante a noite com agitação.

Para fazer mídia sólida, meça e combine as quantidades apropriadas desses ingredientes com água deionizada em um frasco de Erlenmeyer.

Depois de autoclaving por pelo menos 15 minutos, deixe o ágar esfriar a 55 °C em um banho de água. Uma vez que a mídia tenha esfriado a 55 °C, você deve ser capaz de segurar confortavelmente o recipiente de vidro com as mãos nuas. Usando técnica asséptica adequada, aditivos como drogas ou antibióticos podem ser adicionados neste momento. Redemoinho para misturar. Em seguida, pipeta fundida NGM em placas de Petri até que estejam 2/3 cheias. Deixe as placas recém-feitas secarem no banco durante a noite.

Na manhã seguinte, pelota o OP50 a 3500 x g por 10 minutos e, em seguida, resuspende a bactéria em mídia LB para uma concentração de 10X. Agora, pipeta um gramado central em cada prato. Evite tocar na ponta da tubulação na superfície do NGM e tome cuidado para não permitir que a cultura toque nas paredes da placa. Deixe as placas secarem no banco durante a noite. Uma vez seco, exponha as placas à luz UV para esterilizá-las. Eles estão agora prontos para serem usados quando os vermes.

C. elegans são manipulados individualmente usando uma ferramenta conhecida como a picareta de vermes. A picareta é tipicamente feita de 30 bitola 90% de platina e 10% de fio de irídio, embora alguns pesquisadores possam preferir composições metálicas ligeiramente diferentes. Para fazer uma escolha, comece quebrando a ponta de uma tubulação Pasteur para o comprimento preferido.

Corte cerca de 3 a 4 cm de arame e coloque 0,5 cm dele dentro da ponta da tubulação. Sele o fio no vidro sobre um queimador Bunsen. O comprimento do fio saliente do vidro é de cerca de 3 a 3,5 cm, mas pode variar de acordo com as preferências individuais.

Achate a extremidade do fio usando uma borda dura. Em seguida, dobre a porção achatada para cima para formar uma colher. Finalmente, lixe as bordas da picareta para evitar danificar o verme ou o ágar.

Para colher vermes esterilizar o fio da pega em uma chama. Em seguida, cubra a ponta com op50 E. coli grossa e pegajosa a partir de uma placa NGM. Use o cuidado para não perfurar ou cicatrizar a superfície do ágar.

Enquanto olha através de um escopo de dissecção, levemente colher o verme no achatado, pegajoso até que o verme grude na escolha.

Uma vez que o verme esteja na picareta, transfira imediatamente segurando levemente a ponta para a nova superfície de uma nova placa e deslizando-a através do gramado bacteriano. O verme deve rastejar para fora da picareta. O verme não deve ficar na picareta por muito tempo ou pode secar.

Uma das razões pelas quais C. elegans é um modelo popular para a pesquisa é porque as culturas podem ser armazenadas por longos períodos de tempo sem qualquer efeito adverso.

Primeiro, lave larvas recém-famintas usando tampão M9 de 0,5 ml, gire suavemente para soltar todas as larvas e animais adultos e, em seguida, transfira para um microcentrifuge ou criotube. Em seguida, adicione a quantidade igual de 30% de glicerol no Buffer M9. Por fim, embale o frasco em uma caixa isolada e armazene a -80 °C.

Para recuperar os vermes, remova o tubo de um congelador -80 e deixe descongelar à temperatura ambiente até que o conteúdo derreta completamente. Pipete o líquido em uma placa NGM fresca com gramado OP50 e incubar a 20 °C. Após 2-3 dias, transfira 10-15 animais para uma nova placa e permita que eles se reproduzam por uma geração. Colete a descendência e marque para fenótipos corretos.

Agora que vimos como C. elegans é mantido no laboratório, vamos dar uma olhada em como as condições de alimentação, habitação e manuseio são modificadas para experimentos.

A descoberta vencedora do Nobel da interferência do RNA permitiu que os pesquisadores silenciem qualquer gene C. elegans, a fim de determinar sua função.

Podemos induzir RNAi em C. elegans preparando primeiro placas com E. coli que expressam gene dsRNA, que os vermes vão comer.

Em seguida, vermes de estágio 4 são transferidos para as placas RNAi e autorizados a colocar ovos. Na fase desejada de desenvolvimento, a prole é coletada e pontuada para fenótipos. Uma vez que compartilhamos cerca de metade do nosso genoma com o verme muitos dos insights obtidos são aplicáveis à doença humana.

Por causa de seu ciclo de vida rápido, C. elegans é particularmente adequado como um modelo de envelhecimento.

Primeiro, uma população sincronizada de C. elegans é gerada, permitindo que hermafroditas adultas coloquem ovos em placas de NGM. Os vermes colocam ovos por 6-8 horas e depois são removidos.

Quando os vermes estão na fase desejada, são transferidos para novas placas de NGM contendo ampicillina para evitar contaminação bacteriana e FUDR para evitar a reprodução.

A partir deste ponto, vermes adultos são observados a cada 2-3 dias até que todos os vermes tenham morrido. Vermes mortos são removidos da placa e o número de vermes vivos e mortos são registrados.

Analisar o tempo de vida no contexto de insultos genéticos ou ambientais pode produzir insights significativos sobre o processo de envelhecimento.

Usando lasers é possível realizar axotomias ou o corte de axônios individuais, em C. elegans vivos para estudar como as células nervosas se regeneram.

Mas, como os vermes nunca ficam parados, eles são colocados em almofadas 10% agarose em solução de microesferas. Um deslizamento de cobertura é colocado em cima. As microesferas aumentam o coeficiente de atrito da interação pad-coverslip, efetivamente congelando o verme no lugar.

O slide está preparado para realizar axotomias. Os neurônios são trazidos à vista e centrados no microscópio. O laser é então disparado usando o pedal do pé. A potência laser ideal cortará o neurônio sem prejudicar as estruturas adjacentes. O maior número possível de axônios são cortados por animal.

A almofada de agarose é então cuidadosamente removida do slide, e os vermes são autorizados a se recuperar em uma placa de NGM semeada a 20 °C. Entre 8-48 horas após a axotomia, os neurônios podem estar preparados para pontuar para a regeneração. Na parte distal do corte, o neurônio forma um toco. No entanto, na porção proximal o neurônio se regenera formando neurites alongados.

Você acabou de ver a visão do JoVE sobre a manutenção básica da Ceanorhabditis Elegans. Neste vídeo revisamos: habitação e alimentação de C. elegans, manuseio deles, congelamento e recuperação de nematoides.

Também fizemos um breve tour por alguns aplicativos que fazem de C. elegans uma ferramenta de pesquisa tão poderosa. Embora C. elegans sejam diferentes dos mamíferos em muitos aspectos, sua composição genética semelhante, facilidade de manutenção e manipulação simples fazem deles um modelo importante na busca pela compreensão da biologia e da doença dos mamíferos. Obrigado por assistir!

Transcript

Correct care and maintenance of Caenorhabditis elegans is essential for successful experiments.

They require very little space, are cheap to house, have high fecundity, and are easy to manipulate. But just because they are simple to keep around does not mean wimpy science. In fact, Sydney Brenner famously called C. elegans “Nature’s gift to science,” and since its introduction in 1974 the worm has been featured in a number of Nobel prize winning experiments.

In this video we will demonstrate basic methods for maintaining C. elegans in the lab, including: housing and feeding, handling, as well as freezing and thawing of worms.

In the wild, C. elegans are found in the soil and feed upon decomposing plant matter. In the lab, it’s important to keep nematodes as happy as possible, and so we house and feed them using very specific methods.

C. elegans can be grown at 16, 20, or 25 °C depending upon the requirements of the experiment, and can either be grown on solid or in liquid media. In both cases they are fed OP50, a standardized strain of E. coli used specifically for nematode culture in every worm lab around the world.

When grown at 25 °C, C. elegans complete their life cycle 2.1 times faster than when grown at 16 °C. A faster life cycle means the worms mature faster, lay more eggs and consume more food. If worms are allowed to starve or become too crowded they enter a larval stage called the dauer stage. Dauer larvae are stress resistant and do not age.

When maintained on solid media, C. elegans are grown on agar plates prepared with nematode growth media or NGM media. The day before making plates, inoculate liquid LB media with a single colony of OP50 E. coli. Incubate the media at 37 °C overnight with shaking.

To make solid media, measure and combine the appropriate amounts of these ingredients with deionized water in an Erlenmeyer flask.

After autoclaving for at least 15 minutes, let the agar cool to 55 °C in a water bath. Once the media has cooled to 55 °C you should be able to comfortably hold the glass container with bare hands. Using proper aseptic technique, additives like drugs or antibiotics can be added at this time. Swirl to mix. Then, pipette molten NGM into Petri plates until they are 2/3 full. Let the newly made plates dry on the bench overnight.

The next morning pellet the OP50 at 3500 x g for 10 minutes and then resuspend the bacteria in LB media to a 10X concentration. Now, pipette a central lawn onto each plate. Avoid touching the pipet tip to the surface of the NGM and take care not to allow the culture to touch the plate walls. Leave plates to dry on the bench overnight. Once dry, expose plates to UV light to sterilize them. They are now ready to be used when culturing worms.

C. elegans are individually manipulated using a tool known as the worm pick. The pick is typically is made from 30 gauge 90% platinum and 10% iridium wire, though some researchers may prefer slightly different metal compositions. To make a pick, start by breaking the tip of a Pasteur pipet to the preferred length.

Cut about 3 to 4 cm of wire and place 0.5 cm of it inside the tip of the pipet. Seal the wire to the glass over a Bunsen burner. The length of the wire protruding from the glass is about 3 to 3.5 cm but can vary according to individual preferences.

Flatten the end of the wire using a hard edge. Then bend the flattened portion upward to form a scoop. Finally, sand the edges of the pick to prevent damaging the worm or the agar.

To pick worms sterilize the wire of the pick on a flame. Then coat the tip with thick, sticky OP50 E. coli from an NGM plate. Use care to not puncture or scar the agar surface.

While looking through a dissection scope, lightly scoop the worm onto the flattened, sticky pick until the worm sticks to the pick.

Once the worm is on the pick, immediately transfer by lightly holding the tip to the new surface of a new plate and sliding it across the bacterial lawn. The worm should crawl off the pick. The worm should not stay on the pick for too long or it might dry out.

One of the reasons why C. elegans is a popular model for research is because cultures can be stored for long periods of time without any adverse effect.

First, wash freshly starved larvae using 0.5 ml M9 Buffer, gently swirl to loosen all larva and adult animals, and then transfer to a microcentrifuge or cryotube. Then, add equal amount 30% glycerol in M9 Buffer. Finally, pack the vial into an insulated box and store at -80 °C.

To recover worms, remove the tube from a -80 freezer and let thaw at room temperature until the contents fully melt. Pipette the liquid onto a fresh NGM plate with OP50 lawn and incubate at 20 °C. After 2-3 days, transfer 10-15 animals to a new plate and allow them to reproduce for one generation. Collect the progeny and score for correct phenotypes.

Now that we’ve seen how C. elegans is maintained in the lab, let’s have a look at how feeding, housing, and handling conditions are modified for experiments.

The Nobel winning discovery of RNA interference allowed researchers to silence any C. elegans gene in order to determine its function.

We can induce RNAi in C. elegans by first preparing plates with E. coli that express target gene dsRNA, which the worms will eat.

Then 4th larval stage worms are transferred to the RNAi plates and allowed to lay eggs. At the desired stage of development the progeny are collected and scored for phenotypes. Since we share about half of our genome with the worm many of the insights gleaned are applicable to human disease.

Because of its quick life-cycle, C. elegans is particularly well suited as a model of aging.

First, a time-synchronized population of C. elegans is generated, by allowing adult hermaphrodites to lay eggs on NGM plates. The worms lay eggs for 6-8 hr and then are removed.

When worms are at the desired stage they are transferred to new NGM plates containing ampicillin to prevent bacterial contamination and FUDR to prevent reproduction.

From this point forward adult worms are observed every 2-3 days until all worms have died. Dead worms are removed from the plate and the number of live and dead worms are recorded.

Analyzing life span in the context of genetic or environmental insults can yield significant insights into the aging process.

Using lasers it is possible to perform axotomies or the cutting of individual axons, in live C. elegans to study how nerve cells regenerate.

But, because worms never keep still, they are placed on 10% agarose pads in solution of microbeads. A cover slip is placed on top. The microbeads increase the coefficient of friction of the pad-coverslip interaction, effectively freezing the worm in place.

The slide is now prepared for performing axotomies. The neurons are brought into view and centered on the microscope. The laser is then fired using the foot pedal. Optimum laser power will sever the neuron without harming adjacent structures. As many axons as possible are cut per animal.

The agarose pad is then carefully removed from the slide, and worms are allowed to recover on a seeded NGM plate at 20 °C. Between 8-48 hr after the axotomy, the neurons can be prepared to score for regeneration. At the distal part of the cut, the neuron forms a stump. However, at the proximal portion the neuron regenerates forming elongated neurites.

You’ve just watched JoVE’s take on basic Ceanorhabditis elegans maintenance. In this video we reviewed: housing and feedings of C. elegans, handling them, and freezing and recovery of nematodes.

We also took a brief tour through some applications that make C. elegans such a powerful research tool. Although C. elegans are dissimilar to mammals in many ways, their similar genetic makeup, ease of maintenance, and simple manipulation make them an important model in the quest for understanding mammalian biology and disease. Thanks for watching!