Name: Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-10T15:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprenda a extrair proteínas de tecido cerebral humano e murino usando tampão de lise comum para análise proteômica. Este método emprega eletroforese bidimensional e imunoblotting para identificar modificações pós-traducionais.

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Este trabalho foi financiado pelo Inserm, da Universidade de Lille 2, MEDIALZ, Labex (laboratório de excelência, programa investir para o futuro) e DISTALZ (desenvolvimento de estratégias inovadoras para uma abordagem transdisciplinar para a doença de Alzheimer). FJ.FG é atualmente uma bolsa destinatário da ANR (Agência Nacional de Pesquisa Francês / NeuroSplice de Tau Projet ANR-2010-BLAN-1114 01), mas este trabalho foi também com o apoio de uma bolsa da JCCM (Espanha).

1. Homogeneização e extração de proteínas de tecido do cérebro humano e do rato <ol><li> Homogeneização do tecido cerebral. Homogeneizar o tecido cerebral de 10% (w / v) em 8 M de ureia, 2 M tioureia e 1% w / v de tampão de SDS (UTS) com um vidro Potter (para amostras humanas) ou Teflon homogeneizador (para as amostras de ratos). Sonicate a 60 Hz 30 pulsos com um gerador de ultra-som de aplicar 0,5 seg para a desintegração do tecido total de 13, 14. <ol><li> Determinar a concentração de proteína, com ensaio de Bradford, utilizando BSA como padrão. Este tampão de extracção de UTS é totalmente compatível com uma dimensão de SDS-PAGE, enquanto lisados ​​não são sobre-aquecido para evitar a carbamilação 15. </li><li> Adicionar 1% (w / v) de Amberlite e incubar com agitação suave durante 10 minutos à temperatura ambiente. A partir de então filtrar para 0,22 filtros de seringa e, finalmente, adicionar a SDS para a solução de uréia / tiouréia. Este passo reduz a quantidade de ácido úrico e ácido isociânico, que estão em equilibrio com uréia em solução e facilitar a sua degradação. </li></ol></li><li> A precipitação da proteína de clorofórmio / metanol. Precipitar entre 100-150 mg de proteína para 11 centímetros Tiras IPG e 1-1,5 mg para 18 centímetros queridos (independentemente da faixa de pH selecionado para realizar o IEF). <ol><li> Realize todos os passos no gelo ou a 4 ° C. Clorofórmio fresco e metanol a 4 ° C durante 30 min antes de iniciar o procedimento de precipitação. </li><li> Adicionar três volumes de metanol e um volume de clorofórmio para um volume de UTS lisado. Agite manualmente a mistura e adicione três volumes de água fria. Vortex durante 1 min e sedimentar as proteínas por centrifugação a 12.000 xg durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Descartar o sobrenadante utilizando uma pipeta de Pasteur e adicionar três volumes de MeOH frio. Vortex novamente e centrifugar a 12000 xg durante 30 min a 4 ° C. Finalmente descartar o sobrenadante e secar o sedimento sob N 2. </li></ol></li><li> A preparação de proteínas para análise 2D.Ressuspender o sedimento seco ao proteína em 2D-tampão (8 M de ureia, 2 M tioureia, suplementado com 4% de CHAPS). Lava-se a solução com Amberlite tal como indicado acima e tentar manter a proporção de 500 mg de proteína por 200 ul de tampão para o 2D-2D DIGE. Nota: tampão 2D pode ser armazenada a -80 ° C ou mantido a 4 ° C durante uma semana (para evitar a degradação de ureia). <ol><li> Sonicar e armazenar as amostras à temperatura de -80 ° C até à realização da etapa seguinte. Notável, este protocolo pode ser usado após a solubilização ácido fórmico de proteína agrega 10. Resumidamente, evapora-se o ácido fórmico sob N2 e ressuspender o sedimento como descrito. </li></ol></li></ol> 2. 2D DIGE <ol><li> As amostras de teste de qualidade. Amostras de dose novamente usando método de Bradford. Dilui-se 15 ug de proteínas no tampão de amostra LDS, aquece-se a 37 ° C e 15 carregar em 4-12% de gel de poliacrilamida. </li><li> Coloração com Coomassie. Mancha de gel de poliacrilamida com 0,1% (w / v) de CoomassieBlue G-250, 50% de EtOH e 10% (v / v) de solução de ácido acético durante pelo menos 1 hr. Vamos fundo Destain durante a noite em 7% de ácido acético e 10% (v / v) da solução de etanol. </li><li> Rotulagem pré-eletroforética das amostras. Antes de realizar marcação com corante de cianina, verificar o pH da amostra, o qual deve ser de base ou mesmo neutro uma vez que a substituição de N-hidroxissuccinimida é mais eficiente a pH básico e dado que a duração óptima a pH 8,6. <ol><li> Rotular minimamente as duas amostras de estudo com corantes Cy3 ou Cy5 fluorescentes, com uma razão de 50 ug protein/400 corante pmol e manter durante 1 hora a 4 ° C na escuridão para facilitar o grupo éster reactivo NHS dos cianinas com a amina não protonada grupos de lisinas. </li><li> Reduzir variações de amostra fazendo uma rotulagem cruz com Cy3 e Cy5 corantes, evitando um acoplamento preferencial de uma amostra para uma cyanine particular. Note-se que a marcação mínima cianina-corante pode ser adaptado para a pequena quantidade de proteínas em manter a proporção de 1 ug protein por 8 pmol cyanine-dye. Se assim for, o sistema de mini-2DE pode ser usado em vez de um grande sistema de gel 2D. Isto irá permitir a análise 2D-DIGE por uma pequena quantidade de tecido cerebral. </li><li> Rotular um conjunto de ambas as amostras com a mesma quantidade de proteína (50 ug no total) com o corante fluorescente Cy2 e usado como padrão interno. Use as mesmas condições, como indicado anteriormente. </li><li> Completar até um volume total de 350 ul com tampão de 2D que contém 1,1% de reagente de Destreak, 1,2% de tampão de IPG e vestígios de Azul de Bromofenol o total de 150 ug de proteínas marcadas (50 ug de Cy2, 50 ug de Cy3 e 50 ug de Cy2). Execute esta etapa em quadruplicado utilizando quatro faixas independentes. Além disso, preparar duas tiras não-rotulados adicionais (um para cada amostra) com 350-450 mg de proteína para os geles de preparação. </li><li> Deixe as seis faixas carregadas durante a noite coberto com óleo mineral para reidratação passiva. </li></ol></li><li> Isoelectrofocusing. Realizar o IEF a 206; C. Para um pH de 3 11NL, 18 cm de tira do protocolo é: configuração máxima atual é 50 mA / faixa durante 8 etapas: 1) 150 V etapa por 1 hora, 2) 200 V etapa, durante 5 horas, 3) 500 V gradiente para 2 horas, 4) gradiente 1.000 V para 2 horas, 5) 2.000 V gradiente de 2 horas, 6) 4.000 V gradiente de 2 horas, 7) 8.000 V gradiente de 2 horas e 8) para um total de 24.000 V · passo hr . Depois de IEF, despachar o excesso de óleo mineral utilizando papel de cromatografia e armazenar as tiras a -20 ° C até que a segunda dimensão. </li><li> IPG Tiras equilíbrio. Equilibrar as tiras em 6 M de ureia, 2% de SDS, 30% glicerol, 50 mM Tris-HCl pH 8,6, tampão com 1% de DTT, durante 15 min e depois com 4,7% de iodoacetamida no mesmo tampão mas sem DTT. </li><li> A segunda dimensão ou eletroforese SDS-PAGE. Adicione os seis géis de 12% SDS-PAGE (1,5 M Tris-HCl pH 8,6, 12% de acrilamida / bis-acrilamida, 0,1% (w / v) de SDS, 0,072% (w / v) de APS e 0,1% (v / v) TEMED ), ao mesmo tempo, utilizando um grande sistema 2D, com quatro placas de vidro de baixa fluorescência para o strips com amostras de fluorescência e outras duas placas de vidro com 1,5 mm de espessura para géis de preparação, a fim de extirpar os spots de proteínas. <ol><li> Carregar os seis tiras de IPG no topo dos géis e mais camadas com 0,5% (w / v) de agarose. O tampão de corrida é composto de Tris 25 mM, glicina 192 mM e 0,1% (w / v) de SDS. Efectuar a migração de 2,5 W / gel durante a noite com um sistema de refrigeração definida para 4 ° C 16,17. </li></ol></li><li> Aquisição e análise de imagens de fluorescência. Use um scanner Typhoon 9400 para obter as imagens géis de fluorescência (12 imagens para um experimento). Digitalização Cy2, imagens Cy3 e Cy5 para cada gel em 488/520 nm, 532/580 nm e 630/670 nm de excitação / emissão de comprimentos de onda, respectivamente. Use um software de informática para analisar as imagens. Os dados são representativos das alterações do volume de ponto associadas com a distribuição do sinal de entre os quatro géis entre as duas amostras estudadas. </li><li> Coloração Coomassie para grandes géis. Corrigir os géis de preparação em 50% (v / v) de EtOH e 3% (v / v) de solução de ácido fosfórico durante pelo menos 24 horas. Em seguida, depois, lavar duas vezes com água ultra-pura, durante 20 min. Realizar coloração em 34% (v / v) de MeOH, 17% (w / v) de sulfato de amónio e 2% de ácido ortofosfórico durante 1 h antes da adição de 0,1% (w / v) de Coomassie Blue G-250. Mantenha os géis na coloração por pelo menos 48 horas e descorados em água ultra-pura. <ol><li> Spots para a identificação de MS. Uma vez que imagens de fluorescência são analisados, o software fornece uma lista de pontos cuja expressão é estatisticamente diferente. Excisar manualmente essas manchas de geles preparativos. Este procedimento requer a prática e alguns destreza manual, a fim de evitar a contaminação da queratina. Em seguida, as amostras podem ser mantidas em água à temperatura de -20 ° C até que o envio para o MS. Identificação Spot é perfeitamente compatível com a espectrometria de massa em tandem (MS / MS) e da relevância das identidades de proteína é julgado de acordo com a pontuação baseada Mowse calculado com um valor-p de 0,05 (p &lt;0,05) 18 probabilidade. </li> &lt;/ Ol&gt; </li></ol> 3. Qualitativa ensaio Mini-2DE <ol><li> Ressuspender máximo de 100 ug de proteína em tampão de amostra 2D, até um volume final de 200 ul de uma tira de IPG 11 centímetros. No caso do sistema de sobre-expressão ou a proteína purificada, a quantidade de partida pode ser reduzido para 20 mg. </li><li> Adicionar 1,1% (v / v) de reagente Destreak, 0,55% (v / v) de tampão de IPG e vestígios de azul de bromofenol para um volume final de 200 ul. Então, vortex, fazer um giro rápido e carregar em uma tira de IPG para reidratação passiva (para trazer a tira a sua espessura original) durante a noite coberto com óleo mineral. Nota: a proporção de tampão de IPG é a mesma para todos o intervalo de pH desejado (pH 3-11, 4-7, 7-11, etc), mas a sua composição varia em função da gama de pH seleccionada. </li><li> Isoelectrofocalisation. Realizar IEF a 20 ° C. A duração do programa depende do intervalo de pH seleccionado. Notável, parâmetros como electroendosmosis pode perturbar o perfil IEF e, nestes casos,optimização em tempo electrofocalisation é necessário 19. Nota: não é necessariamente um IEF já que proporciona melhores resultados, mas a diminuição do tempo de IEF pode também melhorar a resolução. Depois de IEF, as tiras de IPG pode ser armazenada a -20 ° C, durante meses. </li><li> IPG tiras equilíbrio. Equilibrar as tiras num tampão contendo 25 mM Tris-HCl pH 6,8, DTT 20 mM, 10% glicerol, 5% de SDS, 0,05% de azul de bromofenol. Adicione três banha equilíbrio durante 15 minutos com a solução tampão de mudança entre cada banho. </li><li> SDS-PAGE. A camada de tira de IPG num gel pré-moldado (IPG um poço, 11 centímetros tira de IPG) com uma percentagem de poliacrilamida escolhido dependendo do MW da proteína de interesse. Em seguida, seque o gel para uma membrana de nitrocelulose / PVDF de 100 mV durante 33 min. </li><li> Incubar durante a noite com o anticorpo necessário e visualizar pela atividade da peroxidase. Realize os alinhamentos de immunoblots usando polipeptídeos não relacionados revelados pelo anticorpo secundário. Chegar a um semi-quantitative análise por densitometria do volume e intensidade para os vestígios / manchas com software ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Collins, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grand+challenges+in+global+mental+health%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Grand challenges in global mental health.</a> Nature. 475, 27-30 (2011).</li>
<li>De Deyn, P. P., Van Dam, D., Sergeant, N., Buée, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDe+Deyn%2C+PP+%22Animal+Models+of+Dementia+Vol.+48+Neuromethods+449-468%22">Animal Models of Dementia Vol. 48 Neuromethods 449-468</a>. , Humana Press. 449-468 (2011).</li>
<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+two-dimensional+electrophoresis+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins.</a> J Biol Chem. 250, 4007-4021 (1975).</li>
<li>Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-covalent+and+covalent+protein+labeling+in+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Non-covalent and covalent protein labeling in two-dimensional gel electrophoresis.</a> J Proteomics. 71, 231-244 (2008).</li>
<li>Marouga, R., David, S., Hawkins, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+DIGE+system%3A+2D+fluorescence+difference+gel+analysis+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">The development of the DIGE system: 2D fluorescence difference gel analysis technology.</a> Anal Bioanal Chem. 382, 669-678 (2005).</li>
<li>Westermeier, R., Scheibe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Difference+gel+electrophoresis+based+on+lys%2Fcys+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Difference gel electrophoresis based on lys/cys tagging.</a> Methods Mol Biol. 424, 73-85 (2008).</li>
<li>Gong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ventral+furrow+morphogenesis%3A+a+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila ventral furrow morphogenesis: a proteomic analysis.</a> Development. 131, 643-656 (2004).</li>
<li>Gharbi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two-dimensional+differential+gel+electrophoresis+for+proteomic+expression+analysis+of+a+model+breast+cancer+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two-dimensional differential gel electrophoresis for proteomic expression analysis of a model breast cancer cell system.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 91-98 (2002).</li>
<li>Ando, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+pathology+modulates+Pin1+post-translational+modifications+and+may+be+relevant+as+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Tau pathology modulates Pin1 post-translational modifications and may be relevant as biomarker.</a> Neurobiol Aging. 34, 757-769 (2013).</li>
<li>Bretteville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+electrophoresis+of+tau+mutants+reveals+specific+phosphorylation+pattern+likely+linked+to+early+tau+conformational+changes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional electrophoresis of tau mutants reveals specific phosphorylation pattern likely linked to early tau conformational changes.</a> PLoS One. 4, 4843(2009).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+characterization+of+paired+helical+filament-tau+from+Alzheimer%27s+disease%3A+demonstration+of+an+additional+74-kDa+component+and+age-related+biochemical+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional characterization of paired helical filament-tau from Alzheimer's disease: demonstration of an additional 74-kDa component and age-related biochemical modifications.</a> J Neurochem. 69, 834-844 (1997).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+distribution+of+phosphorylated+tau+protein+isoforms+in+Alzheimer%27s+and+Pick%27s+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Different distribution of phosphorylated tau protein isoforms in Alzheimer's and Pick's diseases.</a> FEBS Lett. 412, 578-582 (1997).</li>
<li>Rabilloud, T., Luche, S., Santoni, V., Chevallet, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+and+chaotropes+for+protein+solubilization+before+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Detergents and chaotropes for protein solubilization before two-dimensional electrophoresis.</a> Methods Mol Biol. 355, 111-119 (2007).</li>
<li>Wrobel, K., Caruso, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+procedures+for+characterization+of+arsenic+and+selenium+species+in+complex+samples+utilizing+coupled+techniques+with+mass+spectrometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Pretreatment procedures for characterization of arsenic and selenium species in complex samples utilizing coupled techniques with mass spectrometric detection.</a> Anal Bioanal Chem. 381, 317-331 (2005).</li>
<li>McCarthy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbamylation+of+proteins+in+2-D+electrophoresis--myth+or+reality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Carbamylation of proteins in 2-D electrophoresis--myth or reality.</a> J Proteome Res. 2, 239-242 (2003).</li>
<li>Chafey, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+beta-catenin+activation+in+mouse+liver+by+DIGE+analysis+identifies+glucose+metabolism+as+a+new+target+of+the+Wnt+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of beta-catenin activation in mouse liver by DIGE analysis identifies glucose metabolism as a new target of the Wnt pathway.</a> Proteomics. 9, 3889-3900 (2009).</li>
<li>Kahn, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomic+analysis+of+blood+eosinophils+reveals+redox+signaling+modifications+in+patients+with+FIP1L1-PDGFRA-associated+chronic+eosinophilic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomic analysis of blood eosinophils reveals redox signaling modifications in patients with FIP1L1-PDGFRA-associated chronic eosinophilic leukemia.</a> J Proteome Res. 10, 1468-1480 (2011).</li>
<li>Pottiez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+electrophoresis-+and+chromatography-based+determination+of+gene+expression+profiles+in+bovine+brain+capillary+endothelial+cells+after+the+re-induction+of+blood-brain+barrier+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Sci%22%5BJournal%5D)">A large-scale electrophoresis- and chromatography-based determination of gene expression profiles in bovine brain capillary endothelial cells after the re-induction of blood-brain barrier properties.</a> Proteome Sci. 8, 57(2010).</li>
<li>Stochaj, W. R., Berkelman, T., Laird, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+2D+Gel+Electrophoresis+with+Immobilized+pH+Gradients%3A+IPG+Strip+Equilibration%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Preparative 2D Gel Electrophoresis with Immobilized pH Gradients: IPG Strip Equilibration.</a> CSH Protoc. , (2006).</li>
<li>Azimzadeh, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
<li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+p16-Arc+subunit+of+the+Arp+2%2F3+complex+as+a+substrate+of+MAPK-activated+protein+kinase+2+by+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis.</a> J Biol Chem. 278, 36410-36417 (2003).</li>
<li>Rabilloud, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+thiourea+to+increase+the+solubility+of+membrane+proteins+in+two-dimensional+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Use of thiourea to increase the solubility of membrane proteins in two-dimensional electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 758-760 (1998).</li>
<li>Molloy, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+membrane+proteins+by+differential+solubilization+for+separation+using+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Extraction of membrane proteins by differential solubilization for separation using two-dimensional gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 19, 837-844 (1998).</li>
<li>Ericsson, C., Peredo, I., Nister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protein+extraction+from+cryopreserved+brain+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Oncol%22%5BJournal%5D)">Optimized protein extraction from cryopreserved brain tissue samples.</a> Acta Oncol. 46, 10-20 (2007).</li>
<li>Shaw, M. M., Riederer, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preparation+for+two-dimensional+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis.</a> Proteomics. 3, 1408-1417 (2003).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+solubilization+for+the+analysis+of+the+CD14+human+monocyte+membrane+proteome+using+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein solubilization for the analysis of the CD14 human monocyte membrane proteome using LC-MS/MS.</a> J Proteomics. 73, 112-122 (2009).</li>
<li>Centlow, M., Hansson, S. R., Welinder, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteome+analysis+of+the+preeclamptic+placenta+using+optimized+protein+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Differential proteome analysis of the preeclamptic placenta using optimized protein extraction.</a> J Biomed Biotechnol. 2010, 458-748 (2010).</li>
<li>Perdew, G. H., Schaup, H. W., Selivonchick, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+a+zwitterionic+detergent+in+two-dimensional+gel+electrophoresis+of+trout+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of a zwitterionic detergent in two-dimensional gel electrophoresis of trout liver microsomes.</a> Anal Biochem. 135, 453-455 (1983).</li>
<li>Schindowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease-like+tau+neuropathology+leads+to+memory+deficits+and+loss+of+functional+synapses+in+a+novel+mutated+tau+transgenic+mouse+without+any+motor+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease-like tau neuropathology leads to memory deficits and loss of functional synapses in a novel mutated tau transgenic mouse without any motor deficits.</a> Am J Pathol. 169, 599-616 (2006).</li>
<li>Veenstra, T. D., Marcus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+advancement+of+neuroproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multidimensional advancement of neuroproteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 5, 149-151 (2008).</li>
<li>Hernandez-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotonic+dystrophy+CTG+expansion+affects+synaptic+vesicle+proteins%2C+neurotransmission+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Myotonic dystrophy CTG expansion affects synaptic vesicle proteins, neurotransmission and mouse.</a> 136, 957-970 (2013).</li>
<li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+staging+of+synucleinopathy+and+amyloid+deposition+in+dementia+with+Lewy+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Biochemical staging of synucleinopathy and amyloid deposition in dementia with Lewy bodies.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 65, 278-288 (2006).</li>
<li>Tofaris, G. K., Razzaq, A., Ghetti, B., Lilley, K. S., Spillantini, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitination+of+alpha-synuclein+in+Lewy+bodies+is+a+pathological+event+not+associated+with+impairment+of+proteasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ubiquitination of alpha-synuclein in Lewy bodies is a pathological event not associated with impairment of proteasome function.</a> J Biol Chem. 278, 44405-44411 (2003).</li>
<li>Sergeant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Truncated+beta-amyloid+peptide+species+in+pre-clinical+Alzheimer%27s+disease+as+new+targets+for+the+vaccination+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer's disease as new targets for the vaccination approach.</a> J Neurochem. 85, 1581-1591 (2003).</li>
<li>Le Freche, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+phosphorylation+and+sevoflurane+anesthesia%3A+an+association+to+postoperative+cognitive+impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Tau phosphorylation and sevoflurane anesthesia: an association to postoperative cognitive impairment.</a> Anesthesiology. 116, 779-787 (2012).</li>
<li>Leboucher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detrimental+effects+of+diet-induced+obesity+on+tau+pathology+are+independent+of+insulin+resistance+in+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Detrimental effects of diet-induced obesity on tau pathology are independent of insulin resistance in tau transgenic mice.</a> Diabetes. 62, 1681-1688 (2013).</li>
<li>Deramecourt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+neuropathological%2C+and+biochemical+characterization+of+the+novel+tau+mutation+P332S%5BTitle%5D)+AND+%22J+Alzheimers+Dis%22%5BJournal%5D)">Clinical, neuropathological, and biochemical characterization of the novel tau mutation P332S.</a> J Alzheimers Dis. 31, 741-749 (2012).</li>
<li>Birdsill, A. C., Walker, D. G., Lue, L., Sue, L. I., Beach, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmortem+interval+effect+on+RNA+and+gene+expression+in+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Postmortem interval effect on RNA and gene expression in human brain tissue.</a> Cell Tissue Bank. 12, 311-318 (2011).</li>
<li>Bell, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+a+twenty-first+century+brain+bank%3A+experience+in+the+BrainNet+Europe+consortium%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Management of a twenty-first century brain bank: experience in the BrainNet Europe consortium.</a> Acta Neuropathol. 115, 497-507 (2008).</li>
<li>Crecelius, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+quantitative+post-mortem+changes+in+the+gray+matter+of+the+human+frontal+cortex+proteome+by+2-D+DIGE%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Assessing quantitative post-mortem changes in the gray matter of the human frontal cortex proteome by 2-D DIGE.</a> Proteomics. 8, 1276-1291 (2008).</li>
<li>Swatton, J. E., Prabakaran, S., Karp, N. A., Lilley, K. S., Bahn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+human+postmortem+brain+using+2-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+%282-D+DIGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of human postmortem brain using 2-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2-D DIGE).</a> Mol Psychiatry. 9, 128-143 (2004).</li>
<li>Viswanathan, S., Unlu, M., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+difference+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional difference gel electrophoresis.</a> Nat Protoc. 1, 1351-1358 (2006).</li>
<li>Tannu, N. S., Hemby, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+fluorescence+difference+gel+electrophoresis+for+comparative+proteomics+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis for comparative proteomics profiling.</a> Nat Protoc. 1, 1732-1742 (2006).</li>
</ol>

Autores têm nenhum conflito de interesses a declarar.

Descobrindo as mudanças de expressão de proteínas patológicas, busca de biomarcadores ea modulação de vias potenciais para alvos farmacológicos estão entre os objectivos dos neuroproteomics aproxima 30. Entre as ferramentas emergentes, o campo 2DE adiciona uma expectativa promissora. No entanto, um consenso deve ser atingido de modo a minimizar a variabilidade e aumentar a reprodutibilidade dos experimentos. Na linha de esta ideia de um protocolo padronizado para realizar 2D-DIGE (Figura 2) e...

Os transtornos mentais e neurológicos representam 13% da carga global de doenças, novos desafios, como os mecanismos fisiopatológicos, fatores de risco e biomarcadores prodromal deve ser explorado 1. Em linha com esse objetivo, proteômica estudos do cérebro humano tornou indispensável para descobrir vias moleculares envolvidas em processos como a memória, o comportamento, as emoções e plasticidade neuronal, por exemplo, não só para o fisiológico, mas também para condições patológicas. Portanto, a utilização de modelos animais e, mais especificamente, os ratinhos transgénicos, leva uma ampla gama de possibilidades para imitar a etiologia de desordens neurodegenerativas humanas 2. Abordagens proteômicas estão hoje disponíveis, a fim de realizar estas novas perspectivas no campo da neurociência. Electroforese em gel bidimensional (2DE) é um método simples e potente provável que permite comparar o proteoma de uma vasta gama de amostras. Além disso, é também umpoderoso método para isolar uma proteína a partir de uma mistura complexa, a fim de identificar e analisar mais por espectrometria de massa. Esta técnica consiste, essencialmente, em duas etapas sucessivas: 1) a separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoeléctrico (pi) por isoelectrofocusing (IEF). Mais precisamente, um potencial elétrico é aplicado através das tiras de acrilamida Immobiline entre um gradiente de pH e, em seguida, as proteínas irão migrar e se concentrar em um pI determinado em função de sua carga líquida global. 2) proteínas Isoelectrically focadas são desnaturados e negativamente carregados pela adição de dodecilsulfato de sódio (SDS), desse modo as proteínas na sua primeira estrutura são separadas de acordo com o seu peso molecular aparente (MW) por SDS-PAGE 3. Estas duas propriedades distintas nos permitem enfrentar um duplo valor para ir mais longe no estudo do proteoma. Por um lado, esta abordagem oferece a possibilidade de realizar uma análise quantitativa utilizando corantes mínimas método 2D-DIGE, e por outro lado um qualitativanálise e por mini-2DE acoplada a transferência de western. A análise quantitativa por 2D-DIGE concede a expressão da proteína muda todo o proteoma amostra. Resumidamente, as amostras são rotulados com três cianinas (Cy2, Cy3 e Cy5) emitindo em três comprimentos de onda diferentes (azul, verde e vermelho). Estes corantes fluor mínimo contendo grupo de éster N-hidroxi succinimidil reagir com o grupo ε-amino de lisinas de resíduos de proteínas, resultando em ligações covalentes amida 4. Resíduos de lisina são rotulados apenas entre 1-3% e evitando assim várias etiquetas por adição de proteína e grandes modificações carga líquida 5, 6. Cy3 e Cy5 são muitas vezes utilizados para rotular duas amostras independentes, enquanto Cy2 Tag uma mistura de igual proporção das amostras para comparar. As duas principais vantagens são de que todas as amostras marcadas são misturadas e IEF e SDS-PAGE são realizadas em um gel de uma só vez para cada passo, evitando inter variabilidade entre experiências, devido à géis de comparação. Além disso, apresenta-se um limiar de detecção de pico de cerca de 1 femtomole de proteína 7. Géis são digitalizados e software 2D compara as imagens de fluorescência de gel 2D, onde Cy2 serve como padrão interno permitindo a identificação de diferenças estatísticas entre os pontos para a sua posterior identificação por espectrometria de massa. O software de análise de 2D utilizando o padrão interno atinge uma rápida detecção de menos do que 10% das diferenças entre as amostras com mais de 95% de confiança estatística 8. A análise qualitativa por mini-2DE é um passo crucial para a caracterização de proteínas. O princípio é o mesmo que anteriormente descrito para a separação de pI e PM, mas, neste caso, as proteínas são transferidas a partir de um pequeno gel de poliacrilamida para uma membrana e imunotransferência é executada posteriormente. Enquanto uma dimensão de electroforese em gel proporciona as alterações na expressão de proteína por um ou vários epitopos da proteína em função do anticorpo, o INFORMAÇÃOn de mini-2DE dota com dois parâmetros adicionais. Em primeiro lugar, os isovariants proteína mudar em função do pI, indicando que as modificações pós-traducionais pode ter lugar. Em segundo lugar, a identificação de espectrometria de massa pode ser um indicativo de zimogénios plausíveis e produtos do catabolismo de proteínas. Portanto, as modificações observadas por 2D-DIGE provavelmente indicativo dos mecanismos de mudanças no perfil global proteoma subjacentes. Alinhamentos de immunoblots entre várias amostras para o mesmo epítopo de proteína / s por mini-2DE podem refletir mudanças de acidez derramando luz em variações pós-traducionais pouco observados ou até mesmo não por immunoblotting monodimensional 9, 10. Além disso, esta análise informa sobre os potenciais locais de clivagem, devido ao conhecimento do pI e PM dos resíduos metabólicos 11,12. A combinação destas duas técnicas proporciona uma análise proteômica complementar. Por um lado 2D DIGE oferece um tipe das diferenças, permitindo um isolamento precisa de polipéptidos, cuja expressão é diferente. Essas diferenças consistem essencialmente no aparecimento ou desaparecimento de uma mancha ou aumento / diminuição da intensidade de um dado, uma a análise dos géis fluorescentes software. No entanto, estas observações são, por si só não consegue explicar a natureza da modificação observada. Por estas razões, uma vez que o polipéptido é isolado e identificado por espectrometria de massa, a utilização de mini-2DE permite confirmar precisamente 1) A identidade da proteína isolada e 2) a natureza da diferença: a mudança no nível isovariant / isoforma expressão, modificações pós-traducionais e os processos de clivagem, por exemplo. No entanto, é necessário o desenvolvimento de um tampão de lise a partir tanto compatíveis com o 2D-DIGE e com mini-2DE, a fim de limitar as dispersões potenciais resultantes da utilização de protocolos de extracção que são muito diferentes. No presente artigo, desdescrito um protocolo adaptado para a preparação, extracção e desempenho de 2D-DIGE e técnicas de mini-2DE de proteínas cerebrais provenientes de tecido humano e de rato.

<table><tbody><tr><td>CyDye DIGE FLUOR MIN KIT 5 nmol 1 * 5 Nmo</td><td>GE Healtcare</td><td>25-8010-65</td><td></td></tr><tr><td>Immobiline DryStrip</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Referência em função do intervalo/tamanho do pH</td></tr><tr><td>IPG Buffer, pH X-X</td><td>GE Healtcare</td><td></td><td>Referência em função do intervalo de pH desejado</td></tr><tr><td>AMBERLITE IRN-150L RESINA DE LEITO MISTO 1&nbsp;</td><td>GE Healtcare</td><td>551797N</td><td></td></tr><tr><td>DRYSTRIP COVER FLUID IMMOBILINE 1 * 1 l</td><td>KIT CAIXA GE Healtcare</td><td>17-1335-01</td><td></td></tr><tr><td>IPG 1 * 1 KIT</td><td>GE Healtcare</td><td>28-9334-92</td><td>Caixa de plástico para fazer a reidratação passiva&nbsp;</td></tr><tr><td>Filtro MILLEX GS</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td></td></tr><tr><td>Criterion XT Géis Pré-moldados 13.3 x 8.7 cm (L x C)</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Referência em função do MW para separar</td></tr><tr><td>a Unidade de Foco Isoelétrico IPGphor III</td><td>GE Healtcare</td><td>11-0033-64</td><td></td></tr><tr><td>Ettan DALTsix Sistema de Eletroforese Grande</td><td>GE Healtcare</td><td>80-6485-08</td><td></td></tr><tr><td>OneTouch 2D Gel SpotPicker 1.5 mm&nbsp;</td><td>Empresa de Gel</td><td>P2D1.5</td><td></td></tr></tbody></table>

proteína consenso brain-derivada, protocolo de extração para o estudo do cérebro humano e murino proteome usando ambas 2d dige e mini 2de immunoblotting

Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Electroforese em gel bidimensional (2DE) é uma ferramenta poderosa para detectar modificações proteoma potencialmente relacionados com diferentes condições fisiológicas ou patológicas. Basicamente, esta técnica baseia-se na separação de proteínas de acordo com o seu ponto isoelétrico, num primeiro passo, e em segundo lugar de acordo com os seus pesos moleculares por electroforese SDS em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Neste relatório, um protocolo de preparação da amostra otimizado para pouca quantidade de post-mortem e cérebro do rato tecido humano é descrito. Este método permite efectuar tanto a electroforese bidimensional em gel diferença de fluorescência (2D-DIGE) e mini-imunotransferência 2DE. A combinação destas abordagens permite não só para encontrar novas proteínas e / ou modificações de proteínas em sua expressão, graças à sua compatibilidade com detecção por espectrometria de massa, mas também uma nova visão sobre a validação de marcadores. Assim, mini-2DE acoplado a licenças de Western blotting para identificar e validar pós-Translacionais modificações, proteínas catabolismo e fornece uma comparação qualitativa entre diferentes condições e / ou tratamentos. Aqui, nós fornecemos um método para estudar componentes de agregados de proteínas encontradas na DA e demência de Lewy, como o peptídeo beta-amilóide e da alfa-sinucleína. O nosso método pode assim ser adaptado para a análise do proteoma e proteínas insolúveis extrair a partir de modelos de tecido do cérebro e ratos humanos também. Em paralelo, pode fornecer informações úteis para o estudo de vias celulares e moleculares envolvidos em doenças neurodegenerativas, bem como potenciais novos biomarcadores e alvos terapêuticos.

Proteômica no tecido cerebral continua sendo um desafio uma vez que não existe tampão ideal para recuperar 100% de proteínas, as proteínas do citoesqueleto, especialmente associada membrana ou. O primeiro conjunto de experimentos foram focados na busca de um tampão de lise adequado compatível com as duas abordagens e que permite recuperar um grande painel de proteína. Assim, três tampões de lise foram ensaiadas para determinar o mais adequado. Em primeiro lugar, utilizou-se o tampão de biologia molecular e bioquímica co...

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

O objetivo geral do experimento a seguir é extrair proteínas de tecido cerebral humano e de camundongo para análise proteômica. Isso é realizado utilizando um tampão de lise comum para obter a mesma extração de proteínas adaptada para abordagens de eletroforese bidimensional. Em seguida, a eletroforese bidimensional por diferença de fluorescência é usada para separar as proteínas para identificação por espectrometria de massas.Em seguida, realiza-se uma eletroforese em gel 2D miniatura com imunodetecção para identificar modificações pós-traducionais. Os resultados podem mostrar a expressão proteica global. As alterações traducionais do hospedeiro e todos os produtos ligantes e catalíticos são separados com base nas diferenças no ponto isoelétrico e no peso molecular.A combinação de 2D dash e 2D monolo pode nos ajudar a responder questões fundamentais no campo da neuroproteômica, fornecendo simultaneamente informações sobre alterações na expressão. Modificação pós-inal e catabolismo em produtos iniciam-se com a coleta e homogeneização do tecido cerebral. Prepare o tecido em 10% peso por volume em tampão de extração para tecido cerebral humano.Homogeneíze o tecido usando uma pipeta de vidro, no entanto, utilize um homogeneizador de teflon para tecido de roedor a fim de desintegrar qualquer homogeneizado. Sonique a 60 hertz usando 30 pulsos de meio segundo. Em seguida, determine a concentração de proteína por meio de um ensaio de Bradford utilizando BSA como padrão.Agora, reúna as soluções para a precipitação com clorofórmio-metanol em um banho de gelo. Planeje coletar cerca de 125 microgramas para tiras IPG de 11 centímetros ou cerca de 1,25 miligramas para tiras IPG de 18 centímetros. Assim que as soluções atingirem quatro graus Celsius, realize a precipitação completamente sobre gelo.Primeiro, adicione três volumes de metanol, depois um de clorofórmio. Agite esta mistura. Em seguida, adicione três volumes de água fria.Vortex, essa mistura por um minuto, centrifugue o tubo da amostra a 12.000 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione três volumes de metanol, vortex e centrifugue as proteínas da mesma maneira.Seque o pellet proteico coletado sob gás nitrogênio antes da DIGE 2D. Re suspenda a proteína em tampão 2D a 2,5 miligramas por mililitro. Em seguida, sonique as amostras como feito anteriormente até que sejam utilizadas.Armazene-os a menos 80 graus Celsius antes de iniciar esta etapa e após a precipitação das proteínas. É necessário determinar novamente a concentração proteica por meio do ensaio de Bradford. Siga o mesmo procedimento mostrado anteriormente antes da marcação com o corante psy.A qualidade da amostra proteica é verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS para essa finalidade. Dilua 15 microgramas de proteína em LDS e aqueça a 37 graus Celsius em banho-maria ou bloco térmico. Em seguida, submeta as amostras a uma eletroforese em gel de poliacrilamida e cora o gel com solução de azul de comassie por pelo menos uma hora.Em seguida, mantenha o gel durante a noite em uma solução de ácido acético 7% e etanol 10%. Uma vez estabelecida a qualidade da amostra proteica, no dia seguinte inicia-se o procedimento de marcação com SD. Primeiro, meça o pH do lisado, que deve ser básico ou neutro.O pH ideal é 8,6 para as reações subsequentes. Em seguida, prepare as reações de conjugação com corante para cada amostra proteica. Misture 50 microgramas com 400 picomoles do corante S3 e 50 microgramas com 400 picomoles do corante S cinco.Realize isso em quadruplicata, perfazendo um total de oito reações de acoplamento D por amostra. Para cada amostra testada, prepare um conjunto complementar de reações de acoplamento DI utilizando proteína do controle, como por exemplo de um cérebro doente. Em seguida, para cada par de reações, monte uma reação controle interna com 400 picomoles de CY dois e uma representação equitativa de todas as proteínas, totalizando 250 microgramas.A marcação com SAI é realizada incubando todas as misturas de reação a quatro graus Celsius, no escuro, durante uma hora. Após a incubação, combine todos os conjuntos de três reações cian diferentes em volumes de 150 microlitros, adicionando a cada conjunto 200 microlitros de tampão 2D. Em seguida, prossiga com os passos da eletroforese 2D.Inicie preparando soluções de proteína não marcadas para o gel preparativo, do qual serão excisados pontos proteicos para cada amostra e para o controle positivo. Aliquote de 300 a 350 microgramas de proteína não marcada em tampão 2D e permita que eles se reidratem em contato com a fita IPG. Em seguida, carregue as fitas IPG e transfira as proteínas marcadas e não marcadas para uma reidratação.Cubra então cada poço com uma tira de reação IPG. Em seguida, adicione uma camada de óleo mineral e deixe as tiras reidratarem passivamente com a solução proteica durante a noite a não mais de 25 graus Celsius. No dia seguinte, realize a focalização isoelétrica das tiras IPG.Em seguida, remova o óleo e armazene as tiras IPG a menos 20 graus Celsius para equilibrá-las. Mergulhe-as no tampão de equilibração por 15 minutos. Em seguida, transfira as tiras para acetamida 4,7%IDO no tampão de equilibração, sem DTT, enquanto mantém as tiras em imersão.Utilize um sistema de eletroforese bidimensional de grande porte para preparar quatro géis de SDS-PAGE a 12% por amostra em placas de vidro com baixa fluorescência, destinados às proteínas marcadas. Prepare também um gel de SDS-PAGE a 12% em placas de vidro padrão com espessura de 1,5 milímetro para cada uma das proteínas não marcadas. Estes são os géis preparativos.Após o resfriamento dos géis, transfira as tiras para o topo dos géis e recubra-as com Aros 0,5%. Após o resfriamento, execute os géis a 2,5 watts a quatro graus Celsius durante a noite e analise-os no dia seguinte. Muitas reações bidimensionais podem ser realizadas com amostras de proteínas utilizadas para os géis preparativos. Meça menos de 100 microgramas da amostra em 200 microlitros de tampão 2D.Em seguida, agite vigorosamente as misturas da amostra e faça uma centrifugação rápida. Carregue as amostras em tiras IPG de 11 centímetros e deixe-as reidratar passivamente durante a noite, cobertas com óleo mineral, no dia seguinte. Realize a focalização isoelétrica.Em seguida, mova as tiras por três banhos de tampão de equilíbrio durante 15 minutos por banho. As tiras são então eletroforadas em géis de SDS-PAGE 2D. Coloque cada tira sobre um gel pré-moldado da massa molecular apropriada.Poliacrilamida para a proteína de interesse. Posteriormente, transfira os géis para membrana de NITROCELULOSE PVDF e analise-os com anticorpos no desenvolvimento deste protocolo. Três tipos diferentes de lise.Os tampões foram testados. Primeiramente, um tampão comum em bioquímica e biologia molecular. O Tris SDS foi testado.O Tris SDS apresentou baixa resolução em comparação com outro tampão testado, o UTS. O terceiro tampão foi descartado, pois amostras testáveis não puderam ser preparadas com ele. Em seguida, foram investigados os proteomas de cérebro humano e de camundongo.Amostras de córtex controle humano e amostras de córtex com DA foram comparadas. Proteínas cerebrais de camundongos com patologia de tau semelhante à DA também foram analisadas a partir da amostra humana. SCI dois foi analisado independentemente, assim como S SI três e sci cinco para cada D. A alta resolução do ponto facilitou o alinhamento.Uma análise qualitativa mini 2D foi utilizada para investigar modificações pós-traducionais e verificou-se que a alfa-sinucleína na tecido ad tinha um perfil normal, mas também foi encontrada como um dímero marcado por um asterisco. As setas indicam os locais onde a alfa-sinucleína foi detectada. A proteína precursora do amiloide ubiquitinada também foi observada por meio da mini 2D.AD esporádica foi comparada com AD familiar. Na AD familiar, o beta amiloide 1 a 42 e a variância ISO apresentam concentrações mais baixas porque formas ligadas foram encontradas em oito quilodaltons. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como estudar o proteoma para comparar amostras complexas mediante a medição de modificações na expressão proteica.

consensus-brain-derived-protein-extraction-protocol-for-study-human

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JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

A identificação de moléculas e vias que controlam a plasticidade sináptica e a memória ainda é um grande desafio na neurociência. Aqui, é descrito um fluxo de trabalho abordando a quantificação relativa de proteínas sinápticas supostamente envolvidas na reorganização molecular das sinapses durante a aprendizagem e consolidação da memória em um paradigma de aprendizagem auditiva.

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

Um protocolo de fracionamento abreviado para o enriquecimento dos agregados de proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte é descrito.

Enriquecimento de agregados da proteína insolúvel em detergente do cérebro humano após a morte

Aqui, apresentamos uma eletroforese em gel bidimensional (2DE) acoplada com espectrometria de massa (MS) para separar e identificar adenoma de hipófise humana tecido proteome, que apresenta um padrão de 2DE bom e reprodutíveis. Muitas proteínas são observadas em cada ponto de 2DE quando analisando proteome complexo de câncer com o uso de MS de alta sensibilidade.

Eletroforese em Gel bidimensional juntamente com métodos de espectrometria de massa para uma análise do proteoma de tecido humano Adenoma de hipófise

Aqui, descrevemos uma abordagem quantitativa para determinar a distribuição de uma proteína sináptica em relação uma proteína de marcador usando a mancha da imunofluorescência, microscopia confocal e análise baseada em computador.

Quantificar a distribuição heterogênea de uma proteína sináptica no cérebro do rato utilizando imunofluorescência

Apresentamos um método para a purificação, detecção e identificação de peptídeos diGly que se originam de proteínas ubiquitinadas de amostras biológicas complexas. O método apresentado é reprodutível, robusto e supera os métodos publicados em relação ao nível de profundidade da análise ubiquitinome.

Detecção de locais de ubiquitinação de proteínas por enriquecimento de peptídeos e espectrometria de massa

Este método descreve uma abordagem robusta e reprodutível para a comparação dos níveis de proteína nos tecidos diferentes e em diferentes momentos do desenvolvimento, utilizando uma abordagem de mancha ocidental quantitativa padronizada.

Robusta comparação dos níveis de proteína através de tecidos e durante todo o desenvolvimento usando mancha ocidental quantitativa padronizada

Aqui, nós apresentamos um protocolo que use tinturas near-infrared conjuntamente com a exploração immunohistochemistry e de alta resolução às proteínas do ensaio em regiões do cérebro.

Usando a fluorescência near-infrared e a exploração de alta resolução para medir a expressão da proteína no cérebro do roedor

O protocolo visa introduzir o uso de um espectrômetro de massa quadrupole triplo para monitoramento de reação múltipla (MRM) de proteínas de amostras clínicas. Fornecemos um fluxo de trabalho sistemático desde a preparação da amostra até a análise de dados para amostras clínicas com todas as precauções necessárias a serem tomadas.

Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa usando detecção baseada em monitoramento de múltiplas reações de proteínas do tecido cerebral humano

Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.

Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro

Neste artigo, vamos examinar os efeitos da Theta-Burst estimulação TMS sobre a plasticidade cortical em indivíduos que sofrem de síndrome do X Frágil e indivíduos do espectro autista.

TMS: Usando o protocolo Theta-Burst para Explorar Mechasnism de Plasticidade em Indivíduos com Síndrome do X Frágil e Autismo

Aprenda a extrair proteínas de tecido cerebral humano e murino usando tampão de lise comum para análise proteômica. Este método emprega eletroforese bidimensional e imunoblotting para identificar modificações pós-traducionais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting (Vídeo) | JoVE Journal

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

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