Name: Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 53 s
Description: Aprenda a cultivar e dispensar cepas fluorescentes de C. elegans para triagem de alto rendimento e detecção de contaminantes ambientais. Este método permite medir mudanças na expressão gênica em tempo real usando repórteres duplos GFP e RFP.

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C. elegans transgenes foram fornecidos pelo Centro de Genética Caenorhabditis (University of Minnesota, Minneapolis, MN). Este trabalho foi financiado pelo NIH R21 conceder NS0667678-01 a KS. Todos os autores participaram da coleta, análise e interpretação dos dados. CKL, KS, e KPC participaram da elaboração e revisão do manuscrito.

1. Preparação de comida de verme bacteriana 1 dia <ol><li> Adicionar 5 ml de E. saturada coli ml caldo de cultura bacteriana OP50 a 500 Terrific suplementado com estreptomicina 50 mg / ml e crescer em uma incubadora de agitação (225 rpm) durante a noite a 37 ° C. </li></ol> Dia 2 <ol start="2"><li> Dividir a cultura de bactérias durante a noite em dez tubos de 50 ml e bactérias centrífuga em uma centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 minutos. </li><li> Decantar caldo LB e ressuspender cada pellet de bactérias em 10 ml de líquido media nematóide de crescimento (NGM). Agitar horizontalmente em um piso shaker por 15 minutos para voltar a suspender as bactérias. Para fazer tampão NGM, adicionar 3 g de NaCl a 1 L de água deionizada e autoclave. Esfriar a 55 ° C e adicionar em ordem as seguintes soluções estéreis: 1 ml de CaCl 2 1 M, 1 ml de 1 M MgSO 4, e 25 ml de fosfato de potássio 1 M, pH 6,0. </li><li> Centrifugar a cultura bacteriana em uma centrífuga refrigerada a 2500 rcf durante 20 minutos. </li><li> Decantar tampão NGM e pesar o pellet bacteriano. </li><li> Adicionar um volume igual de tampão NGM para ressuspender as pelotas, alíquota de 3 ml de bactérias se concentrar em tubos de 15 ml, e armazenar a -20 ° C. </li></ol> 2. Grande escala C. elegans cultura líquida Nós usamos uma linhagem transgênica VP596 (dvIs19 [pAF15 (gst-4:: GFP:: NLS)]; vsIs33 [dop-3:: RFP]) carregando duas construções fluorescente: Pgst -4:: GFP 14 para monitorar SKN-1 atividade e PDOP-3:: RFP 17 para servir como um padrão para a normalização de número worm. 1 dia <ol><li> Misture 150 ml NGM buffer, 1,5 ml de caldo LB, 150 mL de 5 mg de colesterol / ml (em etanol) e 75 mL de estreptomicina 100 mg / ml. Filtro de esterilizar a mistura e adicionar a um frasco de 1 litro estéril. NOTA: A adição de caldo LB 1% para tamponar NGM ajuda a evitar worms de degola para copos e plasticware, mas este montante não é suficiente para suportar o crescimento de bactérias. </li><li> Sincronizar worms com o procedimento padrão de hipoclorito de 18. Até 0,5 ml de vermes gravídico pode ser processado em um tubo única de 15 ml com 5 ml de solução de hipoclorito (3,75 ml de água estéril, uma lixívia ml, e 250 mL NaOH 10 N). Lave os ovos liberados com água estéril e ressuspender-los em 10 ml de tampão NGM. </li><li> Diluir uma amostra do ovos 100 vezes na NGM buffer (por exemplo, 100 l em 10 ml) e contar o número de ovos em três diferentes alíquotas 5 mL. Múltiplos, o número médio de 200.000 (cem fator de diluição x 2.000) para estimar o número total de ovos. </li><li> Adicionar 200 mil para 2 milhões de ovos para o frasco com tampão NGM e agitar a cultura em 100 rpm a 20 ° C. </li></ol> Dia 2 <ol start="5"><li> Pelo menos 16 h após a adição de ovos para o balão, use uma pipeta estéril sorológica para remover cerca de 0,5 ml da cultura verme suspenso. Pipetar 5 gotas três mL para a tampa estéril de uma placa de Petri. Coloque a tampa em um freezer -20 ° C por 1-2 minutos para paralisar worms. Conte o número médio de filhos nascidos worms por 5 mL e, em seguida, vários por 30.000 (150 ml / 5 mL) para estimar o número total de vermes nascidos. </li><li> Descongelar um tubo de cultura bacteriana OP50 congelados (Protocolo 1.6) e adicionar 3 ml de 50% OP50 na cultura verme por 500.000 nascidos worms. Agitar o frasco a 100 rpm a 20 ° C. Vermes vão se desenvolver em larvas L4 e jovens adultos em cerca de 51 horas. O OD600 de bactérias deve ser cerca de 2,200 no início. Monitorar a quantidade de bactérias por absorbância e adicionar mais se o OD cai abaixo de 0,900 600. </li></ol> 3. Coleta e distribuição Worm Dia 4 <ol><li> Use uma pipeta estéril sorológica para transferir cerca de 0,5 ml da cultura verme suspensos a uma placa padrão NGM agar. Ver os vermes com uma lupa para se certificar de que a maioria são L4 larvas ou adultos jovens. L4 larvas terá um ponto ventral clara no meio do corpo. Jovens adultos será um pouco maior e não terá um ponto claro. </li><li> Despeje a cultura verme em tubos de 50 ml estéril e colocar os tubos em um rack tubo de ensaio sobre a bancada. Permitir que os vermes que se contentar com cerca de 10 minutos. Retire o sobrenadante por aspiração ou pipetagem. NOTA: Esta etapa pode ser importante para remover os ovos unhatched ou worms que não se desenvolveu porque eles vão resolver mais lento do que L4 larvas e adultos jovens. </li><li> Colete todos os worms em um único tubo de 50 ml e lavar com tampão NGM com caldo LB 1% (NGM LB +) 3-4 vezes para remover bactérias. NOTA: Este é o melhor feito em uma centrífuga balançando-balde, recolhendo worms a 500 rcf durante 30 seg e substituindo o sobrenadante com NGM fresco + tampão LB. </li><li> Após a lavagem, encher o tubo com NGM + tampão LB a 50 ml e despeje em um frasco personalizado verme dispensa. Adicionar uma barra de agitação e mexa para manter os worms suspenso. º Condenúmero de vermes e em três mL 5 gotas como indicado acima. Diluir com NGM LB + até chegar 12-15 worms por 5 mL queda (~ 2,5-3,0 worms / mL). NOTA: Um mínimo de cerca de 20 ml (60.000 worms) é necessário para preencher o espaço morto do recipiente de dispensação e cassete dispenser. Cada placa 384 poços requer cerca de 35 mil worms ou 11,5 ml de vermes suspenso. </li><li> Carga de 10 mL de cassetes de dispensação e esterilizar em priming com etanol 70%. Enxaguar o etanol por priming com água estéril. </li><li> Insira a extremidade do cassete de distribuição para o balão de modo que seja logo acima da barra mexa sem interromper seu movimento. Certifique-se que os vermes continuam suspensas em todo o frasco inteiro. Programa o dispensador para dispensar a baixa velocidade com 2 pré-pulsos. Primeiro e executar pelo menos 10 ml de vermes suspenso. Preencha placas conforme necessário rapidamente para evitar que os vermes de se estabelecer na tubulação. </li><li> Selar as placas com fita respirável. </li><li> Coloque as placas em uma plataforma de agitação em uma incubadora à temperatura adequada para o seu ensaio. Não empilhar os pratos. </li></ol> 4. Análise de fluorescência <ol><li> Coloque a placa de alvo em um leitor de microplacas para medir a intensidade de fluorescência de cada bem com o comprimento de onda de emissão e excitação apropriada (Filtros para o nosso ensaio: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em). </li><li> Calcular a proporção de GFP / RFP e normalizar com as leituras dos poços de controlo (sem composto ativar) para determinar a diferença exata dobra da intensidade de fluorescência derivados de tratamentos individuais. </li></ol> 5. Resultados representativos: Nosso SKN-1 ensaio utiliza uma cepa repórter cromossomicamente integrado dual (VP596). Conforme mostrado na Figura 1, o número de vermes é bem correlacionada com o volume dispensado. Como mostrado nas Figuras 2A e 2B, GFP total e RFP fluorescência por poço é altamente reprodutível de bem para o bem através de uma placa de 384 poços. Conforme mostrado na Figura 2C, un induzida Pgst-4:: GFP fluorescência é linearmente correlacionada com PDOP-3:: RFP em 384 poços. Quando expresso como uma razão de GFP / RFP, fluorescência torna-se altamente reprodutível de bem para o bem através de uma placa de 384 poços (compare o coeficiente de variação da Figura 2D para 2A), demonstrando a capacidade do PDOP-3:: RFP repórter para reduzir a variabilidade. Conforme mostrado na Figura 3, a indução de boas práticas agrícolas em relação a RFP com uma SKN-1 ativando xenobióticos (38 mM juglone) é robusto e altamente reprodutível através de uma placa de 384 poços. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Número de worms versus volume dispensado. Worms foram diluídas a cerca de 2/μl e dispensado em uma placa de 24 poços para a contagem manual com um estereomicroscópio. N = 8 poços por volume. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Fluorescência total de worms dispensado em uma placa de 384 poços é reproduzível. Worms foram diluídas a cerca de 2.5/μl mL e 30 foi dispensado em cada poço de uma placa 384 poços. GFP (A) e RFP fluorescência (B) de todos os poços tiveram um coeficiente de variação abaixo de 9%. (C) de fluorescência da GFP é altamente correlacionada com a RFP fluorescência. (D) Cálculo da proporção de GFP para RFP reduziu o coeficiente de variação abaixo de 6% (A, B e D) As linhas contínuas indicam os meios e linhas quebradas indicam três desvios-padrão acima ou abaixo da média. <img src="/files/ftp_upload/2745/2745fig3.jpg" alt="Figura 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 3"> . Figura 3 Ativação do Pgst-4:: GFP é robusta e consistente. Aproximadamente 75 L4 worms foram dispensados ​​em todos os poços de uma placa de 384 poços e 38 juglone mM foi adicionado em cada outra coluna. GFP e RFP fluorescência foi medida após 21 h de incubação. A média relativa de fluorescência de todos os índices de controle (1.0) e juglone poços (8.9) são marcadas com linhas sólidas. Três desvios padrão acima da média dos controles e abaixo da média juglone são marcados com linhas quebradas.

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</ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Nós apresentamos um método para cultivo e distribuição de um grande número de nematóides transgênicos. O equipamento utilizado para vermes é padrão para laboratórios de clonagem molecular e da manipulação de líquidos e equipamentos de fluorescência é padrão para os laboratórios de processamento de um grande número de microplacas. Outros métodos de dispensar um grande número de viver C. elegans exigem partículas caros equipamentos de triagem 19. O Pgst-4:: ensaio de GFP pode ser usad...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome do reagente </th><th> Companhia </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentários (opcional) </th></tr><tr><td> LB </td><td> Research Products International Corp </td><td> L24066 </td><td></td></tr><tr><td> Terrific caldo </td><td> Research Products International Corp </td><td> T15100 </td><td></td></tr><tr><td> Synergy ™ HT Multi-Modo de Leitora </td><td> Biotek </td><td></td><td> Filtros: GFP 485/20ex 528/20em; RFP 540/25ex 590/35em </td></tr><tr><td> MicroFlo Dispenser Selecione </td><td> Biotek </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Worm frasco de dispensação </td><td> Southern Scientific Inc., Micanopy, FL </td><td></td><td> Personalizado montada (352) 284-2531 </td></tr><tr><td> 384 microplacas </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 5678-1209 </td><td></td></tr><tr><td> Fita de vedação respirável </td><td> Nunc </td><td> 241205 </td><td></td></tr><tr><td> (5-hidroxi-p-naphthoqinone) Juglone </td><td> ACROS </td><td> 121640010 </td><td> Juglone é dissolvido em DMSO </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D-5879 </td><td></td></tr><tr><td> C. elegans transgênicos tensão </td><td> Laboratório autor </td><td> VP596 </td><td> Pgst-4:: GFP e PDOP-3:: RFP </td></tr></tbody></table>

alto rendimento triagem e biossensoriais com fluorescente c. elegans cepas

High-throughput Screening and Biosensing with Fluorescent C. elegans Strains

High-throughput screening (HTS) é uma poderosa abordagem para a identificação de moduladores de química de processos biológicos. No entanto, muitos compostos identificados em telas usando modelos de cultura celular são encontrados frequentemente para ser tóxicos ou farmacologicamente inativas in vivo 1-2. Triagem em modelos animais inteiros pode ajudar a evitar estas armadilhas e agilizar o caminho para o desenvolvimento de drogas. C. elegans é um organismo multicelular modelo adequado para HTS. Ele é pequeno (&lt;1 mm) e pode ser economicamente cultivadas e distribuídas em líquidos. C. elegans é também um dos modelos animais mais experimentalmente tractable permitindo identificação rápida e detalhada de drogas modo-de-acção 3. Nós descrevemos um protocolo para cultivo e distribuição de linhagens fluorescentes de C. elegans para high-throughput screening de bibliotecas de química ou de detecção de contaminantes ambientais que alteram a expressão de um gene específico. Um grande número de worms developmentally sincronizado são cultivadas em cultura líquida, colhidas, lavadas e suspensas em uma densidade definida. Worms são então adicionados ao preto, de fundo chato de 384 poços placas utilizando um dispensador peristáltica líquido. Pequenas moléculas de uma biblioteca de produtos químicos ou amostras de teste (por exemplo, água, alimentos, solo ou) podem ser adicionados a poços com worms. In vivo, em tempo real intensidade de fluorescência é medida com um leitor de microplacas de fluorescência. Este método pode ser adaptado a qualquer gene induzível em C. elegans para o qual um repórter está disponível. Estresse induzível muitos caminhos e de desenvolvimento de transcrição são bem definidas em C. elegans e tensões repórter GFP transgênicos já existem em muitos deles 4. Quando combinado com os repórteres apropriado transgênicos, o nosso método pode ser utilizado para triagem de moduladores caminho ou para desenvolver robusto ensaios biosensor para os contaminantes ambientais. Demonstramos nossa C. elegans cultura e dispensando protocolo com um ensaio HTS que desenvolvemos para monitorar o C. fator &#39;n&#39; elegans cap transcrição colar SKN-1. SKN-1 e seu homólogo Nrf2 mamíferos ativar genes citoprotetora durante o estresse oxidativo e xenobióticos 50-10. Nrf2 protege mamíferos de várias doenças relacionadas à idade, tais como câncer, neurodegeneração, e inflamação crônica e se tornou um dos principais alvos quimioterápicos 11-13. Nosso ensaio é baseado em um repórter GFP transgênicos para o SKN-1 gene-alvo gst -4 14, que codifica a 6 glutationa-s-transferase. O repórter gst -4 é também um biosensor para produtos químicos xenobióticos e oxidativa que ativam SKN-1 e pode ser usado para detectar baixos níveis de contaminantes, como acrilamida e metil-mercúrio 15-16.

Um procedimento para líquidos baseados em cultura e distribuição de<em&gt; C. elegans</em&gt; Cepas que expressam proteínas fluorescentes repórter é descrito que não requer equipamento caro classificação. Esta abordagem pode ser aplicada a inúmeras induzível<em&gt; C. elegans</em&gt; Genes para a descoberta de drogas ou biosensoriamento de contaminantes.

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

A triagem de alto rendimento (HTS) é uma abordagem poderosa para a identificação de moduladores químicos de processos biológicos. No entanto, muitos compostos identificados em...

Este vídeo demonstra um método para cultivar e dispensar cepas fluorescentes de CL gans para triagem de alta produtividade de bibliotecas químicas ou detecção de contaminantes ambientais, a fim de avaliar o efeito de agentes químicos ou ambientais sobre a atividade de proteínas específicas. Em CL elgan, culturas bacterianas são inicialmente preparadas como alimento para os vermes e vermes transgênicos GFP. Vermes sincronizados são cultivados.De 0,5 a 2 milhões de vermes são então coletados, lavados e distribuídos em 3 placas microtituladoras de 84 poços, e em seguida moléculas pequenas de uma biblioteca química ou amostras de teste, como água, alimento ou solo, são adicionadas aos vermes. Por fim, a fluorescência dos vermes é medida com um leitor de microplacas.A análise de dados de intensidades de fluorescência revela moléculas pequenas que modulam vias transcritivas induzíveis ou permite a detecção de contaminantes ambientais. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como ensaios baseados em cultura celular e in vitro, é que o tempo não será desperdiçado com compostos que são tóxicos ou inativos in vivo. Este método de alto rendimento pode ajudar a identificar moléculas pequenas que modulam diversas vias induzíveis.Embora tenhamos desenvolvido este método para triagem de alto rendimento de bibliotecas de moléculas de pequeno porte, ele também pode ser aplicado à biossensoriamento de contaminantes em amostras de alimentos e ambientais. O procedimento será demonstrado por Andrew Dine, técnico do meu laboratório, e Q long, pós-doutorando do meu laboratório. Prepare com antecedência a comida bacteriana para os vermes.Inicie inoculando 500 mililitros de caldo excelente, suplementado com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina, com cinco mililitros de E. coli OP50 saturada. Coloque o cultivo em agitação e deixe crescer durante a noite a 37 graus Celsius.No dia seguinte, divida o cultivo em 10 tubos de 50 mililitros. Em seguida, coloque os tubos em uma centrífuga refrigerada e centrifugue a 2.500 RCF por 20 minutos. Após a centrifugação, re-suspenda cada pellet bacteriano em 10 mililitros de meio líquido de crescimento de nematoides ou NGM.Agite as suspensões horizontalmente. Utilize um agitador de bancada por 15 minutos para ressuspender as bactérias. Em seguida, centrifugue a cultura bacteriana a 2.500 RCF a quatro graus Celsius por 20 minutos.Decante o NGM e pese o pellet bacteriano. Em seguida, adicione um volume igual de tampão NGM e re-suspenda os pellets por vortexamento. Por fim, alíquotas de três mililitros da cultura bacteriana re-suspensa em tubos de 15 mililitros e armazene-os a menos 20 graus Celsius até que sejam necessários.Nesta demonstração, o efeito do estresse induzido pelo Xeno Duke loan sobre o fator de transcrição Sskn one será medido como exemplo. Sabe-se que o Sskn one ativa genes citoprotetores durante estresse oxidativo e xenobiótico. É preparada uma cultura em larga escala da linhagem Trenchgenic c gans VP 5 96, que carrega dois construtos fluorescentes.Os vermes VP 5 96 expressam tanto o promotor GST four que dirige a GFP, utilizada para monitorar a atividade do fator de transcrição Sskn um, quanto o promotor DOP three que dirige a RFP, utilizada como padrão para normalização do número de vermes.DOP três é o promotor de um receptor de dopamina e é expresso constitutivamente em neurônios por todo o corpo. No exemplo, dado que o xenobi lon ativa fortemente sskn um e aumenta a quantidade de GFP expressa a partir do promotor GS T quatro para preparar culturas, comece combinando 150 mililitros de tampão N NGM, 1,5 mililitros de LB 150, microlitros de colesterol um molar e 75 microlitros de estreptomicina 100 miligramas por mililitro. A adição do LB ajuda a impedir que os vermes adiram ao material de vidro e plástico, mas essa quantidade não é suficiente para sustentar o crescimento bacteriano.Filtre para esterilizar a mistura, depois transfira-a para um frasco estéril de um litro e deixe o frasco de lado para liberar os ovos de vermes adultos GR. Lave as bactérias dos vermes por centrifugação e substitua o meio NGM até que o sobrenadante fique claro. Lave os vermes uma segunda vez ressuspendendo-os em água estéril, centrifugue novamente após a rotação.Remova o sobrenadante e preencha o tubo com 3,75 mililitros de água estéril. Adicione um mililitro de água sanitária doméstica e 250 microlitros de hidróxido de sódio 10 normal, misturando imediatamente por inversão de cinco a seis vezes. Coloque o tubo em um rotador após os vermes terem sido expostos ao hipoclorito por quatro minutos.Coloque o tubo sob um microscópio estereoscópico. A maioria dos adultos deverá estar deitada. Agite o tubo vigorosamente de 15 a 20 vezes para ajudar a deitar quaisquer vermes adultos remanescentes após a lise ter ocorrido, por um total de cinco minutos; adicione água estéril até que o tubo fique cheio.Misture por inversão cinco a seis vezes para coletar os ovos. Centrifugue o tubo por um minuto a 500 RCF. Lave os ovos três vezes com Resus, suspendendo-os em 10 mililitros de água estéril, centrifugando e removendo o sobrenadante.Em seguida, dilua uma amostra de 100 microlitros dos ovos em 100 vezes, adicionando 10 mililitros de tampão NGM. Em seguida, pipete três alíquotas de cinco microlitros sobre a tampa de uma placa de Petri sob um microscópio. Conte o número de ovos em três alíquotas separadas de cinco microlitros.Para estimar o número total de ovos, adicione de 200.000 a 2 milhões de ovos ao frasco com tampão NGM e agite o cultivo a 100 rpm a 20 graus Celsius. Pelo menos 16 horas após os ovos terem sido adicionados ao frasco, utilize uma pipeta serológica estéril para remover aproximadamente 0,5 mililitros do cultivo de vermes em suspensão.Pipete três gotas de cinco microlitros sobre a tampa estéril de uma placa de Petri. Coloque a tampa em um congelador a menos 20 graus por um a dois minutos para paralisar os vermes; uma vez paralisados os vermes, conte o número médio de vermes vivos eclodidos por cinco microlitros utilizando um microscópio estereoscópico para estimar o número total.Deixe descongelar a cultura bacteriana OP 50 congelada preparada anteriormente colocando-a sobre a bancada por alguns minutos. Em seguida, adicione três mililitros de OP 50 a 50% por 500.000 vermes eclodidos. Agite o frasco a 100 RPM a 20 graus Celsius.Os vermes desenvolverão larvas L4 e estágios jovens de adultos em aproximadamente 51 horas. Monitore a quantidade de bactérias durante toda a incubação por inspeção visual. Adicione mais bactérias se o meio ficar transparente.Utilize uma pipeta serológica estéril para transferir aproximadamente 0,5 mililitros da cultura de vermes suspensa para uma placa padrão de ágar NGM. Observe os vermes com um microscópio estereoscópico para garantir que a maioria sejam larvas L4 e adultos jovens em microscopia de campo claro; as larvas L4 apresentarão uma mancha clara ventral no meio do corpo. Os adultos jovens serão ligeiramente maiores e não terão uma mancha clara.Em seguida, aspire a cultura de vermes para tubos estéreis de 50 mililitros. Coloque os tubos em um suporte para tubos de ensaio na cabine de segurança e deixe repousar para sedimentar ovos não eclodidos ou vermes que não se desenvolveram. Eles sedimentam mais lentamente do que os vermes desenvolvidos.Após 10 minutos, remova o sobrenadante, que contém vermes não eclodidos e não desenvolvidos, por aspiração, adicionando aproximadamente 10 mililitros de tampão NGM a cada pellet e suspendendo os vermes com movimentos suaves de rotação dos tubos. Reúna todos os vermes em um único tubo de 50 mililitros. Centrifugue no rotor de balde oscilante a 500 RCF por 30 segundos.Em seguida, ressuspenda os vermes em 50 mililitros de NGM com 1% de lb para lavá-los. Repita este procedimento, lavando de três a quatro vezes para remover as bactérias após a lavagem. Complete o tubo com NGM mais tampão LB até 50 mililitros.Despeje isso em um frasco personalizado para dispensação de vermes com um bastão de agitação e coloque-o em uma placa de agitação. É necessário um mínimo de cerca de 20 mililitros ou 60.000 vermes para preencher o espaço morto no frasco de dispensação e no cartucho do dispensador. Conte o número de vermes em três gotas de cinco microlitros conforme mostrado anteriormente.Após a contagem em NGM mais LB até uma concentração de 12 a 15 vermes por gota de cinco microlitros, cada placa de 84 poços requer cerca de 35.000 vermes ou 11,5 mililitros de vermes em suspensão. Carregue um cassete dispensador de 10 microlitros no dispensador e esterilize-o pré-fluindo com etanol a 70%. Enxágue o etanol pré-fluindo com água estéril.Insira a extremidade da cassete de dispensação no frasco, posicionando-a logo acima da barra de agitação, sem interferir em seu movimento. Certifique-se de que os vermes permaneçam em suspensão por todo o frasco. Programe o dispensador para liberar os vermes em baixa velocidade, com dois pulsos prévios de escorva e execute com pelo menos 10 mililitros de vermes em suspensão.Encha rapidamente as placas de microtitulação, que já devem conter os compostos em teste, para evitar que os vermes se depositem na tubulação. Aqui, o composto em teste previamente carregado na placa de microtitulação é o Due.Glow. Sobreponha as placas com fita respirável para impedir que poeira se acumule nos poços.Coloque as placas em uma plataforma agitadora dentro de um incubador na temperatura apropriada para o ensaio. Não empilhe as placas, pois isso pode restringir a circulação de ar. Coloque a placa-alvo em um leitor de microplacas para medir a intensidade de fluorescência de cada poço com os comprimentos de onda de emissão e excitação apropriados aqui.Os filtros utilizados para GFP são excitação em 485 e emissão em 528. Os filtros para RFP são excitação em 540 e emissão em 590. Após a leitura da placa, calcule a razão entre GFP e RFP e normalize com as leituras das poças controle, que não contêm o composto ativador, para determinar a diferença exata em termos de vezes da intensidade de fluorescência derivada de cada tratamento individual.O ensaio SSKN único mostrado aqui utiliza um repórter duplo integrado ao cromossomo, uma linhagem em que os vermes foram contados manualmente com um microscópio estereoscópico. O número de vermes correlacionou-se com o volume dispensado, com um valor de R quadrado de 0,94 e um valor de p inferior a 0,0001. Isso indica que o número de vermes dispensados em cada poço pode ser controlado ajustando-se o volume dispensado.A fluorescência total de GFP por poço mostrada à esquerda e a fluorescência de RFP por poço mostrada à direita são altamente reprodutíveis de poço para poço em toda uma placa de 3 84 poços nestas figuras. Os XS indicam a fluorescência relativa medida em cada poço. Linhas contínuas indicam as médias e linhas tracejadas indicam três desvios padrão acima ou abaixo da média da fluorescência de todos os poços, com um coeficiente de variação inferior a 9%. Como mostrado nesta figura, a fluorescência de GFP do promotor GST four está linearmente correlacionada à fluorescência de RFP do promotor DOP three ao longo de 3 84 poços, com um valor de R quadrado de 0,62 e um valor de p inferior a 0,0001.Portanto, o repórter RFP não indutível pode ser usado para normalizar o repórter GFP indutível. Quando expresso, a razão entre a fluorescência de GFP e RFP torna-se altamente reprodutível de poço a poço em toda uma placa de 384 poços.O cálculo da razão entre GFP e RFP reduziu o coeficiente de variação para abaixo de 6%, demonstrando a capacidade do repórter de três promotores DOP com RFP de reduzir a variabilidade, conforme mostrado aqui. A indução de GFP em relação a RFP com um xenobiótico ativador SK N um é robusta e altamente reprodutível em uma placa de 3 84 poços; as razões médias de fluorescência relativa de todos os poços controle e dlo são indicadas por linhas contínuas. Três desvios padrão acima da média do controle e abaixo da média dlo são indicados por linhas tracejadas.Uma vez dominada, a instauração de um cultivo de vermes pode ser realizada em cerca de uma hora no primeiro dia, para coleta e distribuição. A coleta de vermes pode ser feita em cerca de duas horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de iniciar com pelo menos 60.000 vermes e mantê-los em suspensão durante a distribuição. Após o desenvolvimento, seguindo este procedimento, telas com outros, por exemplo, linhagens repórter para outras vias induzíveis, podem ser realizadas com o objetivo de desenvolver moduladores para outras vias.Essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores nas áreas de triagem de alto rendimento e biossensores identificarem rapidamente moduladores de vias por moléculas pequenas ou detectarem contaminantes ambientais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar, dispensar e medir cepas fluorescentes de elegans para triagem de alto rendimento de vias transcricionais induzíveis ou para testar múltiplas amostras quanto à presença de contaminantes ambientais.

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