Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

O objetivo geral deste procedimento é realizar gravações de múltiplos arranjos de eletrodos de eventos ex vivo, interictais e semelhantes a convulsões do tecido cortical epiléptico humano, fornecendo assim uma maneira de abordar os mecanismos básicos subjacentes às atividades epilépticas, iniciação, propagação e os efeitos de drogas antiepilépticas nos níveis celular e de rede. Isso é feito primeiro ressecando cuidadosamente o tecido cortical humano de pacientes com epilepsia resistente a medicamentos durante a cirurgia. O segundo passo é remover os coágulos sanguíneos, vasos e meninges e o excesso de substância branca antes de fatiar.

Em seguida, corte o bloco de tecido em fatias de 400 mícrons. A etapa final é manter as fatias nas condições de interface de alta oxigenação e temperatura controlada com perfusão lenta. Em última análise, a técnica de arranjo de múltiplos eletrodos é usada para registrar atividades espontâneas semelhantes a interictais e eventos evocados semelhantes a ictais.

Nosso laboratório investiga o papel das interações neurogliais na fisiopatologia cerebral para estudar como as células neurais podem gerar atividade de rede patológica em humanos. Recentemente, estabelecemos gravações de vários eletrodos de tecido cortical epiléptico humano e pós-operatório em colaboração com hospitais de cuidados com o pescoço e de Petri de colo. Hoje, Thomas Blo, neurocirurgião do Neck Care Hospital, juntamente com Feld, epileptologista e pesquisador do Lapis Hospital e Elena DOI, pós-doutorando em meu laboratório, demonstrarão como realizar e fazer bom uso de tais técnicas.

Da coleta de tecido epiléptico humano às gravações MEA ex vivo, o uso de ECT de tecido cortical humano para curar pacientes epilépticos permite a exploração direta de neurônios epilépticos humanos e células gliais mantidos funcionalmente, que estão interconectados em redes específicas. Investigações in vitro, um tecido humano dá acesso a células únicas e atividades de rede, mecanismos baseados em iônicos, que não podem ser totalmente abordados in vivo. O registro MEA do tecido cortical humano pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo da epilepsia, como os mecanismos celulares subjacentes à exogênese e à propagação das convulsões.

A implicação desta técnica se estende à epilepsia lesional e sua terapia, pois permite entender os mecanismos da resistência farmacológica e o efeito da droga antiepiléptica no evento semelhante a uma convulsão registrado nas fatias corticais humanas. In vitro. A principal vantagem dos multi electro arrays sobre os métodos existentes, como e, e, g ou micro eletrodos in vivo, é que eles permitem a estimulação e o registro simultâneos e não invasivos de potenciais de campo e atividade multiunitária de vários lados do tecido.

Para iniciar o procedimento, prepare a câmara de interface enchendo primeiro a seção inferior com água destilada. Em seguida, conecte a câmara a uma fonte de carbogênio. Em seguida, corte um pedaço de tecido da lente para caber na área plana da câmara de fatia.

Coloque-o próximo ao tubo de entrada para permitir que as bolhas escapem da linha de entrada antes de atingir as fatias. Depois disso, corte dois pedaços de fio de algodão trançado com o mesmo comprimento do pedaço de tecido da lente. Coloque-os nas laterais da área plana da câmara, ajuste a vazão da bomba peristáltica para um mililitro por minuto.

Em seguida, ligue a oxigenação da água na parte inferior da câmara. Em seguida, defina o controlador de temperatura para 37 graus Celsius. Cubra a parte superior da câmara de interface com um pedaço de paraforma e espere pelo menos 30 minutos para que a temperatura aumente e se estabilize.

Agora, prepare as ferramentas de dissecação, que incluem duas pinças finas, uma espátula, uma colher pequena e uma lâmina, duas placas de Petri de vidro, dois pincéis e a cola de cianoacrilato. Em seguida, prepare o vibrato definindo os parâmetros para fatiar. Neste procedimento, remova o A CSF preparado à base de sacarose do freezer de 80 graus Celsius negativos e esmague-o até virar lama.

Oxigene-o com carbogênio. Em seguida, transfira 250 mililitros da lama de A CSF para uma garrafa de vidro e mantenha-a em uma garrafa cheia de gelo para coleta de tecido na sala de cirurgia. Sob anestesia geral padrão, use um sistema de neuronavegação para permitir uma localização precisa do córtex.

Depois, faça uma incisão na pele e, em seguida, crie um orifício no osso, seguido de uma craniotomia. Em seguida, eleve suavemente a aba óssea e abra a dura-máter com uma tesoura. Posteriormente, realize a ressecção em bloco do córtex epiléptico e evite coagulação extensa.

Corte um bloco cortical de um centímetro de espessura e coloque-o no LCR A à base de sacarose oxigenada congelada. Depois, transfira o tecido em A CSF congelado à base de sacarose para o laboratório o mais rápido possível, mas evitando choques mecânicos. Agora, encha uma placa de Petri e a bandeja tampão de vibrato com a lama oxigenada A CSF à base de sacarose e continue a oxigenar a lama A CSF com carbogênio.

Em seguida, retire cuidadosamente o lenço da garrafa com uma colher e coloque-o na placa de Petri. Usando a pinça, remova cuidadosamente os coágulos sanguíneos, vasos e meninges para evitar resistência durante o corte. Corte o lado do tecido com uma lâmina para obter uma superfície plana o mais paralela possível ao lado oposto do tecido.

Em seguida, cole o tecido na placa de amostra de vibrato para preparar fatias corticais transversais. Em seguida, coloque-o na bandeja tampão e corte fatias de 400 mícrons de espessura em baixa velocidade. Em seguida, corte alguns pedaços de tecido da lente com uma espátula e um pincel.

Transfira essas fatias de tecido do cristalino para a câmara de interface. Incube-os a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de gravar. Neste procedimento, conecte o sistema de perfusão a uma bomba peristáltica e o sistema MEA a um computador.

Em seguida, coloque um chip MEA vazio dentro do amplificador. Em seguida, ajuste o controlador de temperatura para aquecer o elemento da cânula na câmara MEA para 37 graus Celsius. Inicie a perfusão do LCR A oxigenado em cinco a seis mililitros por minuto.

Depois disso, abra o software de gravação. Certifique-se de que todos os eletrodos MEA estejam bem conectados e que não haja ruído devido à perfusão. Agora despeje um pouco de registro aquecido A CSF em uma placa de Petri de vidro.

Transfira uma fatia da câmara de interface para a placa de Petri agarrando o tecido da lente. Em seguida, retire cuidadosamente a fatia do tecido submergindo-a na solução ou use uma escova pequena para facilitar o descolamento. Em seguida, preencha o chip MEA com um pouco de A CSF.

Transfira a fatia para o chip MEA com uma espátula com uma pipeta de plástico. Remova suavemente a solução para fazer a fatia aderir à área do eletrodo e mantenha-a no lugar com uma âncora de platina. Depois disso, adicione um mililitro de gravação de um CSF ao chip MEA e coloque-o no amplificador.

Em seguida, inicie a perfusão em cinco a seis mililitros por minuto. Em seguida, verifique a posição da fatia na área de gravação MEA. Usando o software do monitor MEA, ajuste-o se necessário.

Para gravar a partir das camadas corticais e tirar uma foto, inicie a gravação. Este é um traço representativo da atividade de corte cortical humano registrada por um eletrodo MEA. No LCR A normal, é possível observar atividade espontânea semelhante à interictal 15 minutos após a perfusão com LCR A de potássio A de seis milimolares livre de magnésio.

A primeira convulsão aparece e é seguida por outros eventos em intervalos de dois a três minutos. O traço azul ilustra a atividade ampliada. Este painel mostra a passagem alta de dados filtrada a 250 hertz, que revela a atividade de várias unidades quando ampliada aqui está uma gravação representativa de uma convulsão de todos os eletrodos MEA sem magnésio.

Seis milimolares de potássio A LCR. Cada quadrado representa um eletrodo de matriz MEA de 12 por 12 e mostra uma 82ª janela de tempo. A linha pontilhada indica a posição da superfície cortical em relação à matriz MEA.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transportar com segurança o tecido cortical humano, preparar e armazenar a corticopsoríase viável e realizar registros MEA de atividades epilépticas espontâneas e induzidas Ao tentar este procedimento, é importante ter uma estreita colaboração entre a equipe clínica do hospital e os pesquisadores do laboratório. Nunca se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser perigoso, e a proteção deve sempre ser realizada, como o uso de luvas para evitar qualquer possível doença infecciosa após este procedimento. Outras técnicas, como imagem de fluorescência, patch lamp, gravação, classificação de pico e análise histológica, podem ser acopladas a gravações em EA para correlacionar propriedades sinápticas, dinâmica de íons de comportamento de célula única e anormalidades celulares e moleculares às atividades da população.

A realização de registros MEA de tecidos epilépticos humanos pode abrir caminho para o pesquisador explorar epilepsias lesionais, a fim de esclarecer os mecanismos subjacentes à exogênese e resistência farmacológica, bem como o papel da interação neuroglial nesse fenômeno. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.