Ensaio de quimiotaxia com C. elegans

<em>C. elegans</em> Chemotaxis Assay

JoVE Science Education
Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

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JoVE Science Education Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans

C. elegans Chemotaxis Assay

3.1: C. elegans Development and Reproduction

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08:57 min

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May 10, 2013

Overview

A quimiotaxis é um processo no qual células ou organismos se movem em resposta a um estímulo químico. Na natureza, a quimiotaxis é importante para que os organismos sentem e se movam em direção às fontes alimentares e se afastem de estímulos que possam ser tóxicos ou prejudiciais. A quimiotaxis também é importante no nível celular. Por exemplo, a quimitaxis é necessária para o movimento do esperma em direção a um óvulo antes da fertilização. No laboratório, a quimiotaxis é frequentemente examinada no nematode, C. elegans, que é conhecido por migrar para fontes de alimento no solo, mas longe de toxinas como metais pesados, substâncias com pH baixo e detergentes. Este vídeo demonstra como realizar um ensaio de quimiotaxis, que inclui preparar as placas de quimiotaxis e os worms, executar o ensaio e analisar os dados. Em seguida, discutimos exemplos de como os ensaios de quimiotaxis podem ser usados em C. elegans como uma ferramenta para entender o aprendizado e a memória, adaptação olfativa e doenças neurológicas como a doença de Alzheimer. Experimentos de quimiotaxis em C. elegans têm possibilidades quase ilimitadas de aprender mais sobre os mecanismos celulares e genéticos de muitos processos biológicos, e podem levar a uma maior compreensão da biologia humana, desenvolvimento e doenças.

Procedure

O movimento de uma célula ou organismo em resposta a um estímulo químico é um comportamento chamado quimiotaxis. Neste vídeo, aprenderemos como realizar um ensaio de quimiotaxis usando o nematode, C. elegans. Também discutiremos como os ensaios de quimiotaxis em C. elegans são aplicados para estudar aprendizado e memória, adaptação olfativa e doença de Alzheimer.

Vamos primeiro discutir dois tipos diferentes de quimiotaxis. O movimento em direção a um estímulo químico é chamado de quimiotaxis positivos. Em contraste, o movimento longe de um estímulo químico é chamado de quimipetaxis negativos, permitindo que os organismos se afastem de produtos químicos nocivos.

A quimiotaxis pode ocorrer no nível do organismo, à medida que os organismos se movem em direção a uma fonte de alimento. A quimiotaxis também ocorre no nível celular, dentro dos organismos. Por exemplo, as células imunes migram em direção a patógenos ou locais de inflamação. Em outro exemplo, as células espermatozoides se movem em direção ao óvulo em resposta a um quimio-atrativo liberado pelo óvulo. A quimitaxis também é um processo importante durante o desenvolvimento, no qual as células migram em resposta a um estímulo químico, formando tecidos e órgãos no organismo em desenvolvimento.

Para c. elegans selvagens, que habitam o solo, a quimiotaxis é importante para a detecção e o movimento em direção às bactérias, sua principal fonte de alimento. Em contraste, os C. elegans são repelidos por metais pesados, substâncias com pH baixo, e detergentes, que são tóxicos para o organismo.

Os ensaios de quimiotaxis geralmente começam preparando placas de quimiotaxis. Usando uma régua e um marcador, divida uma placa de 5 cm com meio de crescimento nematoide em quatro quadrantes iguais. Em seguida, desenhe um círculo com um raio de 0,5 cm ao redor do centro do quadrante. Este será o ponto de partida para os vermes. Marque e rotule um ponto em cada quadrante, de tal forma que cada ponto seja equidistante do centro, e um do outro.

Ao preparar vermes para o ensaio, é fundamental usar vermes adultos jovens sincronizados de idade para que as diferenças na quimiotaxis não sejam um artefato do estágio de desenvolvimento. Uma vez sincronizados os worms, colete-os primeiro pipetting 2 ml de tampão S-basal em uma placa contendo adultos jovens. Gire e incline o prato para lavar os vermes da placa.

Em seguida, pipete a solução worm/S-basal em um tubo de microcentrifuuge. Lave os vermes centrifugando brevemente a solução worm/S-basal, removendo o supernatante e adicionando outro mililitro de solução S-basal à pelota de minhoca. Inverta o tubo e repita a lavagem mais duas vezes. Após a lavagem, remova todos, exceto aproximadamente 100 μl da solução S-basal. Em seguida, adicione 2 μl da mistura worm/S-basal a uma placa NGM. Usando um microscópio, conte o número de vermes presentes. Idealmente, haverá entre 50-250 vermes por 2 μl de S-basal.

Agora que as placas de quimiotaxis e os vermes estão prontos, podemos começar o ensaio de quimiotaxis. Primeiro, misture volumes iguais da sua solução de teste com 0,5 M de azida de sódio, um anestésico que irá paralisar os vermes assim que chegarem ao seu destino. Faça o mesmo com sua solução de controle. Em seguida, pipeta 2 μl de mistura worm/S-basal no centro da placa de quimioterapia. Em seguida, pipeta 2 μl da solução de teste ou controle e coloque em pontos devidamente rotulados na placa de quimioterapia. Uma vez absorvidas as soluções de teste e controle, coloque a tampa novamente, inverta a placa e reserve um temporizador por 1 hora.

Depois que os vermes tiverem uma hora para responder aos estímulos químicos na placa, os dados podem ser analisados. Conte manualmente o número de vermes dentro de cada quadrante. Se os vermes forem atraídos para o teste químico, haverá mais vermes presentes nesses quadrantes. Se forem neutros em relação a esse produto químico, os vermes estarão presentes em cada quadrante igualmente.

Use esses dados para calcular o índice quimotactic, que é o número de vermes nos quadrantes de teste menos o número de vermes no quadrante de controle, dividido pelo número total de vermes. Um índice quimotactic próximo a +1 sugere atração, enquanto um índice quimotactic próximo a -1 indica repulsa.

Agora que aprendemos a montar um ensaio de quimiotaxis, vamos dar uma olhada em como esses experimentos são aplicados para responder a perguntas científicas.

Uma das formas de fazer ensaios de quimiotaxis em C. elegans é para estudar a aprendizagem e a memória. Por exemplo, os vermes podem ser condicionados a associar um estímulo químico com uma fonte de alimento. Vermes bem alimentados estão famintos por uma hora, e então eles são condicionados com comida, bem como um produto químico como butanone.

Em seguida, os vermes são mantidos em um prato com comida, mas sem butanone. Executar um ensaio de quimioterapia determinará então se os vermes aprenderam a associar butanone com comida. Muitas variações deste experimento podem ser realizadas para determinar outras informações, como quais genes ou neurônios são importantes para o aprendizado e a memória.

A adaptação olfativa é um fenômeno que ocorre quando os neurônios sensoriais diminuem sua resposta a um estímulo ao longo do tempo, permitindo que o animal responda a outros estímulos, possivelmente mais importantes. Por exemplo, os tipos selvagens C. elegans expostos a um odor por um período de tempo, ignorarão esse odor durante um ensaio de quimioterapia devido à adaptação olfativa, em vez de serem atraídos por ele. Portanto, telas genéticas de alto rendimento podem ser realizadas para revelar os reguladores genéticos da adaptação olfativa, como o egl-4. Além disso, vermes transgênicos expressando proteínas fluorescentes marcadas podem ser observados para alterações na localização durante a adaptação olfativa.

Finalmente, os ensaios de quimiotaxis podem ser usados em C. elegans para estudar a doença de Alzheimer. Os cientistas podem expressar peptídeo beta amiloide masculino marcado fluorescente – uma marca registrada da doença de Alzheimer – nos neurônios de C. elegans. Curiosamente, ensaios de quimiotaxis revelaram que vermes expressando beta amiloide em uma população de neurônios mostram quimiotaxis reduzidas em relação a um quimio-atrativo em comparação com o controle. Muitas variações deste experimento poderiam ser realizadas, incluindo expressar beta amiloide em outras populações de neurônios ou tecidos, ou determinar se quaisquer compostos podem aliviar os efeitos da expressão beta amiloide, levando, em última instância, a uma terapia potencial.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à chemotaxis em C. elegans. Primeiro, definimos o que é quimiotaxis e por que é importante na natureza para organismos e células. Então demonstramos como realizar um ensaio de quimioterapia com C. elegans. Finalmente, discutimos como a quimiotaxis pode ser aplicada para entender o aprendizado e a memória, adaptação olfativa e doença de Alzheimer. Obrigado por assistir!

Transcript

The movement of a cell or organism in response to a chemical stimulus is a behavior called chemotaxis. In this video, we will learn how to perform a chemotaxis assay using the nematode, C. elegans. We will also discuss how chemotaxis assays in C. elegans are applied to study learning and memory, olfactory adaptation, and Alzheimer’s disease.

Let’s first discuss two different types of chemotaxis. Movement toward a chemical stimulus is called positive chemotaxis. In contrast, movement away from a chemical stimulus is called negative chemotaxis, allowing organisms to move away from harmful chemicals.

Chemotaxis can occur at the organismal level, as organisms move toward a food source. Chemotaxis also takes place at the cellular level, within organisms. For example, immune cells migrate toward pathogens or sites of inflammation. In another example, sperm cells move toward the egg in response to a chemo-attractant released by the egg. Chemotaxis is also an important process during development, in which cells migrate in response to a chemical stimulus, forming tissues and organs in the developing organism.

For wild, soil-dwelling C. elegans, chemotaxis is important for detection and movement toward bacteria, their main food source. In contrast, C. elegans are repelled by heavy metals, substances with a low pH, and detergents, which are toxic to the organism.

Chemotaxis assays typically begin by preparing chemotaxis plates. Using a ruler and a marker, divide a 5 cm plate with nematode growth medium into four equal quadrants. Then, draw a circle with a 0.5 cm radius around the center of the quadrant. This will be the starting point for the worms. Mark and label a point in each quadrant, such that each point is equidistant from the center, and from each other.

When preparing worms for the assay, it’s critical to use age synchronized young adult worms so that differences in chemotaxis are not an artifact of the developmental stage. Once worms are synchronized, collect them by first pipetting 2 ml of S-basal buffer onto a plate containing young adults. Swirl and tilt the dish to wash the worms from the plate.

Next, pipette the worm/S-basal solution into a microcentrifuge tube. Wash the worms by briefly centrifuging the worm/S-basal solution, removing the supernatant, and adding another milliliter of S-basal solution to the worm pellet. Invert the tube and repeat the wash two more times. After washing, remove all but approximately 100 μl of the S-basal solution. Next, add 2 μl of the worm/S-basal mixture to an NGM plate. Using a microscope, count the number of worms present. Ideally, there will be between 50-250 worms per 2 μl of S-basal.

Now that the chemotaxis plates and the worms are ready, we can get started on the chemotaxis assay. First, mix equal volumes of your test solution with 0.5 M sodium azide, an anesthetic that will paralyze worms once they reach their destination. Do the same with your control solution. Next, pipette 2 μl of worm/S-basal mixture onto the center of your chemotaxis plate. Then, pipette 2 μl of the test or control solution and place on appropriately labeled points on the chemotaxis plate. Once the test and control solutions have been absorbed, place the lid back on, invert the plate, and set a timer for 1 hour.

After the worms have been given one hour to respond to the chemical stimuli on the plate, the data can be analyzed. Manually count the number of worms within each quadrant. If the worms are attracted to the test chemical, there will be more worms present in those quadrants. If they are neutral towards that chemical, worms will be present in each quadrant equally.

Use these data to calculate the chemotactic index, which is the number of worms in the test quadrants minus the number of worms in the control quadrant, divided by the total number of worms. A chemotactic index close to +1 suggests attraction, while a chemotactic index close to -1 indicates repulsion.

Now that we’ve learned how to set up a chemotaxis assay, let’s have a look at how these experiments are applied to answer scientific questions.

One of the ways chemotaxis assays in C. elegans have been applied is for studying learning and memory. For example, worms can be conditioned to associate a chemical stimulus with a food source. Well-fed worms are starved for one hour, and then they are conditioned with food, as well as a chemical such as butanone.

Next, the worms are held on a plate with food, but without butanone. Running a chemotaxis assay will then determine whether the worms have learned to associate butanone with food. Many variations of this experiment can be performed to determine other information such as which genes or neurons are important for learning and memory.

Olfactory adaptation is a phenomenon that occurs when sensory neurons decrease their response to a stimulus over time, allowing the animal to respond to other, possibly more important, stimuli. For example, wild-type C. elegans exposed to an odor for a period of time, will ignore that odor during a chemotaxis assay due to olfactory adaptation, rather than be attracted to it. Therefore, high throughput genetic screens can be performed to reveal the genetic regulators of olfactory adaptation, such as egl-4. Additionally, transgenic worms expressing fluorescently tagged proteins can be observed for changes in localization during olfactory adaptation.

Finally, chemotaxis assays can be used in C. elegans to study Alzheimer’s disease. Scientists can express fluorescently tagged human amyloid beta peptide – a hallmark of Alzheimer’s disease – in the neurons of C. elegans. Interestingly, chemotaxis assays revealed that worms expressing amyloid beta in a population of neurons show reduced chemotaxis towards a chemo-attractant compared to the control. Many variations of this experiment could be performed, including expressing amyloid beta in other neuron populations or tissues, or determining whether any compounds can alleviate the effects of amyloid beta expression, ultimately leading to a potential therapy.

You’ve just watched JoVE’s introduction to chemotaxis in C. elegans. First, we defined what chemotaxis is and why it is important in nature for organisms and cells. Then we demonstrated how to perform a chemotaxis assay with C. elegans. Finally, we discussed how chemotaxis can be applied to understand learning and memory, olfactory adaptation, and Alzheimer’s disease. Thanks for watching!

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