Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

O objetivo geral do seguinte experimento é realizar o clamp dinâmico in vitro em neurônios corticais utilizando a caixa de ferramentas de software gratuitamente disponível, LCG. Isso é alcançado preparando fatias do córtex somatossensorial de rato para gravações de patch clamp a partir das células parametais. Como segundo passo, uma série de protocolos eletrofisiológicos automatizados é aplicada à célula gravada, o que fornece uma caracterização padrão da célula que será útil para análises subsequentes e comparações entre tipos celulares.

Em seguida, simula-se a injeção de eventos sinápticos excitatórios e inibitórios. Para recriar o estado de alta condutância vivenciado pelos neurônios neocorticais in vivo, os resultados demonstram como a injeção sináptica de fundo modula o ganho das células corticais. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é a possibilidade de incorporar gravações experimentais em fluxos de trabalho mais complexos, utilizando, por exemplo, o resultado de um protocolo experimental como entrada para outro protocolo.

Este método pode ajudar a padronizar protocolos eletrofisiológicos, acelerar a análise de dados e abrir caminho para o compartilhamento de dados entre laboratórios. Embora este método tenha sido originalmente desenvolvido para gravações de patch CLA em preparações in vitro, ele também pode ser convenientemente utilizado para outras preparações experimentais e protocolos, como patch in vivo, gravações CLA ou gravações com microarranjos. Após extrair o cérebro de rato, descarte o cerebelo e separe os dois hemisférios ao longo da linha média usando um bisturi; remova o excesso de fluido de um dos hemisférios e cole-o em uma plataforma inclinada com uma gota de cola super forte.

Em seguida, adicione rapidamente algumas gotas de LCR sobre o cérebro e transfira-o para a câmara Vibram. Remova os primeiros 2,5 a três milímetros do tecido cerebral com uma lâmina. Posteriormente, ajuste a velocidade e a frequência de corte para limitar os danos à superfície do corte.

Em seguida, ajuste a espessura para 300 micrômetros e inicie o corte. Uma vez que a lâmina tenha ultrapassado o córtex, utilize uma lâmina de barbear ou uma agulha curvada para fazer um corte acima do hipocampo e nas bordas da região cortical de interesse. Depois disso, transfira as fatias para uma câmara de incubação multiplaca a 36 graus Celsius.

Neste procedimento, coloque um corte na câmara de registro com a lente de magnificação de 40 x. Procure células saudáveis na camada cinco e entre 600 a 1000 micrômetros abaixo da superfície do cérebro. Essas células geralmente têm menor contraste, aparência lisa e não estão inchadas.

Uma vez que uma célula saudável seja encontrada, carregue um terço da micropipeta com solução intracelular. Em seguida, coloque-a no estágio de cabeça no sistema operacional Linux previamente configurado. Execute um comando.

O shell adiciona seu prompt. Digite este comando para garantir que a placa de aquisição de dados não esteja acionando o amplificador. Em seguida, aplique uma pressão positiva de 30 a 50 milibares pressionando o pistão da seringa, que está conectada ao suporte de micropipeta.

Em seguida, posicione a pipeta aproximadamente a 100 micrômetros acima do corte e mova a pipeta em direção à célula-alvo utilizando o modo de aproximação do micromanipulador. Depois disso, ajuste o offset da pipeta no amplificador de eletrofisiologia e emita um pulso de teste de 10 milivolts no modo de fixação de voltagem. Utilize o comando LCG SEAL test para monitorar a resistência da pipeta, então reduza a pressão para 10 a 30 milibares retirando o êmbolo da seringa.

Aproxime-se suavemente da célula e verifique a formação de uma depressão observando a imagem no monitor da câmera de vídeo. Ao mesmo tempo, observe o aumento na resistência provocado pelo pulso de teste, acompanhando a forma de onda da corrente exibida no monitor. Quando houver aumento na resistência da pipeta e formação de uma depressão na célula, libere imediatamente a pressão e aplique uma pressão negativa suave à pipeta para auxiliar na formação do selo.

Enquanto isso, diminua gradualmente o potencial de retenção para menos 70 milivolts. Aplique sucção suave para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de célula inteira. Em seguida, caracterize a célula em termos de suas propriedades elétricas.

Utilizando o comando LCGE code. Aqui está o potencial de ação médio de um neurônio parametal da camada cinco com um limiar de menos 50,5 milivolts. Esta figura mostra a medição das respostas passivas a correntes hiperpolarizantes.

A identificação das propriedades ativas básicas da célula revela que a célula é um neurônio de disparo regular, e há uma adaptação mínima à injeção de potenciais excitatórios simulados pós-sinápticos. Altere para o diretório onde o próximo experimento será salvo digitando este comando no prompt de comando do shell. Em vez de atuar nos controles convencionais de hardware do amplificador, aplique o balanceamento de ponte e a compensação de capacitância para estimar o kernel do eletrodo necessário para realizar a compensação ativa do eletrodo emitindo este comando.

O kernel completo é a soma de dois componentes: um kernel de eletrodo rápido e um kernel de membrana mais lento, que dá origem à cauda exponencial observada no kernel completo. O primeiro constitui um modelo não paramétrico da pipeta. Após a injeção de corrente para separar os kernels de membrana e de eletrodo, o comando kernel LCG solicitará ao usuário o número de pontos que compõem o kernel de eletrodo rápido. Em seguida, selecione um número de modo que o kernel de eletrodo cubra o final da cauda de decaimento exponencial.

Em seguida, realize o experimento de clamp dinâmico utilizando este comando. Por fim, visualize os resultados. A seguir, tem-se a recreação de atividade semelhante à in vivo utilizando o clamp dinâmico.

Os traços vermelhos e azuis representam a simulação de sinapses excitadoras e inibidoras, respectivamente. E aqui estão os traços de tensão registrados de um neurônio parametal L5, que foi submetido a um bombardeio de correntes pós-sinápticas excitadoras ou inibidoras. As correntes injetadas correspondentes, excitadora, inibidora e total, na célula são mostradas no gráfico.

O gráfico raster dos potenciais de ação gerados ao longo de 20 ensaios mostra que o neurônio pode ser extremamente confiável e preciso em resposta ao mesmo estímulo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de estímulo dinâmico utilizando a caixa de ferramentas de software gratuitamente disponível LCG. Este procedimento pode ser estendido a outros protocolos de malha fechada para investigar uma ampla variedade de temas, que vão desde a excitabilidade neural até interações complexas em redes.