Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Este vídeo demonstra um método para cultivar e dispensar cepas fluorescentes de CL gans para triagem de alto rendimento de bibliotecas químicas ou detecção de contaminantes ambientais para avaliar o efeito de agentes químicos ou ambientais na atividade de proteínas específicas. Em CL elgan, as culturas bacterianas são preparadas pela primeira vez como alimento para os vermes e GFP transgênicos. Os worms sincronizados são cultivados.

0,5 a 2 milhões de vermes são então coletados, lavados e dispensados em 3 84. Placas de microtitulação de poços, pequenas moléculas de uma biblioteca química ou amostras de teste, como água, comida ou solo, são adicionadas aos vermes. Finalmente, a fluorescência dos vermes é medida com um leitor de microplacas.

A análise de dados de intensidades de fluorescência revela pequenas moléculas que modulam vias transcricionais induzíveis ou permitem a detecção de contaminantes ambientais. A principal vantagem desta técnica sobre os métodos existentes, como ensaios in vitro e baseados em cultura de células, é que o tempo não será desperdiçado em compostos tóxicos ou inativos in vivo. Este método de alto rendimento pode ajudar a identificar pequenas moléculas que modulam diversas vias induzíveis.

Embora tenhamos desenvolvido esse método para triagem de alto rendimento de bibliotecas de pequenas moléculas, ele também pode ser aplicado ao biossensoriamento de contaminantes em amostras de alimentos e ambientais. Demonstrando o procedimento estará Andrew Dine, técnico do meu laboratório e Q long, pós-doutorado do meu laboratório. Prepare comida de verme bacteriano com antecedência.

Comece inoculando 500 mililitros de caldo fantástico, suplementado com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina com cinco mililitros de e coli saturada. OP 50. Coloque a cultura em uma coqueteleira e cresça durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, divida a cultura em 10 tubos de 50 mililitros. Em seguida, coloque os tubos em uma centrífuga refrigerada e gire a 2.500 RCF por 20 minutos. Após a rotação Resus, suspenda cada pellet bacteriano em 10 mililitros de meio de crescimento de nematóides líquidos ou NGM.

Agite as suspensões horizontalmente. Um agitador de chão por 15 minutos para ressuspender as bactérias. Em seguida, centrifugue a cultura bacteriana a 2.500 RCF a quatro graus Celsius por 20 minutos.

Transvasar o NGM e pesar o sedimento bacteriano. Em seguida, adicione um volume igual de tampão NGM e ressuspenda os pellets por vórtice. Finalmente, aliquotar três mililitros da cultura bacteriana ressuspensa em tubos de 15 mililitros e armazená-los a menos 20 graus Celsius até que sejam necessários.

Nesta demonstração, o efeito do empréstimo Xeno Duke indutor de estresse no fator de transcrição Sskn um será medido como exemplo. Sskn one é conhecido por ativar genes citoprotetores durante o estresse oxidativo e xenobi. Uma cultura em larga escala da linha de gans Trenchgenic VP 5 96, que carrega duas construções fluorescentes, é preparada.

Os vermes VP 5 96 expressam o promotor GST quatro que conduz a GFP, que é usado para monitorar a atividade do fator de transcrição. Sskn um e o promotor DOP três dirigindo. A RFP é usada como padrão para normalização do número de worms.

O DOP três é o promotor de um receptor de dopamina e é expresso constitutivamente em neurônios em todo o corpo. No exemplo, dado o xenobi lon ativa fortemente o sskn um e aumenta a quantidade de GFP expressa a partir do promotor GS T quatro para preparar culturas, comece combinando 150 mililitros de tampão N NGM, 1,5 mililitros de LB 150, microlitros de um molar de colesterol e 75 microlitros de 100 miligramas por mililitro. Estreptomicina. Adicionar o LB ajuda a evitar que os vermes grudem nos copos e plásticos, mas essa quantidade não é suficiente para suportar o crescimento bacteriano.

Filtre para esterilizar a mistura, depois transfira-a para um frasco estéril de um litro e reserve o frasco para liberar os ovos dos vermes adultos GR. Lave as bactérias dos vermes centrifugando-as e substituindo o meio NGM até que o supinato esteja claro. Lave as minhocas uma segunda vez suspendendo-as em uma centrífuga de água estéril novamente após a centrifugação.

Remova o supinato e encha o tubo com 3,75 mililitros de água estéril. Adicione um mililitro de alvejante doméstico e 250 microlitros de hidróxido de sódio 10 normal misturado imediatamente por inversão cinco a seis vezes. Coloque o tubo em um rotador depois que os vermes forem expostos ao alvejante por quatro minutos.

Coloque o tubo sob um microscópio estéreo. A maioria dos adultos deveria ser mentira. Agite o tubo vigorosamente 15 a 20 vezes para ajudar a reter os vermes adultos restantes após a lise por um total de cinco minutos, adicione água estéril até que o tubo esteja cheio.

Misture por inversão cinco a seis vezes para coletar os ovos. Centrifugar o tubo durante um minuto a 500 RCF. Lave os ovos três vezes com Resus, dobrando-os em 10 mililitros de água estéril, girando e retirando o supinato.

Em seguida, dilua uma amostra de 100 microlitros dos ovos 100 vezes adicionando 10 mililitros de tampão NGM. Em seguida, pipete três alíquotas de cinco microlitros em uma tampa de placa de Petri sob um microscópio. Conte o número de ovos em três alíquotas separadas de cinco microlitros.

Estimar o número total de ovos. Adicione 200.000 a 2 milhões de ovos ao frasco com tampão NGM e agite a cultura a 100 RPM a 20 graus Celsius. Pelo menos 16 horas após os ovos terem sido adicionados ao frasco, usa pipeta sorológica estéril para remover aproximadamente 0,5 mililitros da cultura de vermes em suspensão.

Pipete três gotas de cinco microlitros na tampa estéril de uma placa de Petri. Coloque a tampa em um freezer de 20 graus negativos por um a dois minutos para paralisar os vermes depois que eles estiverem paralisados. Conte o número médio de vermes vivos eclodidos por cinco microlitros com um microscópio estéreo para estimar o número total.

Descongele a cultura bacteriana OP 50 congelada preparada anteriormente, colocando-a em uma bancada por alguns minutos. Em seguida, adicione três mililitros de 50% OP 50 por 500.000 vermes eclodidos. Agitar o balão a 100 rpm a 20 graus Celsius.

Os vermes se desenvolverão em L quatro larvas e estágios adultos jovens em cerca de 51 horas. Monitore a quantidade de bactérias durante a incubação por inspeção visual. Adicione mais bactérias se o meio ficar claro.

Use uma pipeta sorológica estéril para transferir aproximadamente 0,5 mililitros da cultura de vermes suspensa para uma placa de ágar NGM padrão. Veja os vermes com um microscópio estéreo para se certificar de que a maioria são larvas de L quatro e adultos jovens sob microscopia de campo claro, as larvas de L quatro terão uma mancha ventral clara no meio do corpo. Os jovens adultos serão um pouco maiores e não terão um ponto claro.

Em seguida, puxe a cultura de vermes para tubos estéreis de 50 mililitros. Coloque os tubos em um suporte para tubos de ensaio no capô e deixe-os assentar ovos não eclodidos ou vermes que não se desenvolvem. Instale-se mais lentamente do que os vermes desenvolvidos.

Após 10 minutos, remova o supinato, que contém vermes não eclodidos e não desenvolvidos por aspiração a aproximadamente 10 mililitros de tampão NGM para cada pellet e suspenda os vermes girando suavemente os tubos. Reúna todas as minhocas em um único tubo de 50 mililitros. Gire na centrífuga de balde oscilante a 500 RCF por 30 segundos.

Em seguida, ressuspenda os vermes em 50 mililitros de NGM com 1% lb para lavá-los. Repita isso, lave três a quatro vezes para remover as bactérias após a lavagem. Encher o tubo com tampão NGM mais LB até 50 ml.

Despeje isso em um frasco dispensador de minhoca personalizado em uma barra de agitação e coloque-o em uma placa de agitação. Um mínimo de cerca de 20 mililitros ou 60.000 minhocas é necessário para preencher o espaço morto no frasco dispensador e no dispensador. Conte o número de vermes em três gotas de cinco microlitros, como mostrado anteriormente.

Depois de contar em NGM mais LB até uma concentração de 12 a 15 vermes por gota de cinco microlitros, cada placa de 3 84 poços requer cerca de 35.000 vermes ou 11,5 mililitros de vermes suspensos. Carregue um dispensador de 10 microlitros no dispensador e esterilize-o aplicando primer com etanol a 70%. Enxágue o etanol aplicando primer com água estéril.

Insira a extremidade do de distribuição no balão de modo que fique logo acima da barra de agitação sem interromper seu movimento. Certifique-se de que os vermes permaneçam suspensos em todo o frasco. Programe o dispensador para dispensar minhocas em baixa velocidade com dois pré-pulsos de escorva e execute pelo menos 10 mililitros de minhocas suspensas.

Encha as placas de microtitulação, que já devem conter compostos de teste rapidamente para evitar que os vermes se instalem na tubulação. Aqui o composto de teste previamente carregado na placa de microtitulação é devido. Brilhar. Sele as placas com fita respirável para evitar que a poeira se acumule nos poços.

Coloque as placas em uma plataforma vibratória em uma incubadora na temperatura apropriada para o ensaio. Não empilhe as placas, pois isso pode restringir o fluxo de ar. Coloque a placa-alvo em um leitor de microplacas para medir a intensidade de fluorescência de cada poço com os comprimentos de onda de emissão e excitação apropriados aqui.

Os filtros usados para GFP são excitação em 4 85 e emissão em 5 28. Os filtros para RFP são excitação em cinco 40 e emissão em cinco 90. Depois de ler a placa, calcule a proporção de GFP para RFP e normalize com as leituras dos poços de controle, que não contêm o composto ativador para determinar a diferença exata de dobra da intensidade de fluorescência derivada de tratamentos individuais.

O ensaio SSKN mostrado aqui usa um relatório duplo cromossomicamente integrado, uma cepa quando os vermes foram contados manualmente com um microscópio estéreo. O número de vermes correlacionou-se com o volume dispensado com um valor de R ao quadrado de 0,94 e um valor de p inferior a 0,0001. Isso indica que o número de vermes dispensados em cada poço pode ser controlado ajustando o volume dispensado.

A fluorescência total de GFP por poço mostrada à esquerda e a fluorescência de RFP por poço mostrada à direita são altamente reprodutíveis de poço a poço em uma placa de 3 84 poços nessas figuras. XS indicam a fluorescência relativa medida em cada poço. As linhas sólidas indicam as médias e as linhas quebradas indicam três desvios padrão acima ou abaixo da fluorescência média de todos os poços que tiveram um coeficiente de variação abaixo de 9%Como mostrado nesta figura, a fluorescência GFP do promotor GST quatro está linearmente correlacionada à fluorescência RFP do promotor DOP três em 3 84 poços com um valor R quadrado de 0,62 e um valor p inferior a 0,0001.

Portanto, o relator RFP não induzível pode ser usado para normalizar o induzível. Repórter GFP. Quando expressa uma proporção de GFP sobre RFP, a fluorescência torna-se altamente reprodutível de poço a poço em uma placa de 3 84 poços.

O cálculo da proporção de GFP para RFP reduziu o coeficiente de variação para menos de 6%, demonstrando a capacidade do relator de RFP do promotor DOP três de reduzir a variabilidade, conforme mostrado aqui. A indução de GFP em relação à RFP com um xeno biótico ativador SK N one é robusta e altamente reprodutível em uma placa de 3 84 poços, as taxas médias de fluorescência relativa de todos os poços de controle e GLO devidos são marcadas com linhas sólidas. Três desvios padrão acima da média de controle e abaixo da média dlo são marcados com linhas tracejadas.

Uma vez dominado, o início de uma cultura de vermes pode ser feito cerca de uma hora no primeiro dia e a coleta e distribuição. Um verme pode ser feito cerca de duas horas se feito corretamente. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de começar com pelo menos 60.000 vermes e mantê-los suspensos durante a dispensação, seguindo este procedimento telas com outras, por exemplo, cadeias de relatórios para outras vias induzíveis podem ser realizadas para desenvolver moduladores para outras vias após seu desenvolvimento.

Essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores nas áreas de triagem de alto rendimento e biossensoriamento para identificar rapidamente moduladores de vias de moléculas pequenas ou detectar contaminantes ambientais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como cultivar a distribuição e medir cepas fluorescentes de elegan para triagem de alto rendimento se vias transcricionais induzíveis ou testar várias amostras para contaminantes ambientais.