Name: Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-09-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Aprenda a criar um modelo murino pré-clínico de metástases hepáticas usando a técnica de injeção hemesplênica com células tumorais pancreáticas. Este método permite estudar a progressão metastática e testar novas terapias.

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KF e KO são co primeiros autores, juntamente com KS Este trabalho foi financiado em parte pelo AHPBA Fellowship (KS), NIH K23 CA148964-01 (LZ), Johns Hopkins School of Medicine Clinical Scientist Award (LZ), Fundação Viragh e do Centro de Câncer Ir Viragh pâncreas na Universidade Johns Hopkins (EMJ e LZ), a Fundação Nacional de Pâncreas (LZ), o Lefkofsky Família Foundation (LZ), o SPORE NCI em Gastrointestinal Cânceres P50 CA062924 (EMJ, LZ), a Fundação Lustgarten (LZ), e as bolsas Sol Goldman pâncreas Cancer Center (KS , BHE, LZ).

Todos os experimentos com animais conformados com as orientações do Comitê de Cuidados e Uso da Universidade Johns Hopkins animal, e os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes da Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório de Cuidados (AAALAC). O procedimento cirúrgico é realizado sob condições estéreis, numa sala de operações, que passa por um mínimo de quinze trocas de ar por hora. Todos os instrumentos são esterilizados em autoclave antes do procedimento e novamente com etanol a 70%, entre cada um dos ratinhos durante o procedimento. Todos os ratos que não se espera para sobreviver ao procedimento cirúrgico são sacrificados sob CO 2 durante 3 min, seguido por deslocação cervical, enquanto ainda sob anestesia. 1. celular Preparação <ol><li> Ressuspender as células em cultura in Panc02 salina tamponada com fosfato a 2 x10 7 células / ml, e manter em gelo. </li></ol> 2. Rato Preparação <ol><li> Administrar cetamina-E (100 mg / kg) misturado com xilazina (10 mg / kg) por via intraperitoneal com 8-12 semanas de idade C57BL / 6 fêmeas, em doses divididas. </li><li> Verifique se o dedo do pé retirada pitada reflexo é abolido para garantir que o mouse é totalmente anestesiado. </li><li> Administrar doses suplementares de cetamina (100 mg / kg) misturado com xilazina (10 mg / kg), conforme necessário para anestesiar completamente os ratinhos. </li><li> Aplicar Puralube Vet Pomada para os olhos dos camundongos para evitar a secagem quando os ratos estão sob anestesia. </li><li> Raspar a área cirúrgica dos ratinhos a fim de evitar a contaminação da ferida. </li><li> Prep a área subcostal esquerda da incisão com etanol a 70% e depois de iodo. </li><li> Coloque um campo cirúrgico em torno do abdômen para manter a esterilidade. </li></ol> 3. Laparotomia <ol><li> Fazer uma incisão subcostal esquerda em linha com a orelha esquerda através da pele e através do peritoneu utilizando um bisturi. </li><li> Expresse o baço através da incisão através da aplicação p digitais simultânearessão ao longo dos aspectos cranial e caudal da incisão. </li><li> Localizar os vasos sanguíneos do baço na extremidade inferior do baço. </li><li> Divida o baço, colocando dois Horizonte médias clips ligadura no centro do baço tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos do baço nos pólos do baço. </li><li> Inserir o pólo superior do baço de volta para o peritoneu para evitar a contaminação. </li></ol> 4 Tumor Injeção <ol><li> Desenha-se 150 ul de solução salina tamponada com fosfato para um 26 L x 5/8 &quot;seringa. </li><li> Elaborar 100 l de Panc02 (2 x10 6) células para a mesma seringa manter a seringa na posição vertical em todos os momentos durante a injecção. </li><li> Mergulhar a agulha numa solução de etanol a 70%. A agulha é imersa em etanol a 70% para assegurar a esterilidade. </li><li> Injetar as células lentamente no hemispleen exposto tendo a certeza da seringa é mantido na vertical em todos os momentos. O bisel da syringe devem ser observados em todos os momentos através da cápsula do baço para evitar a injeção das células sob o baço. A clareamento dos vasos baço e de sangue devem ser observados após a injecção. </li><li> Eleve o baço e aplicar um meio Horizon clipe sob o baço para ocluir os vasos sanguíneos do baço. </li><li> Aplicar um pequeno clipe Horizon para o aspecto mais distal do pâncreas e vasos esplênicos. </li><li> Ligadura do pâncreas e vasos esplênicos da hemispleen cortando acima dos clips horizonte. </li><li> Posicione o mouse sobre o seu &#39;lado, e irrigar a incisão com água destilada. </li></ol> 5. Abdominal Encerramento e recuperação da anestesia <ol><li> Feche o peritônio com um ponto 4-0 em execução. </li><li> Aplicar 2-3 clips de pele para fechar a incisão na pele. </li><li> Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina ou 5-10 mg / kg por via subcutânea Carprofen para aliviar a dor pós-cirúrgica. </li><li> Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento para recovery até celular eo mouse demonstra padrões respiratórios regulares. Os animais só são devolvidos para a companhia de outros animais depois de se recuperar totalmente do procedimento cirúrgico. </li></ol> 6. Necropsia Exame e colheita do Fígado <ol><li> Entre 30 a 60 dias após a cirurgia, os ratos começam a mostrar sintomas clínicos de metástase e vai exigir a eutanásia. Sinais de doença metastática que requerem a eutanásia humanitária incluem abdomens dilatados eo desenvolvimento de ascite. Eutanásia ratos por inalação de CO2. </li><li> Após a inalação, realizar deslocamento cervical. </li><li> Depois que o animal tenha sido determinada a ser não responsivo, fazer uma incisão através do peritônio para expor o abdômen com uma tesoura. </li><li> Utilizando uma pinça e uma tesoura, cortou delicadamente o fígado para fora do abdômen. </li><li> Coloque o fígado em composto outubro, eo flash congelar usando nitrogênio líquido. Armazenar o fígado a -80 ° C. Alternativamente, o ao vivor pode ser fixado em 16% de formalina neutra tamponada a TA durante 24 h e embebido em parafina. </li></ol>

<ol><li>American Cancer Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cancer+Facts+%26+Figures%22">Cancer Facts & Figures</a>. , American Cancer Society. Atlanta. (2013).</li>
<li>Clark, C. E., Beatty, G. L., Vonderheide, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+pancreatic+adenocarcinoma%3A+insights+from+genetically+engineered+mouse+models+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+letters%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of pancreatic adenocarcinoma: insights from genetically engineered mouse models of cancer.</a> Cancer letters. 279, 1-7 (2009).</li>
<li>Rhim, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMT+and+dissemination+precede+pancreatic+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">EMT and dissemination precede pancreatic tumor formation.</a> Cell. 148, 349-361 (2012).</li>
<li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature reviews. Cancer. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Corbett, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+chemotherapeutic+response+of+two+transplantable+ductal+adenocarcinomas+of+the+pancreas+in+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Induction and chemotherapeutic response of two transplantable ductal adenocarcinomas of the pancreas in C57BL/6 mice.</a> Cancer research. 44, 717-726 (1984).</li>
<li>Leao, I. C., Ganesan, P., Armstrong, T. D., Jaffee, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+depletion+of+regulatory+T+cells+allows+the+recruitment+of+mesothelin-specific+CD8+T+cells+to+the+antitumor+immune+response+against+a+mesothelin-expressing+mouse+pancreatic+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+translational+science%22%5BJournal%5D)">Effective depletion of regulatory T cells allows the recruitment of mesothelin-specific CD8 T cells to the antitumor immune response against a mesothelin-expressing mouse pancreatic adenocarcinoma.</a> Clinical and translational science. 1, 228-239 (2008).</li>
<li>Jain, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+effect+of+a+granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor-transduced+tumor+vaccine+and+systemic+interleukin-2+in+the+treatment+of+murine+colorectal+cancer+hepatic+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Synergistic effect of a granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-transduced tumor vaccine and systemic interleukin-2 in the treatment of murine colorectal cancer hepatic metastases.</a> Annals of surgical oncology. 10, 810-820 (2003).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+targeting+of+antitumor+immune+responses+with+engineered+live-attenuated+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Selective targeting of antitumor immune responses with engineered live-attenuated Listeria monocytogenes.</a> Cancer research. 66, 1096-1104 (2006).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+attenuated+Listeria+monocytogenes+effectively+treats+hepatic+colorectal+cancer+metastases+and+is+strongly+enhanced+by+depletion+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Live attenuated Listeria monocytogenes effectively treats hepatic colorectal cancer metastases and is strongly enhanced by depletion of regulatory T cells.</a> Cancer research. 67, 10058-10066 (2007).</li>
<li>Olino, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-associated+antigen+expressing+Listeria+monocytogenes+induces+effective+primary+and+memory+T-cell+responses+against+hepatic+colorectal+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+surgical+oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-associated antigen expressing Listeria monocytogenes induces effective primary and memory T-cell responses against hepatic colorectal cancer metastases.</a> Annals of surgical oncology. 19, Suppl 3. 597-607 (2012).</li>
<li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+cell%22%5BJournal%5D)">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer cell. 7, 469-483 (2005).</li>
<li>Marion, A., Aoudi, W., Basarab, A., Delachartre, P., Vray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+flow+evaluation+in+high-frequency%2C+40+MHz+imaging%3A+a+comparative+study+of+four+vector+velocity+estimation+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasonics%22%5BJournal%5D)">Blood flow evaluation in high-frequency, 40 MHz imaging: a comparative study of four vector velocity estimation methods.</a> Ultrasonics. 50, 683-690 (2010).</li>
<li>Zheng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+23+phosphorylation-dependent+cell-surface+localization+of+annexin+A2+is+required+for+invasion+and+metastases+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Tyrosine 23 phosphorylation-dependent cell-surface localization of annexin A2 is required for invasion and metastases of pancreatic cancer.</a> PloS one. 6, e19390(2011).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos de interesse relevantes para divulgar.

Este modelo murino pré-clínico de metástase do câncer pancreático para o fígado através de uma técnica de injeção hemispleen é o primeiro modelo descrito que espelha muitas das condições clínicas e imunológicas de pacientes com doença metastática para o fígado. Este modelo apresenta várias vantagens em relação aos outros modelos de murino. Em primeiro lugar, ao contrário dos modelos transgénicos de cancro pancreático, em que apenas 30% dos ratinhos desenvolvem metástases do fígado e a temporização de formação de metásta...

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos 1. A sobrevida em cinco anos para pacientes com PDA metastático é 2-12% 1. Embora a quimioterapia adjuvante e neoadjuvante para câncer de pâncreas é mais eficaz do que nunca hoje em dia, ainda há uma necessidade desesperada de novas terapias. O desenvolvimento de novas terapêuticas necessita de modelos animais pré-clínicos fidedignos. Embora os modelos de tumores subcutâneos são simples de utilizar, desvantagens incluem a incapacidade destes tumores e a metástase imitar a progressão do tumor e microambientes visto em cancros humanos. Modelos geneticamente modificados, tais como o rato geneticamente modificadas contendo Kras e p53 knock-in mutações oncogénicas (o modelo KPC) 2 e o modelo KPC com um marcador de linhagem YFP (o modelo PKCY 3) permitem o estudo de tumores que ocorrem naturalmente em immunocompetecamundongos NT. Além disso, o micro-ambiente do tumor é inalterada e é mais parecida com a observada na progressão de tumores humanos. Infelizmente, o tempo de desenvolvimento do tumor é variável dentro desses modelos, o que torna difícil de estudar terapias experimentais. Além disso, backcrossing desses ratos requer uma quantidade significativa de tempo e recursos financeiros, o que nem sempre é viável. Por fim, os modelos de mouse xenotransplante PDA implantados tornem indispensável ratos, que foram alterados ou microambientes tumorais ausentes imunocomprometidos. Como resultado, a eficácia de terapias experimentais demonstraram nestes modelos pré-clínicos são muitas vezes não reprodutíveis em ensaios clínicos humanos 4. Este modelo de rato hemiesplenectomia utiliza células tumorais Panc02, que são um, metilcolantreno induzida linha celular de tumor pancreático altamente tumorigénicas derivadas de C57BL / 6 5, 6. Além disso, outras linhas celulares PDA murino derivado do mic KPCe pode ser utilizado neste modelo. Schulick et al. Já desenvolveu uma técnica hemiesplenectomia e criou um modelo singênico rato de metástases de câncer de cólon 7. Este modelo hemiesplenectomia (Figura 1) oferece a inoculação do tumor consistente e iguais em camundongos imunocompetentes prestando-se à investigação de novos agentes terapêuticos 7-10.

<table><tbody><tr><td>Os meios e componentes</td><td></td><td></td> de cultura <td>celular variam dependendo da linha celular</td></tr><tr><td>Fosfato Tampolado Salino</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 15 ml Corning</td><td></td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de Operação Curva</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>RS-6835</td><td></td></tr><tr><td>Micro Dissecing Graefe Forceps</td><td>Roboz Surgical Store</td><td>Porta-agulha RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>(regular)</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sutura</td><td></td><td></td> 3-0 ou 4-0 <td>cortesia do departamento de cirurgia, Aplicador de</td></tr><tr><td>Clipe de Ligação Aberto Weck Horizon da Johns Hopkins, pequeno, angulado</td><td>Aplicador de Clipe de Ligação Aberto Teleflex</td><td>137085</td><td></td></tr><tr><td>Horizon, médio, angular</td><td>Teleflex</td><td>237115</td><td></td></tr><tr><td>Clipes de ligação médios Weck Horizon</td><td>Teleflex</td><td>002200</td><td></td></tr><tr><td>Clipes de ligação pequenos Weck Horizon</td><td>Teleflex</td><td>001200</td><td></td></tr><tr><td>Seringa, 1 cc, seringa de tb, ponta deslizante de 3/8"</td><td>Seringa Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>, seringa de 1 cc, tb, ponta deslizante de 5/8"</td><td>Becton Dickinson</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>aplicador de clipe automático de 9 mm</td><td>Mikron</td><td>427630</td><td></td></tr> Almofada de aquecimento <tr>de <td>427631</td><td></td> <td>Autoclip</td><td>Becton Dickinson</td> de 9 mm</tr><tr><td></td><td>Sunbeam</td><td>CAT93</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td>vendido por vários fornecedores</td></tr><tr><td>Cloridrato de Cetamina&nbsp;</td>Cloridrato de xilazina <td>Hospira</td><td>22395DD</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>X1251</td><td></td></tr></tbody></table>

um modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerosos modelos murinos foram desenvolvidas para estudar os cancros humanos e avançar o entendimento de tratamento e o desenvolvimento do cancro. Aqui, um modelo pré-clínico, murino tumor pancreático de metástases hepáticas através de uma injecção de células tumorais hemispleen pancreáticos de murino singeneicas é descrito. Este modelo imita muitas das condições clínicas em pacientes com doença metastática para o fígado. Ratos consistentemente desenvolvem metástases no fígado, permitindo a investigação do processo metastático, testes terapia experimental, e a pesquisa da imunologia tumoral.

Células tumorais Panc02 injetados na hemispleen (Figura 1) formar metástases hepáticas em 100% dos ratos, enquanto metástases pulmonares e peritoneal não são observados se a técnica é realizada corretamente. Esta técnica foi realizada em mais de cem ratos usando células Panc02 em vários experimentos independentes, e reprodutível, todos os ratos não tratados morrem com metástases hepáticas entre 30 e 60 dias após o procedimento hemiesplenectomia (Figura 2). Para obter significância estat...

A modelo pré-clínico, murino de metástases hepáticas realizado através de uma técnica de injeção hemispleen.

Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

O objetivo geral deste procedimento é criar um modelo pré-clínico que espelhe o câncer pancreático com metástases hepáticas por meio da técnica de hemicomissão esplênica. Isso é realizado primeiramente pela obtenção de uma suspensão de células únicas a partir de células tumorais pan O2 cultivadas. O segundo passo do procedimento consiste em expor e dividir o baço de um camundongo completamente anestesiado.Os próximos passos consistem em injetar células tumorais em um único hemicólera e remover o hemicólera injetado. O passo final é fechar o abdômen e recuperar o camundongo da anestesia. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram diferenças na progressão da doença metastática mediante o monitoramento da sobrevida, seguido de necropsia hepática e exames de imagem não invasivos adicionais.Essas técnicas podem ajudar a responder perguntas fundamentais na área de pesquisa do câncer, como identificar fatores-chave no processo metastático, testar novos agentes terapêuticos e realizar pesquisas em imunologia tumoral. As implicações dessa técnica estendem-se para o tratamento do câncer pancreático, porque camundongos imunocompetentes recebem inoculação tumoral idêntica, des

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Medicina

Este artigo descreve um procedimento para a indução de tumores de fígado ortotópico bioluminescentes em camundongos, e posterior análise do crescimento do tumor confinado ao fígado usando imagens de luminescência ao vivo de todo o corpo.

Modelo de tumor hepático murino Bioluminescent

Este modelo ortotópico de cancro de próstata humana permite a quantificação do tamanho do tumor, as células tumorais, e a formação de metástases distinta circulante para o pulmão. Como as células deve escapar o principal órgão, entrar na corrente sanguínea, e implantar em um site secundário, este modelo recapitula efetivamente o cenário em seres humanos.

Um Modelo murino de próstata humana Metástase Ortotópico

A propagação metastática do câncer é a principal causa de mortes relacionadas ao câncer. Nós fornecemos uma descrição detalhada da nossa metodologia cirurgia sobrevivência para o estabelecimento de um sistema modelo singï¿½ico rato "paciente-like" orthotopic para o estudo dos mecanismos de metástases em tumores de órgãos sólidos.

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A capacidade dos clones metastáticos de colonizar locais distantes depende de sua capacidade de proliferação e/ou de sua capacidade de sobreviver no microambiente hospedeiro sem proliferação significativa. Aqui, apresentamos um modelo animal que permite a visualização quantitativa de ambos os tipos de colonização hepática por clones metastáticos.

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Aprenda a criar um modelo murino pré-clínico de metástases hepáticas usando a técnica de injeção hemesplênica com células tumorais pancreáticas. Este método permite estudar a progressão metastática e testar novas terapias.

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