Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Este vídeo demonstra um método para cultivar e dispensar cepas fluorescentes de CL gans para triagem em alta escala de bibliotecas químicas ou detecção de contaminantes ambientais, a fim de avaliar o efeito de agentes químicos ou ambientais sobre a atividade específica de proteínas. Em CL elgan, culturas bacterianas são inicialmente preparadas como alimento para os vermes e vermes transgênicos para GFP. Verminhos sincronizados são cultivados.

De 0,5 a 2 milhões de vermes são então coletados, lavados e distribuídos em 3 placas microtituladoras de 84 poços. Em seguida, moléculas pequenas de uma biblioteca química ou amostras de teste, como água, alimento ou solo, são adicionadas aos vermes. Por fim, a fluorescência dos vermes é medida com um leitor de microplacas.

A análise de dados de intensidades de fluorescência revela moléculas pequenas que modulam vias transcripcionais induzíveis ou permite a detecção de contaminantes ambientais. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes, como ensaios baseados em cultura celular e in vitro, é que o tempo não será desperdiçado com compostos que são tóxicos ou inativos in vivo. Este método de alto rendimento pode ajudar a identificar moléculas pequenas que modulam diversas vias induzíveis.

Embora tenhamos desenvolvido este método para triagem de alto rendimento de bibliotecas de moléculas pequenas, ele também pode ser aplicado à biossensoriamento de contaminantes em amostras de alimentos e ambientais. O procedimento será demonstrado por Andrew Dine, técnico do meu laboratório, e Q Long, pós-doutorando do meu laboratório. Prepare com antecedência a comida bacteriana para os vermes.

Inicie inoculando 500 mililitros de caldo excelente, suplementado com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina, com cinco mililitros de E. coli OP50 saturada. Coloque o cultivo em um agitador e deixe crescer durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, divida a cultura em 10 tubos de 50 mililitros. Em seguida, coloque os tubos em uma centrífuga refrigerada e centrifugue a 2.500 RCF por 20 minutos. Após a centrifugação, re-suspenda cada pellet bacteriano em 10 mililitros de meio líquido de crescimento de nematoides ou NGM.

Agite as suspensões horizontalmente. Utilize um agitador de bancada durante 15 minutos para ressuspender as bactérias. Em seguida, centrifugue a cultura bacteriana a 2.500 RCF a quatro graus Celsius por 20 minutos.

Decante o NGM e pese o pellet bacteriano. Em seguida, adicione um volume igual de tampão NGM e ressuspenda os pellets por vortexamento. Por fim, alíquotas de três mililitros da cultura bacteriana ressuspendida em tubos de 15 mililitros e armazene-os a menos 20 graus Celsius até que sejam necessários.

Nesta demonstração, o efeito do estresse induzido pelo empréstimo Xeno Duke sobre o fator de transcrição Sskn um será medido como exemplo. Sabe-se que Sskn um ativa genes citoprotetores durante estresse oxidativo e xenobiótico. É preparada uma cultura em larga escala da linhagem Trenchgenic c gans VP 5 96, que carrega dois construtos fluorescentes.

Os vermes VP 5 96 expressam tanto o promotor GST four que dirige GFP, o qual é usado para monitorar a atividade do fator de transcrição Sskn um, quanto o promotor DOP três que dirige RFP, usado como padrão para normalização do número de vermes.

DOP três é o promotor de um receptor de dopamina e é constitutivamente expresso em neurônios por todo o corpo. No exemplo, dado que o xenobi lon ativa fortemente sskn um e aumenta a quantidade de GFP expressa a partir do promotor GS T quatro para preparar culturas, comece combinando 150 mililitros de tampão N NGM, 1,5 mililitros de LB 150, microlitros de um molar de colesterol e 75 microlitros de 100 miligramas por mililitro de estreptomicina. A adição do LB ajuda a impedir que os vermes adiram ao material de vidro e plástico, mas essa quantidade não é suficiente para sustentar o crescimento bacteriano.

Filtre para esterilizar a mistura, depois transfira-a para um frasco estéril de um litro e deixe o frasco de lado para liberar os ovos de vermes adultos GR. Lave as bactérias dos vermes por centrifugação e substitua o meio NGM até que o sobrenadante fique claro. Lave os vermes uma segunda vez ressuspendendo-os em água estéril, centrifugue novamente após a rotação.

Remova o sobrenadante e preencha o tubo com 3,75 mililitros de água estéril. Adicione um mililitro de água sanitária doméstica e 250 microlitros de hidróxido de sódio 10 normal, misturando imediatamente por inversão de cinco a seis vezes. Coloque o tubo em um rotador após os vermes terem sido expostos ao hipoclorito por quatro minutos.

Coloque o tubo sob um microscópio estereoscópico. A maioria dos adultos deverá estar morta. Agite o tubo vigorosamente de 15 a 20 vezes para ajudar a eliminar quaisquer vermes adultos remanescentes após a lise ter ocorrido, durante um total de cinco minutos; adicione água estéril até que o tubo fique cheio.

Misture por inversão cinco a seis vezes para coletar os ovos. Centrifugue o tubo por um minuto a 500 RCF. Lave os ovos três vezes com Resus, suspendendo-os em 10 mililitros de água estéril, centrifugando e removendo o sobrenadante.

Em seguida, dilua uma amostra de 100 microlitros dos ovos em 100 vezes, adicionando 10 mililitros de tampão NGM. Em seguida, pipete três alíquotas de cinco microlitros sobre a tampa de uma placa de Petri sob um microscópio. Conte o número de ovos em três alíquotas separadas de cinco microlitros.

Para estimar o número total de ovos, adicione de 200.000 a 2 milhões de ovos ao frasco com tampão NGM e agite o cultivo a 100 RPM a 20 graus Celsius. Pelo menos 16 horas após os ovos terem sido adicionados ao frasco, utilize uma pipeta serológica estéril para remover aproximadamente 0,5 mililitros do cultivo de vermes em suspensão.

Pipete três gotas de cinco microlitros sobre a tampa estéril de uma placa de Petri. Coloque a tampa em um congelador a menos 20 graus por um a dois minutos para paralisar os vermes; uma vez paralisados os vermes, conte o número médio de vermes vivos eclodidos por cinco microlitros utilizando um microscópio estereoscópico para estimar o número total.

Deixe descongelar a cultura bacteriana OP 50 congelada preparada anteriormente colocando-a sobre a bancada por alguns minutos. Em seguida, adicione três mililitros de OP 50 a 50% por 500.000 vermes eclodidos. Agite o frasco a 100 rpm a 20 graus Celsius.

Os vermes irão se desenvolver em larvas L4 e estágios jovens de adultos em aproximadamente 51 horas. Monitore a quantidade de bactérias durante toda a incubação por inspeção visual. Adicione mais bactérias se o meio ficar transparente.

Utilize uma pipeta serológica estéril para transferir aproximadamente 0,5 mililitros da cultura de vermes suspensa para uma placa padrão de ágar NGM. Observe os vermes com um microscópio estereoscópico para garantir que a maioria sejam larvas L4 e adultos jovens em microscopia de campo claro; as larvas L4 apresentarão uma mancha clara ventral no meio do corpo. Os adultos jovens serão ligeiramente maiores e não terão uma mancha clara.

Em seguida, aspire a cultura de vermes para tubos estéreis de 50 mililitros. Coloque os tubos em um suporte para tubos de ensaio na cabine de segurança e deixe repousar para sedimentar ovos não eclodidos ou vermes que não se desenvolveram. Eles sedimentam mais lentamente do que os vermes desenvolvidos.

Após 10 minutos, remova o sobrenadante, que contém vermes não eclodidos e não desenvolvidos, por aspiração, adicionando aproximadamente 10 mililitros de tampão NGM a cada pellet e suspendendo os vermes com movimentos suaves de rotação dos tubos. Reúna todos os vermes em um único tubo de 50 mililitros. Centrifugue no rotor de balde oscilante a 500 RCF por 30 segundos.

Em seguida, ressuspenda os vermes em 50 mililitros de NGM com 1% de lb para lavá-los. Repita este procedimento, lavando de três a quatro vezes para remover as bactérias após a lavagem. Complete o tubo com NGM mais tampão LB até 50 mililitros.

Despeje isso em um frasco personalizado para dispensação de vermes com um agitador magnético e coloque-o em uma placa agitadora. É necessário um mínimo de cerca de 20 mililitros ou 60.000 vermes para preencher o espaço morto no frasco de dispensação e no cartucho do dispensador. Conte o número de vermes em três gotas de cinco microlitros conforme mostrado anteriormente.

Após a contagem em NGM mais LB, para uma concentração de 12 a 15 vermes por gota de cinco microlitros, cada placa de 84 poços requer cerca de 35.000 vermes ou 11,5 mililitros de vermes suspensos. Carregue um cassete dispensador de 10 microlitros no dispensador e esterilize-o mediante pré-enchimento com etanol 70%. Enxágue o etanol com água estéril mediante pré-enchimento.

Insira a extremidade do cassete de dispensação no frasco, posicionando-a logo acima da barra de agitação, sem interferir em seu movimento. Certifique-se de que os vermes permaneçam em suspensão por todo o frasco. Programe o dispensador para liberar os vermes em baixa velocidade, com dois pulsos prévios para escorva e execute a dispensação de pelo menos 10 mililitros de vermes em suspensão.

Encha rapidamente as placas de microtitulação, que já devem conter os compostos em teste, para evitar que os vermes se depositem nos tubos. Aqui, o composto em teste previamente adicionado à placa de microtitulação é o Due.Glow. Sobreponha as placas com fita respirável para impedir que poeira se acumule nos poços.

Coloque as placas em uma plataforma agitadora dentro de um incubador na temperatura apropriada para o ensaio. Não empilhe as placas, pois isso pode restringir a circulação de ar. Coloque a placa-alvo em um leitor de microplacas para medir a intensidade de fluorescência de cada poço com os comprimentos de onda de emissão e excitação apropriados aqui.

Os filtros utilizados para GFP são excitação em 485 e emissão em 528. Os filtros para RFP são excitação em 540 e emissão em 590. Após a leitura da placa, calcule a razão entre GFP e RFP e normalize com as leituras dos poços controle, que não contêm o composto ativador, para determinar a diferença exata em termos de dobra na intensidade de fluorescência derivada de cada tratamento individual.

O ensaio SSKN único mostrado aqui utiliza um repórter duplo integrado ao cromossomo, uma linhagem em que os vermes foram contados manualmente com um microscópio estereoscópico. O número de vermes correlacionou-se com o volume dispensado, com um valor de R quadrado de 0,94 e um valor de p inferior a 0,0001. Isso indica que o número de vermes dispensados em cada poço pode ser controlado ajustando-se o volume dispensado.

A fluorescência total de GFP por poço mostrada à esquerda e a fluorescência de RFP por poço mostrada à direita são altamente reprodutíveis de poço para poço em toda uma placa de 3 84 poços nestas figuras. Os XS indicam a fluorescência relativa medida em cada poço. Linhas contínuas indicam as médias e linhas tracejadas indicam três desvios padrão acima ou abaixo da média da fluorescência de todos os poços, com um coeficiente de variação inferior a 9%. Como mostrado nesta figura, a fluorescência de GFP do promotor GST four está linearmente correlacionada à fluorescência de RFP do promotor DOP three ao longo de 3 84 poços, com um valor de R quadrado de 0,62 e um valor de p inferior a 0,0001.

Portanto, o repórter RFP não indutível pode ser usado para normalizar o repórter GFP indutível. Quando expresso, a razão da fluorescência de GFP sobre RFP torna-se altamente reprodutível de poço a poço em toda uma placa de 3 84 poços.

O cálculo da razão entre GFP e RFP reduziu o coeficiente de variação para abaixo de 6%, demonstrando a capacidade do repórter de três promotores DOP-RFP de reduzir a variabilidade, conforme mostrado aqui. A indução de GFP em relação a RFP com um xenobiótico ativador SK N um é robusta e altamente reproduzível em toda uma placa de 3 84 poços; as razões médias de fluorescência relativa de todos os poços controle e dlo são indicadas por linhas contínuas. Três desvios-padrão acima da média do controle e abaixo da média dlo são indicados por linhas tracejadas.

Uma vez dominada, a montagem de um cultivo de vermes pode ser realizada em cerca de uma hora no primeiro dia, para coleta e distribuição. A manipulação dos vermes pode ser feita em cerca de duas horas, se realizada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de iniciar com pelo menos 60.000 vermes e mantê-los em suspensão durante a distribuição; seguindo este protocolo, telas com outros, por exemplo, linhagens repórter para outras vias induzíveis, podem ser realizadas com o objetivo de desenvolver moduladores para outras vias após seu desenvolvimento.

Essa técnica pode abrir caminho para pesquisadores nas áreas de triagem de alto rendimento e biossensores identificarem rapidamente moduladores de vias por moléculas pequenas ou detectarem contaminantes ambientais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como cultivar, dispensar e medir cepas fluorescentes de elegans para triagem de alto rendimento de vias transcricionais induzíveis ou para testar múltiplas amostras quanto a contaminantes ambientais.