Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

O objetivo geral do experimento a seguir é extrair proteínas de tecido cerebral humano e de camundongo para análise proteômica. Isso é realizado utilizando um tampão de lise comum para obter a mesma extração de proteínas adaptada para abordagens de eletroforese bidimensional. Em seguida, a eletroforese bidimensional por diferença de fluorescência é usada para separar as proteínas para identificação por espectrometria de massas.

Em seguida, realiza-se uma eletroforese em gel 2D miniatura com imunodetecção para identificar modificações pós-traducionais. Os resultados podem mostrar a expressão proteica global. As alterações traducionais do hospedeiro e todos os produtos ligantes e catalíticos são separados com base nas diferenças no ponto isoelétrico e no peso molecular.

A combinação de 2D dash e 2D monolo pode nos ajudar a responder questões fundamentais no campo da neuroproteômica, fornecendo simultaneamente informações sobre alterações na expressão. Modificação pós-inal e catabolismo em produtos iniciam-se com a coleta e homogeneização do tecido cerebral. Prepare o tecido em 10% peso por volume em tampão de extração para tecido cerebral humano.

Homogeneíze o tecido usando uma pipeta de vidro, no entanto, utilize um homogeneizador de teflon para tecido de roedor a fim de desintegrar qualquer homogeneizado. Sonique a 60 hertz usando 30 pulsos de meio segundo. Em seguida, determine a concentração de proteína por meio de um ensaio de Bradford utilizando BSA como padrão.

Agora, reúna as soluções para a precipitação com clorofórmio-metanol em um banho de gelo. Planeje coletar cerca de 125 microgramas para tiras IPG de 11 centímetros ou cerca de 1,25 miligramas para tiras IPG de 18 centímetros. Assim que as soluções atingirem quatro graus Celsius, realize a precipitação completamente sobre gelo.

Primeiro, adicione três volumes de metanol, depois um de clorofórmio. Agite esta mistura. Em seguida, adicione três volumes de água fria.

Vortex, essa mistura por um minuto, centrifugue o tubo da amostra a 12.000 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione três volumes de metanol, vortex e centrifugue as proteínas da mesma maneira.

Seque o pellet proteico coletado sob gás nitrogênio antes da DIGE 2D. Re suspenda a proteína em tampão 2D a 2,5 miligramas por mililitro. Em seguida, sonique as amostras como feito anteriormente até que sejam utilizadas.

Armazene-os a menos 80 graus Celsius antes de iniciar esta etapa e após a precipitação das proteínas. É necessário determinar novamente a concentração proteica por meio do ensaio de Bradford. Siga o mesmo procedimento mostrado anteriormente antes da marcação com o corante psy.

A qualidade da amostra proteica é verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS para essa finalidade. Dilua 15 microgramas de proteína em LDS e aqueça a 37 graus Celsius em banho-maria ou bloco térmico. Em seguida, submeta as amostras a uma eletroforese em gel de poliacrilamida e cora o gel com solução de azul de comassie por pelo menos uma hora.

Em seguida, mantenha o gel durante a noite em uma solução de ácido acético 7% e etanol 10%. Uma vez estabelecida a qualidade da amostra proteica, no dia seguinte inicia-se o procedimento de marcação com SD. Primeiro, meça o pH do lisado, que deve ser básico ou neutro.

O pH ideal é 8,6 para as reações subsequentes. Em seguida, prepare as reações de conjugação com corante para cada amostra proteica. Misture 50 microgramas com 400 picomoles do corante S3 e 50 microgramas com 400 picomoles do corante S cinco.

Realize isso em quadruplicata, perfazendo um total de oito reações de acoplamento D por amostra. Para cada amostra testada, prepare um conjunto complementar de reações de acoplamento DI utilizando proteína do controle, como por exemplo de um cérebro doente. Em seguida, para cada par de reações, monte uma reação controle interna com 400 picomoles de CY dois e uma representação equitativa de todas as proteínas, totalizando 250 microgramas.

A marcação com SAI é realizada incubando todas as misturas de reação a quatro graus Celsius, no escuro, durante uma hora. Após a incubação, combine todos os conjuntos de três reações cian diferentes em volumes de 150 microlitros, adicionando a cada conjunto 200 microlitros de tampão 2D. Em seguida, prossiga com os passos da eletroforese 2D.

Inicie preparando soluções de proteína não marcadas para o gel preparativo, do qual serão excisados pontos proteicos para cada amostra e para o controle positivo. Aliquote de 300 a 350 microgramas de proteína não marcada em tampão 2D e permita que eles se reidratem em contato com a fita IPG. Em seguida, carregue as fitas IPG e transfira as proteínas marcadas e não marcadas para uma reidratação.

Cubra então cada poço com uma tira de reação IPG. Em seguida, adicione uma camada de óleo mineral e deixe as tiras reidratarem passivamente com a solução proteica durante a noite a não mais de 25 graus Celsius. No dia seguinte, realize a focalização isoelétrica das tiras IPG.

Em seguida, remova o óleo e armazene as tiras IPG a menos 20 graus Celsius para equilibrá-las. Mergulhe-as no tampão de equilibração por 15 minutos. Em seguida, transfira as tiras para acetamida 4,7%IDO no tampão de equilibração, sem DTT, enquanto mantém as tiras em imersão.

Utilize um sistema de eletroforese bidimensional de grande porte para preparar quatro géis de SDS-PAGE a 12% por amostra em placas de vidro com baixa fluorescência, destinados às proteínas marcadas. Prepare também um gel de SDS-PAGE a 12% em placas de vidro padrão com espessura de 1,5 milímetro para cada uma das proteínas não marcadas. Estes são os géis preparativos.

Após o resfriamento dos géis, transfira as tiras para o topo dos géis e recubra-as com Aros 0,5%. Após o resfriamento, execute os géis a 2,5 watts a quatro graus Celsius durante a noite e analise-os no dia seguinte. Muitas reações bidimensionais podem ser realizadas com amostras de proteínas utilizadas para os géis preparativos. Meça menos de 100 microgramas da amostra em 200 microlitros de tampão 2D.

Em seguida, agite vigorosamente as misturas da amostra e faça uma centrifugação rápida. Carregue as amostras em tiras IPG de 11 centímetros e deixe-as reidratar passivamente durante a noite, cobertas com óleo mineral, no dia seguinte. Realize a focalização isoelétrica.

Em seguida, mova as tiras por três banhos de tampão de equilíbrio durante 15 minutos por banho. As tiras são então eletroforadas em géis de SDS-PAGE 2D. Coloque cada tira sobre um gel pré-moldado da massa molecular apropriada.

Poliacrilamida para a proteína de interesse. Posteriormente, transfira os géis para membrana de NITROCELULOSE PVDF e analise-os com anticorpos no desenvolvimento deste protocolo. Três tipos diferentes de lise.

Os tampões foram testados. Primeiramente, um tampão comum em bioquímica e biologia molecular. O Tris SDS foi testado.

O Tris SDS apresentou baixa resolução em comparação com outro tampão testado, o UTS. O terceiro tampão foi descartado, pois amostras testáveis não puderam ser preparadas com ele. Em seguida, foram investigados os proteomas de cérebro humano e de camundongo.

Amostras de córtex controle humano e amostras de córtex com DA foram comparadas. Proteínas cerebrais de camundongos com patologia de tau semelhante à DA também foram analisadas a partir da amostra humana. SCI dois foi analisado independentemente, assim como S SI três e sci cinco para cada D. A alta resolução do ponto facilitou o alinhamento.

Uma análise qualitativa mini 2D foi utilizada para investigar modificações pós-traducionais e verificou-se que a alfa-sinucleína na tecido ad tinha um perfil normal, mas também foi encontrada como um dímero marcado por um asterisco. As setas indicam os locais onde a alfa-sinucleína foi detectada. A proteína precursora do amiloide ubiquitinada também foi observada por meio da mini 2D.

AD esporádica foi comparada com AD familiar. Na AD familiar, o beta amiloide 1 a 42 e a variância ISO apresentam concentrações mais baixas porque formas ligadas foram encontradas em oito quilodaltons. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar o proteoma para comparar amostras complexas mediante a medição de modificações na expressão proteica.