Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

O objetivo geral do experimento a seguir é extrair proteínas do tecido cerebral humano e de camundongo para análise proteômica. Isso é obtido usando um tampão de lise comum para obter a mesma extração de proteína adaptada para abordagens de eletroforese bidimensionais. Em seguida, a eletroforese em gel de diferença de fluorescência bidimensional é usada para separar proteínas para identificação por espectrometria de massa.

Isso é seguido por uma eletroforese em gel 2D em miniatura com immunoblotting para identificar modificações pós-traducionais. Os resultados podem mostrar a expressão global da proteína. A translação do hospedeiro altera todos os produtos de ligamentização e catalíticos com base nas diferenças no ponto isoelétrico e no peso molecular.

A combinação de traço 2D e monolo 2D pode nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo da neuroproteômica, fornecendo simultaneamente informações sobre mudanças de expressão. Modificação postal e catabolismo em produtos Comece com a colheita e homogeneização do tecido cerebral. Prepare o tecido a 10% de peso para volume em tampão de extração para tecido cerebral humano.

Homogeneizar o tecido usando um Pipetter de vidro, no entanto, use um homogeneizador de Teflon para que o tecido de roedores se desintegre de qualquer homogeneizado. Sonicar a 60 hertz usando pulsos de 30 segundos e meio. Em seguida, determine a concentração de proteína com um ensaio de Bradford usando BSA como padrão.

Agora reúna as soluções para precipitação de clorofórmio e metanol em um balde de gelo. Planeje coletar cerca de 125 microgramas para tiras IPG de 11 centímetros ou cerca de 1,25 miligramas para tiras IPG de 18 centímetros. Quando as soluções estiverem a quatro graus Celsius, execute a precipitação completamente no gelo.

Primeiro, adicione três volumes de metanol e depois um de clorofórmio. Agite esta mistura. Em seguida, adicione três volumes de água fria.

Vórtice, esta mistura por um minuto centrifuga o tubo de amostra a 12.000 Gs por 30 minutos a quatro graus Celsius. Aspire e descarte o sobrenadante. Em seguida, adicione três volumes de vórtice de metanol e gire as proteínas da mesma maneira.

Seque o pellet de proteína coletado sob gás nitrogênio antes do DIGE 2D. Suspenda novamente a proteína em tampão 2D a 2,5 miligramas por mililitro. Em seguida, sonice as amostras como feito antes até que sejam usadas.

Armazene-os a menos 80 graus Celsius antes de iniciar esta etapa e após a precipitação da proteína. É necessário determinar a concentração de proteínas mais uma vez pelo ensaio de Bradford. Seguindo o mesmo procedimento mostrado anteriormente antes da rotulagem do corante psy.

A qualidade da amostra de proteína é verificada pela página SDS para esse fim. Dilua 15 microgramas de proteína em LDS e hegue-o a 37 graus Celsius em um banho de calor ou bloco. Em seguida, passe-os em um gel de poliacrilamida e core o gel com solução de azul de kumasi por pelo menos uma hora.

Em seguida, detenha o gel durante a noite em solução de ácido acético a 7% e etanol a 10%. Uma vez estabelecida a qualidade da amostra de proteína, no dia seguinte o procedimento de marcação SD é iniciado. Primeiro meça o pH do lisado, que deve ser básico a neutro.

O pH ideal é 8,6 para reações subsequentes. Em seguida, configure as reações de conjugação do corante para cada amostra de proteína. Misturar 50 microgramas com 400 picomoles de corante S3 e 50 microgramas com 400 picomoles de corante S cinco.

Faça isso em quadruplex para um total de oito reações de acoplamento D por amostra. Para cada amostra testada, faça um conjunto complementar de reações de acoplamento DI usando proteína do controle, como de um cérebro doente. Em seguida, para cada par de reações, estabeleça uma reação de controle interno com 400 picomoles de CY dois e uma representação uniforme de todas as proteínas, totalizando 250 microgramas.

A marcação SAI é obtida incubando todas as misturas de reação a quatro graus Celsius no escuro por uma hora. Após a incubação, combine todos os conjuntos de três reações ciano diferentes em volumes de 150 microlitros para cada conjunto de reações a 200 microlitros de tampão 2D. Em seguida, prossiga com as etapas de eletroforese 2D.

Comece com a preparação de soluções proteicas não marcadas para o gel preparativo do qual os pontos de proteína serão excisados para cada amostra e para o controle positivo. Alíquota de 300 a 350 microgramas de proteína não marcada em tampão 2D e deixe-os reidratar em contato com a tira de IPG. Em seguida, carregue as tiras de IPG para transferir a proteína marcada e a não rotulada para uma reidratação.

Bem, então cubra cada poço com uma tira de reação IPG. Em seguida, aplique uma camada de óleo mineral e permita que as tiras se reidratem passivamente com a solução de proteína durante a noite a não mais de 25 graus Celsius. No dia seguinte, realize a focalização isoelétrica das tiras IPG.

Em seguida, remova o óleo e armazene as tiras de IPG a menos 20 graus Celsius para equilibrar as tiras de IPG. Mergulhe-os no tampão de equilíbrio por 15 minutos. Em seguida, transfira as tiras para 4,7% de acetamida IDO em tampão de equilíbrio, sem TDT durante o banho das tiras.

Use um grande sistema de gel 2D para derramar quatro géis de página 12% SDS por amostra em placas de vidro de baixa fluorescência para as proteínas marcadas. Despeje também um gel de página 12% SDS em placas de vidro padrão de 1,5 milímetro de espessura para cada uma das proteínas não marcadas. Estes são os géis preparativos.

Quando os géis estiverem resfriados, transfira as tiras para o topo dos géis e cubra as tiras com 0,5% de Aros depois de resfriados, execute os géis a 2,5 watts a quatro graus Celsius durante a noite e analise-os no dia seguinte. Muitas reações 2D podem ser realizadas com amostras de proteínas usadas para os géis preparativos. Meça menos de 100 microgramas de amostra em 200 microlitros de tampão 2D.

Em seguida, agite vigorosamente as misturas de amostra e dê-lhes uma rotação rápida. Carregue as amostras em tiras de IPG de 11 centímetros e deixe-as reidratar passivamente durante a noite cobertas com óleo mineral no dia seguinte. Execute o foco isoelétrico.

Em seguida, mova as tiras através de três banhos de tampão de equilíbrio por 15 minutos por banho. As tiras são então executadas em géis de página SDS 2D. Colocar cada tira num gel pré-fabricado com o peso molecular adequado.

Poliacrilamida para a proteína de interesse. Posteriormente, transferir os géis para a membrana de PVDF de NITROCELULOSE e analisá-los com anticorpos no desenvolvimento deste protocolo. Três lise diferentes.

Os buffers foram testados. Em primeiro lugar, um tampão comum de biologia bioquímica e molecular. Tris SDS foi testado.

Tris SDS teve baixa resolução em comparação com outro buffer testado UTS. O terceiro buffer para de foi descartado, pois amostras testáveis não puderam ser preparadas com ele. Em seguida, os proteomas cerebrais humanos e de camundongos foram investigados.

Amostras de córtex de controle humano e amostras de córtex ad foram comparadas. Proteínas cerebrais de camundongos com patologia tau semelhante à DA também foram vistas da amostra humana. SCI dois foi analisado independentemente, assim como S, SI três e sci cinco para cada D. A alta resolução pontual facilitou o alinhamento.

A mini análise 2D qualitativa foi usada para investigar modificações pós-traducionais e uma alfa-sinucleína de ligamentização no tecido AD foi encontrada com um perfil normal, mas também encontrada como um dímero marcado por um asterisco. Setas marcavam onde a alfa-sinucleína foi encontrada. A proteína precursora de amilóide ubiquitinada também foi visualizada por mini 2D.

O anúncio esporádico foi comparado com o anúncio familiar. Na amilóide ad beta familiar de um a 42 e a variância ISO são menores na concentração porque as formas de liga foram encontradas em oito kilodaltons. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como estudar o proteoma para comparar amostras complexas medindo as modificações na expressão de proteínas.