Name: Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 14 s
Description: Aprenda a realizar gravações com matriz multieletrodos em tecido cortical humano epiléptico pós-operatório. Este método permite estudar mecanismos celulares de crises e avaliar efeitos de drogas antiepilépticas em redes neurais.

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Este trabalho foi financiado por doações de ANR (Programa Blanc Neurociências), CRF (Fédération pour la Recherche sur le Cerveau), Cidade de Paris (Emergence Programa), INSERM e La Pitié Salpêtrière Hospital (contrato de investigação translacional) para NR, a partir de Neuropôle Recherche Francilien (NERF) para ED, da Université Pierre et Marie Curie UPMC (Programa de Convergência) e do Institut du Cerveau et la e Moelle epiniere (Paris) para GH

NOTA: O protocolo aqui descrito segue as diretrizes do francês &quot;Comitê Consultivo Nacional d&#39;Ethique&quot; e é declarada como uma atividade de coleta por INSERM. 1. A ressecção de Epilepsia Human Tissue <ol><li> Pacientes <ol><li> Obter o tecido cerebral de pacientes que sofrem de epilepsia de difícil controle. Obter um consentimento informado antes da cirurgia. </li><li> Para todos operados pacientes epilépticos realizar uma extensa propedêutica pré-cirúrgica, incluindo exame neurológico, avaliação neuropsicológica, EEG de superfície, e de neuroimagem (ressonância magnética e, por vezes, 18 FDG-PET scan; Figura 1A), seguido pelo exame histológico pós-cirúrgica do tecido ressecado (Figura 1B) . NOTA: A cirurgia é indicada quando as diversas explorações localizar de forma semelhante a zona de início das crises e quando o benefício de sua remoção excede os riscos cirúrgicos. </li></ol></li><li> Cirurgia <ol><li> Maiantiepilépticos ntain pré-operatório. Realizar uma cirurgia, sob anestesia geral: a indução com sevoflurano inalado (taxa de 6% e 100% entregues inalado fracção de O 2), sufentanil intravenosa (0,3 ug / kg) e antracurium (0,5 mg / kg), seguido de manutenção com sufentanil intravenosa (0,5 ug / kg / h) e sevoflurano inalado (1 MAC). </li><li> Usar um sistema de neuronavegação para permitir uma localização precisa do córtex lesionado (Figura 1C). Após a incisão da pele, realizar um furo da rebarba no osso seguido por uma craniotomia com uma broca de alta derramamento. Gentilmente elevar a retalho ósseo, e abrir a dura-máter com uma tesoura (Figura 1D). </li><li> Use ultra-som intra-operatório para facilitar a identificação do córtex anormal, e instrumentos de microcirurgia e um aspirador ultra-sons sob o microscópio de operação. </li><li> Coagular e cortar o avião pio-arachnoidal de acordo com os limites sulcamento. Use dissecção subpial para release o córtex da pia em torno da área lesionada. </li><li> Corte a massa branca sob o córtex anormal para executar uma peça &quot;em bloco&quot; ressecção, poupando o máximo possível da vasculatura. Evite manipulação traumática do córtex. </li><li> Cortar uma fatia de 1 cm de espessura para fora do tecido ressecado ao longo de uma direcção ortogonal à superfície pial, incluindo a parte inferior do sulco e no córtex de transição. </li></ol></li></ol> 2. cefalorraquidiano artificial Fluid (ACSF) para Slice Preparação, Incubação e Gravação <ol><li> ACSF para a preparação fatia <ol><li> Prepare 1 L de sacarose com base em ACSF 7,8, contendo (em mM): 250 de sacarose, 3 de KCl, 25 de NaHCO3, 10 de D-Glucose, 1 CaCl 2, MgCl 2 10; dissolver estes sais em água desionizada e oxigenar a solução com carbogénio durante pelo menos 10 min. </li><li> Coloque ~ 700 ml de sacarose ACSF a -80 ° C durante 50-60 minutos (ou -150 ° C durante 15-20 min). Manter o resto dosolução sob oxigenação no gelo. NOTA: O ACSF para a preparação fatia pode ser armazenado a 4 ° C; neste caso, adicionar CaCl2 e MgCl2 a dia da experiência, antes de se arrefecer lo. </li></ol></li><li> ACSF para incubação fatia e gravação <ol><li> Preparar pelo menos 3 L de gravação ACSF 7,8, contendo (em mM): 124 NaCl, 3 KCl, 26 de NaHCO3, 10 D-Glicose, 1,6 de CaCl2, 1,3 de MgCl2; dissolver estes sais em água desionizada e oxigenar a solução com carbogénio. Antes de adicionar MgCl2, manter algum ACSF para realizar gravações em 0 Mg 2+ ACSF. NOTA: O ACSF incubação / gravação pode ser armazenado a 4 ° C; neste caso, adicionar CaCl2 e MgCl2 no dia do experimento. </li></ol></li></ol> 3. Equipamentos para Fatia de Incubação e Gravação <ol><li> Câmara de interface para a fatia de incubação <ol><li> Use uma câmara fatia do cérebro para manter fatias ex vivo vivendo &lt;/ Em&gt; no modo de interface. NOTA: A câmara é composta por uma secção inferior, que contém o aquecimento e os elementos sensores e um borbulhador de cerâmica e é enchido com água destilada, e uma parte superior, onde as fatias descansar sobre uma folha de tecido da lente na área plana em o centro da câmara (Figura 2A - B). </li><li> Usar dois tubos de PTFE finas separadas, através do qual o ACSF realizada pré-oxigenação entra na câmara. NOTA: Os tubos em espiral na água aquecida e atingir a parte superior da câmara; então a solução sai por meio de ação capilar com lenço de papel, que transmite a solução em poços de saída. </li><li> Ligar os tubos de PTFE da câmara de interface a uma bomba peristáltica, para permitir perfusão contínua das fatias com a forma realizada pré-oxigenação. </li><li> Manter a alta tensão de oxigénio por oxigenar com carbogénio (95% O 2 e 5% CO 2) através do borbulhador de cerâmica. NOTA: Esta mistura de gás aquecido e umedecido atinge ofatias na parte de cima da câmara, através de orifícios adequados. </li><li> Manter a temperatura na parte superior da câmara, ligando a câmara a um controlador de temperatura, através de um cabo de duas extremidades especial, que tem um conector para o elemento de aquecimento da câmara e um sensor de temperatura externo numa das extremidades. Colocar o sensor perto das fatias para verificar a temperatura em toda a incubação (Figura 2C). </li></ol></li><li> Gravações de matriz multi-eletrodo <ol><li> Use planares matrizes multi-eletrodos com 120 eletrodos de nitreto de titânio (30 mm de diâmetro) isolados com nitreto de silício e eletrodo de referência interno, dispostos em uma matriz de 12 x 12 com 200 mm de espaçamento de centro a centro. NOTA: Outras configurações com diferente diâmetro do eletrodo e espaçamento são possíveis. Em particular, o chip MEA pode ser alargada de modo a provar maiores fatias de tecidos humanos. </li><li> Adquirir sinais elétricos em 10 kHz usando um sistema MEA2100-120 (pré e fiamplificador ltro com a aquisição integrada de dados e conversor analógico-digital, resolução de dados de 16 bits, escala de tensão de entrada e largura de banda ajustável via software) através de um software dedicado (MC_Rack). NOTA: O headstage MEA2100 é dotado de uma placa metálica para fixação de elemento perfusão aquecido através de suportes magnéticos, para aspergir continuamente as fatias ao longo da sessão de gravação. </li><li> Segure o tecido para baixo no MEA por uma pequena âncora platina caseiro, o que garante um bom acoplamento elétrico entre a fatia e os eletrodos. </li></ol></li></ol> 4. Preparação de interface Câmara e Ferramentas para Dissecção e Slicing <ol><li> Câmara de interface <ol><li> Encher a secção inferior da câmara de interface com água destilada. Assegure-se que o nível de água mergulha completamente o elemento de aquecimento e é 2 a 4 mm abaixo da junção entre a parte inferior e superior da câmara. Confira este nível diariamente antes de ligar o aquecimento,a fim de evitar danos do elemento de aquecimento. </li><li> Ligue a câmara a uma fonte de carbogénio, dotado com um regulador de fluxo secundário para ajustamentos finos da pressão do gás. </li><li> Corte uma folha de tecido lente, a fim de ajustar a área plana da câmara de fatia, e posicioná-lo perto de tubos de solução de entrada, para deixar qualquer fuga bolha da linha de entrada antes de chegar às fatias. </li><li> Corte dois pedaços de fio de algodão de cadeia, desde que o pedaço de tecido da lente, e posicioná-los ao longo dos principais lados da área plana da câmara. NOTA: Isso ajuda a aumentar ligeiramente o nível de solução de perfusão na câmara. </li><li> Definir a taxa de fluxo da bomba peristáltica, a 1 ml / min e activar a bomba. </li><li> Iniciar a oxigenação da água na parte inferior da câmara. </li><li> Regule a temperatura do controlador de temperatura a 37 ° C e ligá-lo. Cobrir a parte superior da câmara de interface com um pedaço de parafilm e esperar pelo menos 30 min para a temperature para aumentar e estabilizar. </li></ol></li><li> Ferramentas para dissecção e corte <ol><li> Preparar um kit de dissecção consistindo de duas pinças de finos, uma espátula, uma pequena colher e uma lâmina; duas placas de petri de vidro, duas escovas, bem como cola de cianoacrilato. </li><li> Defina os parâmetros do vibratome: espessura, 400 mm; freqüência, 70-90 Hz; amplitude, 0,9-1 mm, de velocidade: 0,1 mm / seg. </li></ol></li></ol> 5. Human Cortical Slice Preparação <ol><li> Remover o ACSF à base de sacarose a partir de -80 ° C congelador e misturá-lo, a fim de se obter uma espécie de lama. Oxigenar com carbogen, colocar ~ 250 ml em um frasco de vidro e guarde-o num frasco de Dewar cheio de gelo, ao ir para a sala de cirurgia do hospital para obter o tecido. Nesse meio tempo, manter o resto a -20 ° C. NOTA: Durante a cirurgia, o neurocirurgião disseca um pequeno bloco de tecido cortical. Coloque imediatamente a amostra em gelada sacarose ACSF para transferência para o laboratório. </li><li> Manter o tempo necessário para a transferência do hospital ao laboratório a um máximo de 30 min. No laboratório, pegue a ACSF oxigenado à base de sacarose fora do freezer -20 ° C, misturá-lo a ter uma lama, encher uma placa de Petri e bandeja de tampão do vibratome e começar a oxigenar tanto com carbogen. Retire cuidadosamente o pedaço de tecido humano a partir da garrafa com uma colher e colocá-lo na placa de Petri (Figura 2D). </li><li> Usando a pinça, retire cuidadosamente a formação de coágulos sanguíneos, vasos e meninges para evitar a resistência durante o corte. Retirar as meninges, que consiste na matéria-pia, a partir dos lados do bloco de tecido, tendo cuidado para não danificar a superfície cortical. Com uma lâmina, cortar um lado do tecido para obter uma superfície plana, que vai ser colado na placa de amostras vibratome. NOTA: As meninges, que consistem em matéria-pia, são removidos a partir dos lados do bloco de tecido, tendo cuidado para não danificar a superfície cortical. </li><li> Se o bloco de tissue é maior do que a câmara de MEA, corte um pedaço de dimensões apropriadas antes de colá-lo na placa de amostras (Figura 2E). </li><li> Cole o tecido, a fim de obter fatias corticais transversais, colocá-lo na bandeja de tampão e cortar 400 mm de espessura em velocidade baixa (0,1 mm / seg) (Figura 2F). </li><li> Corte pedaços de tecido lente com dimensões fatia; com uma espátula e uma escova, transferir as fatias nesses tecidos de lente e incubar-los na câmara de interface a 37 ° C durante pelo menos 1 hr antes de iniciar gravações (Figura 2G - I). Continuamente armazenar as fatias nas mesmas condições até à sua utilização. NOTA: Colocar as fatias em papel lente é um passo importante para facilitar tanto a perfusão da parte inferior de fatias ea remoção de fatias da câmara de interface antes de gravar. <ol><li> Ao transferir as fatias sobre o tecido lente, gerenciá-los com muito cuidado, evitando tocar a área da camada cortical coma escova. </li><li> Preparar as fatias de um de cada vez e transferir imediatamente a cada um deles para a câmara de interface, a fim de garantir o fornecimento adequado de oxigénio e temperatura; cortar o bloco de tecido ressecado tão rapidamente quanto possível. </li></ol></li></ol> 6. Preparação da instalação MEA para Gravações <ol><li> Ligue o sistema de perfusão a uma bomba peristáltica e o sistema de MEA a um computador. Oxigenar o ACSF gravação. Coloque um chip MEA vazio dentro do amplificador. </li><li> Definir o controlador de temperatura para o aquecimento elemento de uma cânula para chegar a 37 ° C na câmara de MEA e começar a perfusão em 5-6 ml / min. NOTA: É geralmente necessário ajustar a temperatura de 3-4 ° C mais elevada do que o desejado, dependendo da temperatura ambiente e a taxa de fluxo. <ol><li> Verifique a temperatura na câmara de MEA com uma multa termômetro, colocando-o mais próximo possível do centro, sem tocar na área do eletrodo. </li></ol></li><li> Iniciar a gravação software e verifique se todos os eletrodos MEA estão bem conectados e que não há nenhum ruído devido à perfusão. </li><li> Comece MEA_Monitor para verificar o funcionamento da mesa da câmara. </li></ol> 7. Transferência de uma fatia de interface Câmara de MEA Chip para Gravação <ol><li> Despeje um pouco aquecido gravação ACSF em uma placa de Petri de vidro; com uma pinça, pegue um pedaço de câmara de interface, agarrando-o através do tecido da lente, e colocá-lo na placa de Petri. Retirar cuidadosamente a fatia a partir do tecido. Se o nível da solução na câmara de interface é cuidadosamente ajustado durante o tempo de incubação, a fatia irá separar-se a partir do tecido da lente única, submergindo-a em solução; caso contrário, use um pincel pequeno para facilitar o desprendimento. </li><li> Encher um chip de MEA com alguns ACSF e com uma espátula, a fatia transferir para ele. Com uma pipeta Pasteur de plástico, retire suavemente a solução para tornar a fatia aderir sobre a área do eletrodo e mantê-lo no lugar com um anch platinaou. Adicionar 1 ml de gravação ACSF, colocar o chip MEA no amplificador e começar a perfusão em 5-6 ml / min (Figura 2J - L). </li><li> Verifique a posição da fatia na área de gravação do MEA usando MEA_Monitor, ajuste-a, se necessário, a fim de gravar a partir de camadas corticais e tirar uma foto. Iniciar a gravação. </li></ol>

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</ol>

Patrocínio por sistemas multicanal foi fornecido para a produção da publicação de vídeo e acesso aberto.

Epilepsia fármaco é uma condição rara, que pode ser explorada no tecido humano in vitro. Isto permite estudar córtex humano epiléptico, que exibe defeitos específicos que são apenas parcialmente reproduzidas em modelos animais. O método aqui descrito permite a preparação e gravação de tecidos humanos no pós-operatório ex vivo com viabilidade e redes para que eles produzem espontaneamente atividades epilépticas celular preservada. Retenção de atividades semelhantes do que os registrados em vivo é crucial para estudar mecanismos de gênese das atividades patológicas. Além disso, tais métodos permitem explorar tecidos humanos e modelos animais para não evitar perfeitos da doença. No entanto, estudo de tecidos humanos requer sincronização entre neurocirurgiões e laboratório experimental. Transporte de tecidos requer cuidados específicos para não ser traumático. Além disso, tanto a quantidade da amostra de tecido e é limitada. Finalmente, o acesso aos tecidos de controlo adequadas é o main preocupação. Com esta preparação, os tecidos pós-operatórias produzir espontaneamente descargas interictais-like em ACSF normal de 7,8. -Ictais eventos como também pode ser atingida em modificado, ACSF proconvulsivantes de modo que os mecanismos de iniciação e apreensão de transição para o estado interictal convulsões podem ser investigadas. Tecido humano pode ser mantido viável por até 10 horas em condições de interface. As fatias foram considerados viáveis ​​quando atividade ou campo de potencialidades multi-unidades foram observados de forma espontânea e quando essas atividades foram evocados pelo aumento da excitabilidade através de aumentos de potássio extracelular e / ou diminuição de magnésio. Embora a variabilidade da atividade ocorre, provavelmente refletindo diferenças em patologias e áreas corticais, exploramos as características epileptogênicas de um tecido só em fatias saudáveis ​​mostrando interictal espontânea e evocada descargas ictais. A fim de preservar a vitalidade e a actividade do tecido, numa câmara de interface é utilizada para armazenar tele corta a 36-37 ° C para a recuperação antes de gravar com o sistema MEA. De facto, vários grupos demonstraram claramente as vantagens do sistema de armazenamento com base em comparação com interface de armazenamento copo padrão e a importância da temperatura para a preservação da actividade da rede, tais como espontâneos de onda ondulações acentuadas ou oscilações induzidas por colinérgicos 9,10. Armazenamento de interface de fatias foi previamente usada para gravar a atividade epiléptica do hipocampo humano e fatias subicular 1,11. Com a técnica actual MEA, após o período de recuperação de cortar em condições de interface, a actividade de rede é registrado em condições submersas, na presença de uma elevada velocidade de fluxo (5-6 ml / min) a 37 ° C, com o sistema de MEA. O diâmetro reduzido (1,8 cm) de chip de MEA, que delimita uma câmara de volume pequeno (&lt;1,5 ml), juntamente com o aumento da taxa de fluxo, aumenta o fornecimento de oxigénio da fatia, que foi demonstrada ser um factor crítico para a espontânea e pharmacologically induzida por atividades de rede 9,10. Além disso, a quantidade reduzida de ACSF circulante facilita os testes farmacológicos. O processo de corte é no entanto um traumatismo nos tecidos 12. Ambos arquitectura neuronal e homeostase cloreto parecem ser perturbados na superfície do tecido (50 um). A origem das atividades gravadas por chips de MEA, que amostra do tecido principalmente superficialmente sem penetração profunda, podem surgir a partir de áreas traumatizadas. No entanto, nossos dados mostram que os potenciais de campo extracelulares detectadas localmente são registrados na maioria dos eletrodos MEA e anterior trabalho mostram que eles estão integrados a uma distância do local de gravação de 13 100 a 200 mm, o que sugere que as apreensões registradas em nossa preparação não são susceptíveis de ser produzida por áreas traumatizadas. Além disso, em estudos realizados com eléctrodos de tungsténio que permitam a penetração profunda, as actividades epilépticos gravadas em tecidos humanos são semelhanteaos observados em doentes epilépticos 1,7,8. Outro limite da ex vivo a gravação do tecido é o rompimento das ligações entre as diferentes áreas do cérebro, restringindo assim neuromodulações dinâmicas. Isto pode explicar porque em tal tecido nenhum evento ictal semelhante é registrado de forma espontânea, mas precisa ser desencadeada por manipulação iônica ou estimulação reforço farmacológico excitabilidade. Por conseguinte, neste protocolo, eventos convulsivos semelhante são induzidos através da combinação de uma mudança de K + extracelular de 3 a 6 mM e uma redução de Mg 2+ externo de 1,3 mM de Mg 2 + livre ACSF, a fim de aumentar a excitabilidade dos tecidos e remover Mg bloco receptor NMDA dependente 2+. Na verdade, ele já havia sido demonstrado que a atividade epiléptica induzida em fatias neocortical e do hipocampo humanos utilizando Mg 2 + livre ACSF lembra as convulsões eletrográficas gravadas in vivo 14. Além disso,demonstrou-se que as descargas epilépticas obtidos em fatias do lobo temporal tornar-se resistentes aos anticonvulsivos utilizados clinicamente após exposição prolongada ao Mg 2 + livre ACSF 15,16, proporcionando assim um modelo para investigar acontecimentos como fármaco-convulsivos-in vitro. AAM permitir a gravação de ambos, potenciais de campo e atividades multi-unidade constituída em potenciais de ação de neurônios ex vivo. Assim, os AAM são uma poderosa ferramenta de eletrofisiológico em comparação com eletroencefalogramas, que explorar potenciais de campo gerados pelas atividades síncronas de conjuntos neuronais in vivo, mas não dão acesso ao único neurônio comportamentos 17. Apesar de microeletrodos mais recentes pode gravar em vivo actividades multi-unidade constituída em potenciais de ação de neurônios, eles são invasivos, assim que seu uso é mais restrito para fins de pesquisa durante as gravações intracranianos. Em particular, as gravações AMA representam uma técnica de escolhaestudar os padrões espaço-temporais de eventos epilépticos, os mecanismos que controlam o início e propagação das crises e da ação de fármacos antiepilépticos clássicos e novos. Notavelmente, a desvendar os tipos de células e base de sinalização de descargas epilépticas, spike técnicas de triagem e testes farmacológicos deve ser combinada com técnicas de MEA. Embora AAM pode dar acesso aos picos individuais, eles não fornecem informações sobre as propriedades sinápticas e biofísicos. No futuro, a outras técnicas deve ser acoplado a gravações da MEA, a fim de melhor comportamento celular exemplo, atividades de rede e sinalização sináptica. Por exemplo, imagens de fluorescência para desvendar neurônios ou células gliais comportamento, bem como a dinâmica de íons, pode ser combinada com AAM gravações. Além disso análise histológica post hoc pode também revelou alterações específicas de tipos de células, proteínas ou receptores, de modo que a localização das actividades epilépticos podem ser correlacionados com rearranjos específicos doestrutura nervosa. O sistema AAM também pode ser incorporado em um patch-clamp set-up para correlacionar as células individuais ou condutâncias com atividades de população. No futuro, as ferramentas Optogenetic também poderia ser utilizado, desde que as fatias humanos podem ser cultivadas a longo prazo, tal como realizada para fatias organotípicas, de modo que a transfecção ou infecção de tipos específicos de células pode ser realizada.

A epilepsia é uma doença crônica em que as crises epilépticas, que são descargas estampados intermitentes que duram vários segundos para dezenas de segundos em (EEG) registros eletroencefalográficos associados com manifestações clínicas, interromper um estado interictal, caracterizada pela presença de descargas neuronais síncronas dezenas de milissegundos duradouras e chamou os eventos interictais um. Ele afecta aproximadamente 1% da população do mundo e, embora as convulsões são controlados em que a maioria dos pacientes, cerca de um terço das pessoas com epilepsia não mostram uma resposta adequada às drogas antiepilépticas 2. Nesta condição, chamada epilepsia fármaco e cujos mecanismos ainda precisam ser claramente identificados, a ressecção cirúrgica da parte específica do cérebro identificado como zona apreensão de início continua sendo a única alternativa de tratamento que dá um resultado positivo para os pacientes. Assim, os espécimes ressecados de cirurgia deu a oportuniopor- para estudar os mecanismos de descargas intercríticas e geração e propagação das crises, bem como pharmacoresistance sobre o tecido nervoso central humano viável ex vivo. Multi-eléctrodo matrizes (AAM), que consiste de um arranjo de microeléctrodos distribuídos espacialmente, permitir que a estimulação simultânea e gravação de actividade electrofisiológica de vários locais do tecido, proporcionando assim uma abordagem excelente para estudar os padrões espaço-temporais da actividade espontânea e evocada . Esta técnica, aplicada pela primeira vez para acompanhar as mudanças no desenvolvimento de atividades de cultura de células neuronais 3 e depois adaptado para cerebral aguda e organotípico e fatias de medula espinhal 4-6, é actualmente considerada uma ferramenta valiosa eletrofisiológico. O protocolo atual descreve como preparar fatias corticais humanos a partir de tecido ressecado cirurgicamente e gravar com AAM confiável ex vivo interictal e eventos apreensão semelhante destas fatias. Esta técnica proporciona, assim, uma forma de abordar os mecanismos básicos subjacentes atividades epilépticas iniciação, propagação e efeitos das drogas antiepilépticas, tanto em nível celular e de rede. Todos os procedimentos utilizados para obter, preparar, manter e gravar fatias humanos são aqui descritos em pormenor.

<table><tbody><tr><td>Câmara de fatia de cérebro-2: Interface</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td>S-BSC2</td><td>Requer controlador de temperatura separado</td></tr><tr>Sistemas Multicanal<td>de Controlador de Temperatura de 2 canais</td><td>, Alemanha</td><td>TC02</td><td>Permite conectar e usar 2 câmaras de interface.&nbsp;</td></tr><tr><td>Cabo especial para conexão do TC01 ao S-BSC2 com referência externa PT100</td><td>Sistemas Multicanal, Alemanha</td><td>CA3</td><td>A referência PT100 é colocada perto das fatias&nbsp;</td></tr><tr><td>Conector de 6 pinos com sistemas multicanal PT100</td><td>, Alemanha</td><td>TS-PT100</td> Referência externa para estação de trabalho MEA <td>de cabo CA3</td></tr><tr><td>para gravação de dados de sistemas multicanais MEAs de 120 eletrodos</td><td>, Alemanha</td><td>MEA2100-120</td><td>Inclui headstage MEA2100-120 e placa de interface MEA2100. www.multichannelsystems.com</td></tr><tr><td>Matriz de microeletrodos para sistemas multicanais MEA2100-120</td><td>, Alemanha</td><td>120MEA200/30</td><td>Espaçamento entre eletrodos: 200 &micro; m; diâmetro do eletrodo: 30 &micro; m; anel de vidro: 6 mm de altura. Diferentes configurações (espaçamento, diâmetro, anel) possíveis.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mesa de Microscópio de Vídeo</td><td>Sistemas Multicanal, Alemanha</td><td>MEA-VMT-1</td><td>Mesa com um microscópio de vídeo embaixo para obter imagens do campo de eletrodos dos MEAs em um amplificador colocado em cima da mesa e transferir a imagem para um computador.</td></tr><tr><td>Cânula de perfusão</td><td>Sistemas multicanais, Alemanha</td><td>PH01</td><td>Cânula de perfusão aquecível com sensor de temperatura; a temperatura pode ser programada com o controlador TC02</td></tr><tr><td>MC_Rack</td><td>Sistemas multicanais, Alemanha</td><td></td><td>Software para aquisição e gravação de dados</td></tr><tr>Sistemas multicanais<td>de suporte de perfusão magnética</td><td>, Alemanha</td><td>MPH</td><td>Suporte de perfusão magnética para elemento PH01 para fixar a cânula de perfusão e conectar o sistema de perfusão ao aterramento do amplificador</td></tr><tr><td>Neuroexplorer</td><td>Nex Technologies</td><td></td><td>Software para análise de dados; info@neuroexplorer.com</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (unidade de acionamento)</td><td>Gilson</td><td>F155001</td><td>0,01 a 48 rp</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica (cabeça da bomba)</td><td>Gilson</td><td>F117800</td><td>R2 dois canais</td></tr><tr><td>Aspirador ultrassônico</td><td>Integra Life sciences, EUA</td><td>Cusa Excel +</td><td>Permite a dissecção subpial romba do córtex</td></tr><tr><td>Neuronavegação</td><td>Isis Solutions, França</td><td>Surgiscope</td><td>Permite a identificação em tempo real da estrutura cerebral na ressonância magnética pré-operatória</td></tr><tr><td>Vibratome HM 650 V</td><td>Microm</td><td></td><td>Block cortando em 400 &mu; m fatias grossas</td></tr></tbody></table>

multieletrodos recordings matriz de human epiléptica pós-operatória cortical tissue

Multi-electrode Array Recordings of Human Epileptic Postoperative Cortical Tissue

Epilepsia, que afecta cerca de 1% da população, compreende um grupo de distúrbios neurológicos caracterizados pela ocorrência periódica de convulsões, que interrompem a função cerebral normal. Apesar do tratamento com fármacos antiepilépticos disponíveis atualmente visam as funções neuronais, um terço dos pacientes com epilepsia fármaco-são. Nesta condição, a ressecção cirúrgica da área do cérebro gerando convulsões continua a ser o único tratamento alternativo. Estudar tecidos epilépticos humanos tem contribuído para entender novos mecanismos epileptogênicas durante os últimos 10 anos. Na verdade, estes tecidos gerar descargas epilépticas interictais espontâneas, bem como eventos ictais induzida por farmacologicamente que podem ser gravados com técnicas de eletrofisiologia clássicos. Notavelmente, as matrizes multi-eletrodo (AMA), que são dispositivos microfabricados incorporação de um conjunto de microeletrodos espacialmente arranjados, oferecem a oportunidade única para estimular simultaneamente e registro pote campontials, bem como potenciais de múltiplos neurônios de diferentes áreas do tecido de ação. Assim AMA gravações oferecem uma excelente abordagem para estudar os padrões espaço-temporais de interictal espontânea e eventos do tipo convulsivas evocadas e os mecanismos subjacentes início e propagação das crises. Aqui nós descrevemos como preparar fatias corticais humanos a partir de tecido ressecado cirurgicamente e gravar com AAM interictais e ictais-like eventos ex vivo.

O registro da atividade cortical fatia humano começa enquanto irrigando o tecido com ACSF gravação normal (como descrito anteriormente) 7,8. Nesta condição, quando o tecido é bem preservada durante a cirurgia e mais tarde, durante a transferência de tecido a partir da preparação do hospital e fatia, pode-se observar a actividade espontânea, sob a forma de eventos semelhantes a pequenas intercríticas, detectados a partir de pequenos aglomerados de eléctrodos de MEA. Descargas intercríticas-like consistiu em um potencial de campo, geralmente bifásica, que compreende uma deflexão negativa afiado inicial, atingindo dezenas de microvolts, seguido por uma onda mais longo oposto durando várias dezenas de milissegundos. Actividades multi-unidade rápidas são geralmente incorporado no potencial de campo, principalmente na parte inicial. Um exemplo representativo de actividade interictal-como é ilustrado na Figura 3Aii, onde o traço registado por um eléctrodo MEA é mostrado. Para gravar as crises epilépticas de emvitro fatias corticais humanos, é necessária para perfundir-los com um ACSF "epileptogénica", em que está ausente Mg2 + e K + é aumentada para 6 mM, para aumentar a excitabilidade do tecido 1 (o aumento de K + de 3 a 6 mM por si só não é suficiente para induzir convulsões; dados não mostrados). Uma vez que a perfusão com 0 Mg 2+ 6 mM de K + ACSF foi iniciado, a actividade de fatias corticais aumenta gradualmente e a primeira convulsão aparece dentro de 15 a 20 min (15,4 ± 1,7 min, n = 10, a partir de 5 pacientes; Figura 3 Ai ). Nós evocado actividade ictal semelhante, como mostrado na Figura 3, em 75% dos pacientes testados e em 66,7% de todas as fatias gravados. Atividades epilépticas são registrados a partir de eletrodos adjacentes do chip MEA, e comparação das dinâmicas de início de campo potenciais eventos permite estudar seu local de gênese e propagação. A apreensão representante gravado a partir de uma fatia de humum córtex cerebral com o sistema de MEA é mostrado na Figura 3B (um traçado representativo de uma convulsão gravado por um único eléctrodo MEA é mostrado em maior resolução temporal na Figura 3 Aiii). Note-se que a convulsão é gravado a partir de quase todos os eléctrodos do chip de MEA, indicando, assim, que é capaz de se propagar de uma grande área cortical. Além disso, olhando para os traços individuais gravadas de cada eletrodo, é possível observar a propagação progressiva da apreensão em todo o tecido: de fato, ele começa primeiro na área cortical que cobre a metade direita do conjunto de eletrodos, e gradualmente se espalha para a área que cobre a metade esquerda (.. i e, comparar os vestígios de L6 eléctrodo e B6; Figura 3B). <img alt="A Figura 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig1highres.jpg" width="300"> Figura 1: A uma displasia cortical. d sua remoção cirúrgica do tipo A Taylor displasia cortical focal (seta branca) encaixado em um sulco lobo frontal esquerdo é visualizado no MRI pré-operatório (A), e mais tarde confirmado por exame rotulagem quinase (B) MAP histológico; barra de escala: 200 mm), mostrando uma dyslamination cortical, os neurônios anormais e uma faixa de neurônios com uma migração incompleta na substância branca inferior. Durante a cirurgia, a displasia é localizada de acordo com os dados de ressonância magnética com um sistema de neuronavegação (C). A visualização do giro contendo a displasia durante a cirurgia (D). <img alt="A Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig2highres.jpg" width="400"> Figura 2:. Equipamento e processo de preparação fatia cortical humano Uma câmara de interface é utilizada para manter fatias corticais humanos ex vivo (A); o fatias repouso sobre uma folha de tecido da lente na área plana na parte superior da câmara (B), em que um sensor de temperatura (C, esquerda), ligada a um controlador de temperatura (C, à direita, acima) por meio de um duplo cabo ended (C, direita, para baixo), é colocado para manter a temperatura de 37 ° C ao longo do tempo fatia de incubação. Uma vez obtido, colocar o bloco de tecido ressecado numa placa de petri cheia com ACSF gelado à base de sacarose (D) e remover coágulos sanguíneos, vasos e meninges, para facilitar o corte. Se o bloco de tecido é maior do que as câmaras de MEA, isolar um pedaço de dimensões apropriadas com uma lâmina (E) e colá-la na placa de amostras vibratome (F). Cortar 400 mm de espessura e com a ajuda de uma espátula (L) transferi-las em pedaços de tecido lente (H) e incubar-los na câmara de interface (I). Antes de gravar, remove o tecido do cristalino por submersão da fatia numa placa de petri cheia com ACSF e transferi-lo para um chip de MEA ACSF preenchido com uma espátula (J). Remover a solução para permitir que a fatia aderir sobre a MEA (K) e mantê-lo em posição usando uma âncora de platina. Coloque o MEA no amplificador (L), começar a perfusão e gravação. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51870/51870fig3highres.jpg" width="300"> Figura 3: MEA gravações de convulsões epilépticas em fatias corticais humanos (A) Um traço representante da atividade fatia cortical humano registado por um eléctrodo MEA é mostrada no painel i.. Na presença de ACSF normal, é possível observar a atividade interictal-like espontânea (pequeno retângulo cinza, ampliada no painel ii); em seguida, quando a perfusão com 0 Mg 2+ 6 mM de K + ACSF foi iniciado, o primeiro seizure aparece depois de um ~ 15 min de atraso e é seguido por outros eventos no intervalo de 2-3 min. Painel III mostra a apreensão no grande retângulo cinza no painel i com uma escala ampliada. O traço azul ilustra um zoom da atividade, como indicado pela linha azul-e-flecha. Painel iv) mostra os dados ilustrados no painel iii) high pass filtradas em 250 Hz, que revelam atividade-unidade de multi quando ampliada (traço azul). (B) gravação Representante de uma convulsão na presença de 0 Mg 2+ 6 mM K + ACSF de todos os pólos da MEA. Cada quadrado representa um eletrodo de 12 x 12 matriz de MEA e mostra uma janela de tempo de 80 seg; a linha pontilhada indica a posição da superfície cortical relativamente à matriz de MEA.

Nós aqui descrevem como realizar gravações de matriz multi-eletrodo de tecido cortical epiléptico humano. Ressecção do tecido epiléptico, preparação e fatia de matriz multi-eletrodo gravações de eventos interictais e ictais são demonstrados em detalhes.

Multieletrodos Recordings Matriz de Human epiléptica pós-operatória Cortical Tissue

Epilepsy, affecting about 1% of the population, comprises a group of neurological disorders characterized by the periodic occurrence of seizures, which ...

O objetivo geral deste procedimento é realizar gravações de múltiplos arranjos de eletrodos de eventos ex vivo, interictais e semelhantes a convulsões do tecido cortical epiléptico humano, fornecendo assim uma maneira de abordar os mecanismos básicos subjacentes às atividades epilépticas, iniciação, propagação e os efeitos de drogas antiepilépticas nos níveis celular e de rede. Isso é feito primeiro ressecando cuidadosamente o tecido cortical humano de pacientes com epilepsia resistente a medicamentos durante a cirurgia. O segundo passo é remover os coágulos sanguíneos, vasos e meninges e o excesso de substância branca antes de fatiar.Em seguida, corte o bloco de tecido em fatias de 400 mícrons. A etapa final é manter as fatias nas condições de interface de alta oxigenação e temperatura controlada com perfusão lenta. Em última análise, a técnica de arranjo de múltiplos eletrodos é usada para registrar atividades espontâneas semelhantes a interictais e eventos evocados semelhantes a ictais.Nosso laboratório investiga o papel das interações neurogliais na fisiopatologia cerebral para estudar como as células neurais podem gerar atividade de rede patológica em humanos. Recentemente, estabelecemos gravações de vários eletrodos de tecido cortical epiléptico humano e pós-operatório em colaboração com hospitais de cuidados com o pescoço e de Petri de colo. Hoje, Thomas Blo, neurocirurgião do Neck Care Hospital, juntamente com Feld, epileptologista e pesquisador do Lapis Hospital e Elena DOI, pós-doutorando em meu laboratório, demonstrarão como realizar e fazer bom uso de tais técnicas.Da coleta de tecido epiléptico humano às gravações MEA ex vivo, o uso de ECT de tecido cortical humano para curar pacientes epilépticos permite a exploração direta de neurônios epilépticos humanos e células gliais mantidos funcionalmente, que estão interconectados em redes específicas. Investigações in vitro, um tecido humano dá acesso a células únicas e atividades de rede, mecanismos baseados em iônicos, que não podem ser totalmente abordados in vivo. O registro MEA do tecido cortical humano pode ajudar a responder a uma questão-chave no campo da epilepsia, como os mecanismos celulares subjacentes à exogênese e à propagação das convulsões.A implicação desta técnica se estende à epilepsia lesional e sua terapia, pois permite entender os mecanismos da resistência farmacológica e o efeito da droga antiepiléptica no evento semelhante a uma convulsão registrado nas fatias corticais humanas. In vitro. A principal vantagem dos multi electro arrays sobre os métodos existentes, como e, e, g ou micro eletrodos in vivo, é que eles permitem a estimulação e o registro simultâneos e não invasivos de potenciais de campo e atividade multiunitária de vários lados do tecido.Para iniciar o procedimento, prepare a câmara de interface enchendo primeiro a seção inferior com água destilada. Em seguida, conecte a câmara a uma fonte de carbogênio. Em seguida, corte um pedaço de tecido da lente para caber na área plana da câmara de fatia.Coloque-o próximo ao tubo de entrada para permitir que as bolhas escapem da linha de entrada antes de atingir as fatias. Depois disso, corte dois pedaços de fio de algodão trançado com o mesmo comprimento do pedaço de tecido da lente. Coloque-os nas laterais da área plana da câmara, ajuste a vazão da bomba peristáltica para um mililitro por minuto.Em seguida, ligue a oxigenação da água na parte inferior da câmara. Em seguida, defina o controlador de temperatura para 37 graus Celsius. Cubra a parte superior da câmara de interface com um pedaço de paraforma e espere pelo menos 30 minutos para que a temperatura aumente e se estabilize.Agora, prepare as ferramentas de dissecação, que incluem duas pinças finas, uma espátula, uma colher pequena e uma lâmina, duas placas de Petri de vidro, dois pincéis e a cola de cianoacrilato. Em seguida, prepare o vibrato definindo os parâmetros para fatiar. Neste procedimento, remova o A CSF preparado à base de sacarose do freezer de 80 graus Celsius negativos e esmague-o até virar lama.Oxigene-o com carbogênio. Em seguida, transfira 250 mililitros da lama de A CSF para uma garrafa de vidro e mantenha-a em uma garrafa cheia de gelo para coleta de tecido na sala de cirurgia. Sob anestesia geral padrão, use um sistema de neuronavegação para permitir uma localização precisa do córtex.Depois, faça uma incisão na pele e, em seguida, crie um orifício no osso, seguido de uma craniotomia. Em seguida, eleve suavemente a aba óssea e abra a dura-máter com uma tesoura. Posteriormente, realize a ressecção em bloco do córtex epiléptico e evite coagulação extensa.Corte um bloco cortical de um centímetro de espessura e coloque-o no LCR A à base de sacarose oxigenada congelada. Depois, transfira o tecido em A CSF congelado à base de sacarose para o laboratório o mais rápido possível, mas evitando choques mecânicos. Agora, encha uma placa de Petri e a bandeja tampão de vibrato com a lama oxigenada A CSF à base de sacarose e continue a oxigenar a lama A CSF com carbogênio.Em seguida, retire cuidadosamente o lenço da garrafa com uma colher e coloque-o na placa de Petri. Usando a pinça, remova cuidadosamente os coágulos sanguíneos, vasos e meninges para evitar resistência durante o corte. Corte o lado do tecido com uma lâmina para obter uma superfície plana o mais paralela possível ao lado oposto do tecido.Em seguida, cole o tecido na placa de amostra de vibrato para preparar fatias corticais transversais. Em seguida, coloque-o na bandeja tampão e corte fatias de 400 mícrons de espessura em baixa velocidade. Em seguida, corte alguns pedaços de tecido da lente com uma espátula e um pincel.Transfira essas fatias de tecido do cristalino para a câmara de interface. Incube-os a 37 graus Celsius por pelo menos uma hora antes de gravar. Neste procedimento, conecte o sistema de perfusão a uma bomba peristáltica e o sistema MEA a um computador.Em seguida, coloque um chip MEA vazio dentro do amplificador. Em seguida, ajuste o controlador de temperatura para aquecer o elemento da cânula na câmara MEA para 37 graus Celsius. Inicie a perfusão do LCR A oxigenado em cinco a seis mililitros por minuto.Depois disso, abra o software de gravação. Certifique-se de que todos os eletrodos MEA estejam bem conectados e que não haja ruído devido à perfusão. Agora despeje um pouco de registro aquecido A CSF em uma placa de Petri de vidro.Transfira uma fatia da câmara de interface para a placa de Petri agarrando o tecido da lente. Em seguida, retire cuidadosamente a fatia do tecido submergindo-a na solução ou use uma escova pequena para facilitar o descolamento. Em seguida, preencha o chip MEA com um pouco de A CSF.Transfira a fatia para o chip MEA com uma espátula com uma pipeta de plástico. Remova suavemente a solução para fazer a fatia aderir à área do eletrodo e mantenha-a no lugar com uma âncora de platina. Depois disso, adicione um mililitro de gravação de um CSF ao chip MEA e coloque-o no amplificador.Em seguida, inicie a perfusão em cinco a seis mililitros por minuto. Em seguida, verifique a posição da fatia na área de gravação MEA. Usando o software do monitor MEA, ajuste-o se necessário.Para gravar a partir das camadas corticais e tirar uma foto, inicie a gravação. Este é um traço representativo da atividade de corte cortical humano registrada por um eletrodo MEA. No LCR A normal, é possível observar atividade espontânea semelhante à interictal 15 minutos após a perfusão com LCR A de potássio A de seis milimolares livre de magnésio.A primeira convulsão aparece e é seguida por outros eventos em intervalos de dois a três minutos. O traço azul ilustra a atividade ampliada. Este painel mostra a passagem alta de dados filtrada a 250 hertz, que revela a atividade de várias unidades quando ampliada aqui está uma gravação representativa de uma convulsão de todos os eletrodos MEA sem magnésio.Seis milimolares de potássio A LCR. Cada quadrado representa um eletrodo de matriz MEA de 12 por 12 e mostra uma 82ª janela de tempo. A linha pontilhada indica a posição da superfície cortical em relação à matriz MEA.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como transportar com segurança o tecido cortical humano, preparar e armazenar a corticopsoríase viável e realizar registros MEA de atividades epilépticas espontâneas e induzidas Ao tentar este procedimento, é importante ter uma estreita colaboração entre a equipe clínica do hospital e os pesquisadores do laboratório. Nunca se esqueça de que trabalhar com tecido humano pode ser perigoso, e a proteção deve sempre ser realizada, como o uso de luvas para evitar qualquer possível doença infecciosa após este procedimento. Outras técnicas, como imagem de fluorescência, patch lamp, gravação, classificação de pico e análise histológica, podem ser acopladas a gravações em EA para correlacionar propriedades sinápticas, dinâmica de íons de comportamento de célula única e anormalidades celulares e moleculares às atividades da população.A realização de registros MEA de tecidos epilépticos humanos pode abrir caminho para o pesquisador explorar epilepsias lesionais, a fim de esclarecer os mecanismos subjacentes à exogênese e resistência farmacológica, bem como o papel da interação neuroglial nesse fenômeno. Obrigado por assistir e boa sorte com seu experimento.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

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