Mapeando interações proteína-proteína disfuncionais na doença

Nosso trabalho mapeia interações disfuncionais proteína-proteína diretamente das células e tecidos nativos, revelando como a doença reconfigura as redes celulares. Diferentemente da maioria dos métodos interatômicos, o dfPPI não requer engenharia genética nem habilidades para as coortes de pacientes, utilizando uma captura multiplex por amostra. Para começar, prepare um tampão de extração proteica contendo 20 milimolares de Tris, 20 milimolares de cloreto de potássio, 5 milimolares de cloreto de magnésio e 0,01% de Nb-40.

Adicione protease e inibidores de fosfatase imediatamente antes do uso e mantenha o tampão no gelo. Coloque a amostra de tecido congelado em um tubo homogeneizador de micro tecido equipado com um pilão. Adicione de 500 a 700 microlitros do tampão nativo de lise, ajustando o volume com base na compacidade do tecido e na facilidade de homogeneização.

Em seguida, homogeneize a amostra no gelo movendo suavemente o pilão para cima e para baixo e contra as paredes abrasivas até obter uma suspensão uniforme. Incube os lisados a 4 graus Celsius por 30 minutos colocando o frasco em uma unidade de rotação. Misture suavemente as amostras durante a incubação por meio da rotação.

Usando uma centrífuga de bancada, centrifuge as amostras a 13.000 G por 10 minutos a 4 graus Celsius para remover detritos celulares. Colete cuidadosamente os supernadantes e transfira-os para tubos transparentes de microcentrífuga de 1,5 mililitro de cada um. Determine a concentração total de proteína no sobrenadante usando o Kit de Ensaio BCA conforme as instruções do fabricante.

Em seguida, pegue uma alíquota de esferas de poliuretano diretamente do estoque de isopropanol. Deixe as esferas assentarem para remover o solvente de armazenamento. Aspire cuidadosamente o isopropanol, depois adicione o tampão de lise nativo e ressuspenda completamente as esferas por pipeteamento suave ou inversão.

Para lavar e equilibrar as esferas, faça um vórtice no tubo e depois centrifuge-o. Depois disso, aspire o sobrenadante com uma linha de vácuo equipada com uma ponta de pipeta, tomando cuidado para não perturbar o pellet. Adicione buffer de fixação às contas lavadas em proporção igual para criar uma pasta de trabalho uniforme.

Aliquota de 40 microlitros de esferas de poliuretano em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, usando uma ponta de pipeta cortada para dispensação suave. Depois, lave as esferas três vezes com tampão de lise nativo adicionando 1 mililitro de tampão a cada tubo. Faça um vórtice no tubo para re-suspender as contas, depois centrifuge a 10.000 G por 1 minuto e descarte o sobrenadante por aspiração.

Após a lavagem final, remova a maior parte do líquido restante dos tubos, garantindo que o pellet de esferas permaneça intacto. Adicione os extratos proteicos normalizados a tubos individuais de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 40 microlitros de polpa de esferas de controle. Ajuste o volume final para 250 microlitros adicionando a quantidade apropriada de buffer nativo de lise.

Incube as amostras a 4 graus Celsius por 30 minutos com rotação em um rotador de ponta a ponta operando a 10-15 rotações por minuto. Centrifuge os tubos a 10.000 G por 1 minuto a 4 graus Celsius para granular as esferas de controle junto com proteínas agregadas ou insolúveis. Colete cuidadosamente o sobrenadante das esferas de controle usando uma pipeta de 1 mililitro e transfira-o para tubos novos de 1,5 mililitro contendo 40 microlitros de pasta de esferas de poliuretano lavado.

Incube as amostras a 4 graus Celsius por 3 horas com rotação em um rotador de ponta a ponta. Após centrifugar cuidadosamente os tubos, aspire o sobrenadante e lave as esferas quatro vezes, como demonstrado anteriormente. Remova qualquer PBS residual do tubo.

Ressuspenda as esferas lavadas em 80 microlitros de ureia de 2 molares, recém-preparada em bicarbonato de amônio 50 milimolares a pH 8,5, por pipeteamento ou vórtice breve. Depois, adicione ditiotreitol para alcançar uma concentração final de 1 milimolar. Após fechar o tubo, incube a 37 graus Celsius por 30 minutos com agitação a 1.100 rotações por minuto em um agitador orbital aquecido.

Adicione iodoacetamida para atingir uma concentração final de 3,67 milimolares. Incube os tubos no escuro em temperatura ambiente por 45 minutos, agitando a 1.100 rotações por minuto. Agora, adicione mais ditiotreitol para temperar qualquer iodoacetamida não reagida, garantindo uma concentração final de 3,67 milimolares e misture suavemente pipeteando.

Adicione 750 nanogramas de 0,5 miligramas por mililitro de protease Lys-C de grau espectrometria de massa à amostra. Incube a mistura a 37 graus Celsius por 1 hora, agitando a 1.150 rotações por minuto. Em seguida, adicione 750 nanogramas de tripsin de grau sequenciante de 0,5 miligrama recém-preparados à amostra.

Incube a mistura durante a noite a 37 graus Celsius com agitação a 1.150 rotações por minuto. No dia seguinte, centrifuge a amostra a 1.000-5.000 G por 1-5 minutos em temperatura ambiente. Transfira cuidadosamente o sobrenadante para um tubo novo de microcentrífuga de 1,5 mililitro usando uma pipeta, e descarte as contas.

Ajuste o pH da digestão para abaixo de 3, adicionando 50% de ácido trifluoroacético a gota. Verifique o pH usando tiras indicadoras. As esferas de PU capturaram HSP90, HSC70 e proteínas quentes fortemente do lisado alto do epichaperoma, com sinal mínimo do lisado baixo do epichaperoma, confirmando a especificidade biológica da sonda.

O perfil de carga da esfera de PU mostrou um sinal rico e de alto peso molecular na faixa das esferas de PU e fundo mínimo na faixa de controle das bolas, confirmando atividade de sondagem bem-sucedida. Géis SDS-PAGE coloridos com Coomassie apresentaram distribuição consistente de bandas em quatro amostras processadas em gel, confirmando o enriquecimento bem-sucedido de complexos proteicos de lisados nativos antes da espectrometria de massas. A reprodutibilidade técnica foi confirmada por análise de componentes principais, onde as amostras replicadas se agruparam de forma compacta enquanto diferentes amostras se separaram de forma limpa.

Distribuições de intensidade de íons precursores mostraram que a maioria das características apresentava coeficientes de variação abaixo de 20%, com valores medianos entre 9,7% e 11,9% entre as amostras, confirmando a detecção e recuperação consistente de peptídeos. O agrupamento hierárquico das abundâncias de proteínas transformadas em logarítmic revelou forte separação da amostra e preservou variação entre amostras, com intensidades proteicas que vão de baixa abundância a proteínas altamente enriquecidas. A análise de enriquecimento de vias demonstrou ampla cobertura de anotações em múltiplas ontologias, incluindo categorias de ontologias gênicas e bancos de dados curados, como Reactome, KEGG e WikiPathways.

O dfPPI nos permitiu descobrir insights mecanicistas e terapêuticos que outras abordagens simplesmente não conseguem alcançar. O dfPPI leva a interômica ao nível das coortes de doenças do mundo real e das condições nativas, possibilitando hipóteses mecanicistas e terapêuticas precisas. Agora estamos expandindo o dfPPI para mapear mudanças em nível de rede em doenças neurodegenerativas, como Alzheimer e Parkinson.