Name: Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Aprenda a realizar dynamic clamp em neurônios corticais usando o software LCG. Este método automatiza protocolos eletrofisiológicos para caracterizar células e simular eventos sinápticos in vitro.

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Apoio financeiro da Fundação de Investigação da Flandres FWO (contrato n. 12C9112N a DL), do 7.º Programa-Quadro da Comissão Europeia (Rede Marie Curie "C7", contrato n.º 238214; O projeto "ENLIGHTENMENT" de Tecnologia Emergente do Futuro das TIC, contrato n. 306502), o Programa de Pólos de Atração Interuniversitários iniciado pelo Escritório de Política Científica da Bélgica (contrato n. IUAP-VII/20) e a Universidade de Antuérpia são gentilmente reconhecidos.

O protocolo aqui descrito está em conformidade com as recomendações e orientações do Comitê do Departamento de Ciências Biomédicas da Universidade de Antuérpia Ética. Este protocolo requer a preparação de um material não-sensível a partir do cérebro de ratos Wistar explantado juvenis, obtido por técnicas de eutanásia humanas aprovados. 1. Equipamentos Preparação <ol><li> Instalar e configurar a aquisição de dados e sistema de estimulação. <ol><li> Usar um computador pessoal (PC) equipado com uma placa de aquisição de dados (DAQ) suportado por Comedi para gravar sinais e enviar voltagens analógicas de controlo para o amplificador electrofisiológico. NOTA: Comedi é um módulo de Linux e biblioteca que suporta uma grande variedade de cartões de aquisição de dados dos fabricantes mais comuns: visitar http://www.comedi.org para mais informações. </li><li> No caso de um amplificador de patch clamp controlado por computador está em uso, empregar um segundo PC além do uma dedicada ao amplificadorao controle. NOTA: Enquanto o último pode executar um sistema operativo convencional, o PC extra será operar em tempo real por meio de um sistema especial de funcionamento. Nestas condições, é conveniente usar um único monitor, mouse e teclado conectado ao PC extra, durante a conexão por um aplicativo de desktop remoto para o PC dedicado. </li><li> Baixe a imagem ISO do Live CD que contém um sistema operacional em tempo real com Linux pré-instalado da LCG http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso e queimá-lo em um CD ou USB vara em branco &quot; . </li><li> Basta inserir o CD no drive do PC que contém o cartão DAQ e iniciá-lo. Como alternativa, instale LCG do seu repositório fonte on-line em um PC rodando o sistema operacional Linux (por exemplo, Debian ou Ubuntu). Consulte o manual online para obter detalhes sobre o procedimento de instalação. O manual está disponível online em http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf. </li><li> Arrancar a partir do CD ao vivo: this carregará automaticamente um sistema totalmente configurado. Para fazer isso, coloque o Live CD do LCG no computador unidade de CD-ROM e inicialize o computador a partir do CD; selecionar o kernel de tempo real (opção padrão), logo que o menu de inicialização aparecer e aguarde o sistema para inicializar. </li><li> Calibrar o cartão DAQ, digitando no prompt de comando: sudo comedi_calibrate ou sudo comedi_soft_calibrate dependendo se a placa de aquisição de dados suporta calibração de hardware ou software, respectivamente (use o comando sudo comedi_board_info para obter informações sobre a bordo). </li><li> Defina o conversor analógico-digital adequada e de digital para analógico factores de conversão: este exige ter acesso ao manual do amplificador eletrofisiológico celular e, particularmente, com as respectivas especificações nos seus factores de conversão. </li><li> Use um editor de texto para especificar os valores numéricos apropriados no /home/user/.lcg-env arquivo, para as variáveis ​​de ambiente AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. NOTA: Estes representam a entrada (AI) e de saída (AO) ganhos para alicate de corrente (CC) ea braçadeira de tensão (VC) modos, e os fatores de conversão entre os comandos de tensão fornecidas pelo computador e que o actual ou tensões geradas pelo amplificador , respectivamente. </li><li> Como alternativa, use o script LCG fornecida (LCG-achado-conversão-factores), para encontrar os fatores de conversão de seu sistema. NOTA: Os valores calculados pela LCG-encontrar-conversão-fatores são suposições, que em alguns casos são necessários para ser numericamente truncado ou arredondados para refletir os valores exatos dos factores de conversão. </li><li> Para usar lcg encontrar-conversão-fatores, comece conectando a &quot;célula modelo&quot;, que muitas vezes é comprado com o amplificador para o headstage correspondente. Em seguida, abra um terminal na máquina Linux onde você está executando o Live CD e digite o seguinte comando no prompt shell: lcg-encontrar-conversão-fatores -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env NOTA: Em ambos os casos (ou seja, modificação manual de /home/user/.lcg-env ou uso de LCG-achado-conversão-factores), fechar e abrir o terminal para que as alterações tenham efeito. </li><li> Se forem usadas várias headstages, defina os fatores de conversão para os mesmos valores em todos os canais; se isso não for possível, consulte o manual online LCG para entender como usar vários factores de conversão em LCG-estímulo ou como produzir arquivos de configuração que melhor se adequam às necessidades do usuário. </li></ol></li></ol> 2. Preparação de fatias do cérebro do aguda do córtex somatossensorial <ol><li> Preparação de soluções para eletrofisiologia. <ol><li> Preparar fluido cerebrospinal artificial (ACSF) através da mistura de (em mM) 125 de NaCl, 2,5 de KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO3, 25 de glucose, 2 CaCl2, 1 MgCl2 e. Prepare 10x soluções estoque para reduzir oo tempo de preparação, no dia da experiência. Preparar 2 L, dos quais um será usado para a preparação das fatias e a outra para a gravação. </li><li> Saturar o ACSF com 95% de O2 e 5% de CO 2 durante pelo menos 30 minutos antes do início do procedimento. </li><li> Para gravações de controle de corrente, usar uma solução intracelular (ICS) contendo (em mM) 115 de K-gluconato, KCl 20, 10 de HEPES, 4 de ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparar a solução em gelo e filtrá-la antes do início das gravações para eliminar o risco de entupimento da pipeta. </li></ol></li><li> Extracção do cérebro. <ol><li> Anestesiar o animal colocando o animal em uma câmara de indução com 4% de isoflurano e rapidamente decapitar-lo usando uma guilhotina ou tesouras grandes. </li><li> Corte a pele ao longo da linha média e deslize-o para os ouvidos. </li><li> Usando um belo par de tesouras cortou o crânio ao longo da linha média. Mantenha a lâmina mais perto possível para poe a superfície de modo a minimizar os danos no cérebro subjacente. Abra o crânio com um par de pinças, utilizar uma espátula para separar o nervo óptico e do tronco cerebral e do cérebro cair suavemente em ACSF gelado. </li><li> Separa-se o cerebelo e os dois hemisférios com um bisturi (lâmina 24). </li><li> Remover o excesso de água a partir de um dos dois hemisférios e colá-la sobre uma plataforma inclinada utilizando uma gota de supercola. Rapidamente adicionar algumas gotas de ACSF sobre o cérebro e transferi-lo para a câmara de vibratome. NOTA: Ao preparar fatias sagital, o ângulo da plataforma é importante para evitar danificar os dendritos das células piramidais durante o procedimento de corte. </li></ol></li><li> Preparação das fatias. <ol><li> Posicione a lâmina sobre o cérebro e descartar o primeiro 2,5-3 mm. Ajustar a velocidade e frequência para limitar os danos à superfície da fatia e, ao mesmo tempo, minimizando o tempo necessário para o procedimento de corte. </li><li> Defina a espessura de 300 μm e começar a cortar. Uma vez que a lâmina foi passado o córtex, utilizar uma lâmina de barbear ou de uma agulha dobrada para cortar acima do hipocampo e nas bordas da área cortical de interesse. </li><li> Coloque as fatias numa câmara de incubação de poços múltiplos mantida a 32-34 ° C. </li><li> Retrair a lâmina e repita pontos 2.3.2 e 2.3.3 até 5-8 fatias são cortadas. Os melhores fatias são normalmente aqueles em que os vasos sanguíneos são paralelas à superfície. </li><li> Incubam-se as fatias durante 30 min após a última fatia é colocado na câmara. </li></ol></li></ol> 3. Gravações patch-clamp de Camada 5 piramidais neurônios <ol><li> Coloque uma fatia na câmara de gravação e procurar células saudáveis. Estas células normalmente têm menos contraste, uma aparência suave e não estão inchados. </li><li> Inspeccionar a fatia sob o microscópio com a lente de ampliação de 40X e procurar as células em 5 camada, localiza-se, aproximadamente, 600 a 1000 um a partir da superfície do cérebro. </li&gt; <li> Uma vez que uma célula adequada, a carga de um terço da micropipeta com o ICS e colocá-lo no andar de entrada. </li><li> No computador pessoal executando o CD ao vivo ou o sistema operacional Linux pré-configurado, abra um shell de comando (por exemplo, bash) e pelo seu tipo prompt de comando LCG-zero. Isso garante que a placa DAQ não está dirigindo o amplificador. </li><li> Aplicar 30 - 50 mbar de pressão positiva, pressionando o pistão de uma seringa comum, ligada por tubagem para o suporte da pipeta e, com a ajuda de um microscópio, colocar a pipeta de aproximadamente 100 mm acima da fatia. NOTA: Coloque a pipeta numa posição que permite uma via directa para a célula alvo, de preferência usando o modo de abordagem do micromanipulador. </li><li> Agindo sobre os controles do amplificador eletrofisiologia, ajustar o deslocamento pipeta e saída de um pulso de teste (10 mV) no modo braçadeira de tensão. </li><li> Reduzir a pressão para 10 - 30 mbar (dependendo do tamanho da pipeta), retirando oêmbolo da seringa; aproximar suavemente a célula e verificar a formação de uma ondulação, observando a imagem no monitor da câmara de vídeo. Monitore o pulso de teste para um aumento da resistência em todos os momentos, observando a forma de onda atual exibida no osciloscópio ligado ao amplificador eletrofisiologia (alternativamente, você pode usar o LCG-seal-teste de comando para monitorar a resistência pipeta). </li><li> Libertar a pressão e, se necessário aplicar pressão negativa suave para a pipeta para ajudar a formação de selo quando se detectar um aumento na resistência da pipeta e a formação de uma &quot;ondulação&quot; na célula. </li><li> Enquanto as formas de vedação, gradualmente, diminuir o potencial de realização de -70 mV. </li><li> Uma vez que um selo gigaohm tenha sido obtida, garantir que a corrente de retenção é entre 0-30 pA. Aplicar pulsos curtos de pressão negativa (sucção) para quebrar a membrana e estabelecer a configuração de célula inteira. Alternativamente, você pode injetar pulsos fortes e breves de tensão ( <em&gt; isto é, utilizando o comando &quot;ZAP&quot; no amplificador ou segurando a célula em muito negativa) para romper a membrana, dependendo da preparação e pipeta de vidro utilizado. </li><li> Alternar para o modo pinça de corrente e verificar se o potencial de repouso da membrana é típica de uma célula saudável. Para neurônios piramidais corticais usando uma solução baseada em potássio-gluconato, este valor é geralmente entre -65 e -75 mV. </li></ol> 4. Caracterização semi-automática de Imóveis resposta elétrica do neurônio <ol><li> Crie um diretório para armazenar os dados do usuário. A fim de fazer isso a empregar um script incluído no LCG vivo CD que cria pastas com base na data. Para usá-lo, digite no prompt de comando cd ~ / experiências LCG-criar-experimento-pasta-s psp, in_vivo_like Isto irá criar uma pasta onde os dados para essa célula será salvo (e um &#39;psp&#39; e &#39;in_vivo_like&#39; subpastas) e ele irá imprimir o seu nome para o terminaljanela; também é possível armazenar informações adicionais, tais como a resistência da pipeta e tipo de célula usando este script. </li><li> Altere o diretório para a pasta recém criada usando o comando cd ~ / &lt;foldername&gt; O nome da pasta é a que é exibida pelo comando LCG-criar-experimento de pasta e terão o carimbo de hora do dia atual (ou seja, ano-mês-dia), como em 20140331A01. </li><li> Certifique-se de que o amplificador é configurado para operar no modo de alicate de corrente, de que os cabos estão conectados e de comando externo de tensão do amplificador, se presente, está habilitado. </li><li> Digite o comando LCG-ecodeat prompt de comando. Isso exige uma série de comandos (ou seja LCG-ap, lcg-vi, lcg-ramp, lcg-tau e LCG-passos), utilizado para caracterizar as propriedades básicas de resposta da célula. LCG-ecode requer que o utilizador especificar dois parâmetros: a amplitude do 1 ms de duração de impulso de corrente usada para induzir um único pico na célula, e a amplitude máxima da corrente de carneirop injectado para dentro da célula para encontrar a sua reobase. Use a seguinte sintaxe de comando: LCG-ecode --pulse-amplitude X---ramp amplitude Y com uma escolha dos valores de x e Y (em Pa) que são suficientes para tornar o fogo de células em resposta a um 1 ms de duração de pulso e uma injecção de corrente contínua, respectivamente. NOTA: Estes protocolos exigem a execução da estimativa numérica do &#39;kernel do eléctrodo &quot;, a fim de usar o eletrodo de Compensação Ativa (AEC) 15. A injeção de corrente ruidosa é usado para estimar o kernel eo usuário é solicitado a confirmar o número de amostras que compõem o kernel. Veja 15 para obter informações detalhadas sobre o significado do kernel do eletrodo e como escolher o número de amostras do kernel. </li></ol> 5. Injeção de condutância através simulados Sinapses e Simulação de In Vivo -como Atividade Fundo <ol><li> A injeção de potenciais pós-sinápticos excitatórios simulados <ol><li>Mude para o diretório onde você irá salvar o próximo experimento, digitando o seguinte comando no prompt de comando do shell: psp cd / 01 </li><li> Copiar um arquivo de configuração de LCG para o diretório atual e abri-lo com um editor de texto (Nano neste exemplo), digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell (este arquivo de configuração exemplo está incluído no código fonte eo cd ao vivo) : cp ~ / local / src / lcg / configurações / epsp.xml nano epsp.xml NOTA: Este é simplesmente um ficheiro de texto com diferentes entidades ligadas uma à outra. Para mais detalhes veja a seção Resultados Representante. </li><li> Se necessário editar o inputChannel, outputChannel, o inputConversionFactor eo outputConversionFactor neste arquivo para coincidir com a configuração do usuário. </li><li> Calcule o kernel eletrodo necessário para executar a compensação eletrodo ativo &#39;o método utilizado pela LCG para executar eletrodo único grampo dinâmico &quot;, emitindo o command LCG-kernel Isto irá pedir para o número de pontos do kernel. Novamente, seleccionar um número de modo a que o núcleo de eléctrodo cobre a extremidade da cauda de decaimento exponencial. </li><li> Realizar o experimento braçadeira dinâmica usando o comando LCG-experimentar epsp.xml -c </li><li> Listar os arquivos e visualizar os resultados usando o comando ls -l LCG-plot--f arquivo último </li></ol></li><li> Injeção de potenciais pós-sinápticos inibitórios simulados <ol><li> Crie uma pasta e copiar o arquivo para epsp.xml-lo digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml cd ../02 </li><li> Edite o arquivo de configuração usando um editor de texto: mudar o potencial reversão sináptica e subir e tempo de decaimento constantes do Exp2Synapse modelo sinapse para o seguinte: parâmetros&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0.8e-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;parâmetros&gt; Saia do editor de texto. </li><li> Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: LCG-kernel LCG-experimentar ipsp.xml -c </li><li> Listar os arquivos e visualizar os resultados, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: ls -l LCG-plot-arquivo -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> Simulação de in vivo -como atividade de fundo: <ol><li> Mude para o diretório onde você deseja salvar o seguinte experimento, conforme demonstrado anteriormente, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: cd ../../in_vivo_like/01 </li><li> Copie o arquivo de configuração do directório de origem LCG, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: cp ~ / local / src / lcg / configurações / in_vivo_like.xml nano in_vivo_like.xml <br /&gt; NOTA: Este arquivo é simplesmente a concatenação dos anteriores; dois processos de Poisson pontos que geram trens ponto, que por sua vez alimentam inibitórios e excitatórios sinapses modelo, geram a atividade de fundo. </li><li> Ajustar os parâmetros de configuração DAQ para a configuração do usuário, conforme descrito no ponto 5.1.3 e saia do editor. </li><li> Calcule o kernel do eléctrodo e realizar o experimento como em 5.1, digitando os seguintes comandos no prompt de comando do shell: LCG-kernel LCG-experimentar in_vivo_like.xml -c -n -i 10 3 Os interruptores &#39;-n 10&#39; e &#39;-i&#39; 3 indicam que a estimulação deve ser repetida 10 vezes em intervalos de três segundos. </li><li> Visualize os traços matérias por usando o seguinte comando no prompt de comando do shell: LCG-plot-arquivo -f tudo </li></ol></li></ol>

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<li>Buzsáki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li>
<li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKoch%2C+C+%22Methods+in+Neuronal+Modeling%3A+From+Synapses+to+Networks%22">Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks</a>. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).</li>
<li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li>
<li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+biology%22%5BJournal%5D)">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li>
<li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+networks+with+dynamic+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+computation%22%5BJournal%5D)">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li>
<li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Neste texto um protocolo completo para a aplicação em tempo real, em circuito fechado célula única experimentos eletrofisiológicos foi descrito, utilizando a técnica de patch-clamp e uma caixa de ferramentas de software recentemente desenvolvido chamado LCG. Para otimizar a qualidade das gravações é crucial que a configuração de gravação ser devidamente fundamentada, blindado e vibração livre: Isso garante o acesso de células inteiras estável e duradoura para o celular, que, juntamente com a possibilidade de automatizar...

<html> Nos últimos anos, electrofisiologia celular evoluiu a partir do paradigma de ciclo aberto tradicional utilizado em experiências de tensão e de corrente de fixação com os protocolos de circuito fechado modernos. A técnica de circuito fechado mais conhecido é talvez o grampo dinâmico 6,7, o que permitiu a injecção sintética de canais artificiais dependentes da voltagem de íons para determinar a voltagem da membrana neuronal 8, o estudo em profundidade dos efeitos da não-determinístico piscando em canais iônicos sobre a dinâmica de resposta neuronal 9, bem como a recriação in vitro de realista em vivo- como atividade fundo sináptica 10. Outros paradigmas de circuito fechado que foram propostas incluem o grampo reactivo 11, para estudar in vitro a geração de actividade persistente auto-sustentado, e a resposta braçadeira 4,12, para investigar os mecanismos celulares excitabilidade neuronal subjacente. ontent &quot;&gt; Descrevemos aqui um quadro poderosa que permite a aplicação de uma variedade de protocolos electrofisiológicas de circuito fechado no contexto de gravações de células inteiras patch clamp realizados em fatias cerebrais agudas. Mostramos como gravar tensão somática membrana por meio de gravações de patch clamp em neurônios piramidais do córtex somatossensorial de ratos jovens e aplicar três protocolos de circuito fechado diferentes usando LCG, uma caixa de ferramentas de software baseado em linha de comando desenvolvido no laboratório de Neurobiologia e teórico Neuroengineering. Resumidamente, os protocolos descritos são, em primeiro lugar a injecção automática de uma série de formas de onda de corrente de fixação de estímulo, relevantes para a caracterização de um grande conjunto de propriedades da membrana activas e passivas. Estes têm sido sugeridos para capturar o fenótipo electrofisiológico de uma célula em termos das suas propriedades de resposta a uma série de formas de onda de estímulo estereotipado. Conhecido como o e-code de uma célula (por exemplo, ver &amp; #160; 13,14), como um conjunto de respostas eléctricas é utilizado por vários laboratórios para classificar objectivamente neurónios na base das suas propriedades eléctricas. Isto inclui a análise da relação de transferência de entrada-saída estacionária (curva FI), por uma técnica inovadora que envolve o circuito fechado, o controlo em tempo real da taxa de disparo por meio de um regulador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo a recriação da in vivo -como fundo atividade sináptica realista em preparações in vitro 10 e, em terceiro lugar a conexão artificial em tempo real de dois neurônios piramidais gravados simultaneamente por meio de um interneurônio GABAergic virtual, que é simulada pelo computador. Além disso, LCG implementa a técnica conhecida como Ativo Eletrodo Compensação (AEC) 15, que permite a implementação de protocolos de fixação dinâmicos usando um único eletrodo. Isto permite compensar os efeitos indesejáveis ​​(umrtifacts) do eléctrodo de registo que surgem quando é utilizado para a entrega de estímulos intracelulares. O método baseia-se numa estimativa não-paramétrico de as propriedades equivalentes eléctricos do circuito de gravação. As técnicas e protocolos experimentais descritos no presente documento podem ser facilmente aplicadas na tensão de circuito aberto convencional e experiências de fixação de corrente e pode ser alargado a outras preparações, tais como extracelular 4,16 ou gravações intracelulares, in vivo 17,18. A montagem cuidadosa da configuração para fixação de membranas de células inteiras eletrofisiologia é um passo muito importante para, gravações de alta qualidade estáveis. A seguir vamos supor que uma configuração tal experimental já está disponível para o experimentador, e concentrar a nossa atenção na descrição do uso de LCG. O leitor é apontado 19-22 por mais dicas sobre otimização e depuração.

<table><tbody><tr><td>Fatiador de tecidos</td><td>Leica</td><td>VT-1000S</td><td></td></tr><tr><td>Extrator de pipetas</td><td>Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>WPI</td><td>1B150F-4</td><td>1,5/0,84 mm OD/ID, com filamento</td></tr><tr><td>Mesa de isolamento de vibração Microscópio</td><td>TMC</td><td></td><td>Série 20</td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>DMLFS</td><td>40X Manipuladores de Objetiva de Imersão</td></tr><tr><td></td><td>Scientifica</td><td>Amplificadores PatchStar</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Axon Instruments</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Placa</td></tr><tr><td>de aquisição de dados</td> controlada <td>por computador National Instruments</td><td>PCI-6229</td><td>Suportado por drivers Comedi Linux</td></tr><tr><td>Computador desktop</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Tower OS: tempo real Linux</td></tr><tr><td>Osciloscópios</td><td>Tektronix</td><td>TDS-1002</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Bomba</td><td>Gibson</td><td>MINIPULS3</td><td>Usado com cabeça de bomba R4 (F117606)</td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Sistemas multicanais</td><td>TC02</td><td>PH01 Manômetro de cânula de perfusão</td></tr><tr><td></td><td>Testo</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td> opcional <td>Memmert</td><td>WB14</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>ACSF, ICS</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>ACSF</td></tr><tr><td>K-Gluconato</td><td>Sigma</td><td>G4500</td><td>ICS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td>ICS</td></tr><tr><td>Na2-Fosfocreatina</td><td>Sigma</td><td>P7936</td><td>ICS</td></tr></tbody></table>

eletrofisiologia em tempo real: usando protocolos de circuito fechado para sondar neuronal dynamics and beyond

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Neuroscience experimental está a assistir um interesse crescente no desenvolvimento e aplicação de protocolos de novos e muitas vezes complexas, em circuito fechado, onde o estímulo aplicado depende em tempo real sobre a resposta do sistema. Aplicações recentes vão desde a implementação de sistemas de realidade virtual para o estudo de respostas motoras, tanto em camundongos e em um peixe-zebra 2, para controlar de convulsões seguintes acidente vascular cerebral cortical usando a optogenética 3. Uma das principais vantagens das técnicas de circuito fechado reside na capacidade de sondagem propriedades dimensionais mais altos que não estão directamente acessíveis ou que dependem de várias variáveis, tais como a excitabilidade neuronal 4 e fiabilidade, ao mesmo tempo maximizar a taxa de transferência experimental. Neste contribuição e no contexto de electrofisiologia celular, que descrevem como a aplicação de uma variedade de protocolos de circuito fechado para o estudo das propriedades de resposta de neurónios piramidais corticais, recorded intracelularmente com a técnica de patch clamp em fatias cerebrais agudas do córtex somatossensorial de ratos jovens. Como nenhum software de código aberto disponíveis comercialmente ou fornece todos os recursos necessários para desempenhar eficazmente as experiências descritas aqui, uma nova caixa de ferramentas de software chamado LCG 5 foi desenvolvido, cuja estrutura modular maximiza a reutilização de código de computador e facilita a implementação de novos paradigmas experimentais. Formas de onda de estimulação são especificados usando uma meta-descrição compacta e protocolos experimentais completos estão descritos nos arquivos de configuração baseados em texto. Além disso, LCG tem uma interface de linha de comando que é adequado para a repetição de ensaios e automação de protocolos experimentais.

Nas seções anteriores, descrevemos como usar a caixa de ferramentas de software LCG para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas de células piramidais L5 e recriar in vivo -como atividade sináptica em uma preparação fatia. O uso de uma interface de linha de comando e protocolo semi-automatizado favorecer a reprodutibilidade e a eficiência da experiência, o que pode ter um grande impacto sobre a produção e a qualidade dos dados produzidos. Além disso, uma vez que os dados são guardados de uma forma consi...

Os protocolos de circuito fechado estão se tornando cada vez mais difundidos na eletrofisiologia moderna. Apresentamos uma maneira simples, versátil e barata de realizar protocolos eletrofisiológicos complexos em neurônios piramidais corticais in vitro, usando um computador desktop e uma placa de aquisição digital.

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

O objetivo geral do seguinte experimento é realizar o clamp dinâmico in vitro em neurônios corticais utilizando a caixa de ferramentas de software gratuitamente disponível, LCG. Isso é alcançado preparando fatias do córtex somatossensorial de rato para gravações de patch clamp a partir das células parametais. Como segundo passo, uma série de protocolos eletrofisiológicos automatizados é aplicada à célula gravada, o que fornece uma caracterização padrão da célula que será útil para análises subsequentes e comparações entre tipos celulares.Em seguida, simula-se a injeção de eventos sinápticos excitatórios e inibitórios. Para recriar o estado de alta condutância vivenciado pelos neurônios neocorticais in vivo, os resultados demonstram como a injeção sináptica de fundo modula o ganho das células corticais. A principal vantagem desta técnica em relação aos métodos existentes é a possibilidade de incorporar gravações experimentais em fluxos de trabalho mais complexos, utilizando, por exemplo, o resultado de um protocolo experimental como entrada para outro protocolo.Este método pode ajudar a padronizar protocolos eletrofisiológicos, acelerar a análise de dados e abrir caminho para o compartilhamento de dados entre laboratórios. Embora este método tenha sido originalmente desenvolvido para gravações de patch CLA em preparações in vitro, ele também pode ser convenientemente utilizado para outras preparações experimentais e protocolos, como patch in vivo, gravações CLA ou gravações com microarranjos. Após extrair o cérebro de rato, descarte o cerebelo e separe os dois hemisférios ao longo da linha média usando um bisturi; remova o excesso de fluido de um dos hemisférios e cole-o em uma plataforma inclinada com uma gota de cola super forte.Em seguida, adicione rapidamente algumas gotas de LCR sobre o cérebro e transfira-o para a câmara Vibram. Remova os primeiros 2,5 a três milímetros do tecido cerebral com uma lâmina. Posteriormente, ajuste a velocidade e a frequência de corte para limitar os danos à superfície do corte.Em seguida, ajuste a espessura para 300 micrômetros e inicie o corte. Uma vez que a lâmina tenha ultrapassado o córtex, utilize uma lâmina de barbear ou uma agulha curvada para fazer um corte acima do hipocampo e nas bordas da região cortical de interesse. Depois disso, transfira as fatias para uma câmara de incubação multiplaca a 36 graus Celsius.Neste procedimento, coloque um corte na câmara de registro com a lente de magnificação de 40 x. Procure células saudáveis na camada cinco e entre 600 a 1000 micrômetros abaixo da superfície do cérebro. Essas células geralmente têm menor contraste, aparência lisa e não estão inchadas.Uma vez que uma célula saudável seja encontrada, carregue um terço da micropipeta com solução intracelular. Em seguida, coloque-a no estágio de cabeça no sistema operacional Linux previamente configurado. Execute um comando.O shell adiciona seu prompt. Digite este comando para garantir que a placa de aquisição de dados não esteja acionando o amplificador. Em seguida, aplique uma pressão positiva de 30 a 50 milibares pressionando o pistão da seringa, que está conectada ao suporte de micropipeta.Em seguida, posicione a pipeta aproximadamente a 100 micrômetros acima do corte e mova a pipeta em direção à célula-alvo utilizando o modo de aproximação do micromanipulador. Depois disso, ajuste o offset da pipeta no amplificador de eletrofisiologia e emita um pulso de teste de 10 milivolts no modo de fixação de voltagem. Utilize o comando LCG SEAL test para monitorar a resistência da pipeta, então reduza a pressão para 10 a 30 milibares retirando o êmbolo da seringa.Aproxime-se suavemente da célula e verifique a formação de uma depressão observando a imagem no monitor da câmera de vídeo. Ao mesmo tempo, observe o aumento na resistência provocado pelo pulso de teste, acompanhando a forma de onda da corrente exibida no monitor. Quando houver aumento na resistência da pipeta e formação de uma depressão na célula, libere imediatamente a pressão e aplique uma pressão negativa suave à pipeta para auxiliar na formação do selo.Enquanto isso, diminua gradualmente o potencial de retenção para menos 70 milivolts. Aplique sucção suave para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de célula inteira. Em seguida, caracterize a célula em termos de suas propriedades elétricas.Utilizando o comando LCGE code. Aqui está o potencial de ação médio de um neurônio parametal da camada cinco com um limiar de menos 50,5 milivolts. Esta figura mostra a medição das respostas passivas a correntes hiperpolarizantes.A identificação das propriedades ativas básicas da célula revela que a célula é um neurônio de disparo regular, e há uma adaptação mínima à injeção de potenciais excitatórios simulados pós-sinápticos. Altere para o diretório onde o próximo experimento será salvo digitando este comando no prompt de comando do shell. Em vez de atuar nos controles convencionais de hardware do amplificador, aplique o balanceamento de ponte e a compensação de capacitância para estimar o kernel do eletrodo necessário para realizar a compensação ativa do eletrodo emitindo este comando.O kernel completo é a soma de dois componentes: um kernel de eletrodo rápido e um kernel de membrana mais lento, que dá origem à cauda exponencial observada no kernel completo. O primeiro constitui um modelo não paramétrico da pipeta. Após a injeção de corrente para separar os kernels de membrana e de eletrodo, o comando kernel LCG solicitará ao usuário o número de pontos que compõem o kernel de eletrodo rápido. Em seguida, selecione um número de modo que o kernel de eletrodo cubra o final da cauda de decaimento exponencial.Em seguida, realize o experimento de clamp dinâmico utilizando este comando. Por fim, visualize os resultados. A seguir, tem-se a recreação de atividade semelhante à in vivo utilizando o clamp dinâmico.Os traços vermelhos e azuis representam a simulação de sinapses excitadoras e inibidoras, respectivamente. E aqui estão os traços de tensão registrados de um neurônio parametal L5, que foi submetido a um bombardeio de correntes pós-sinápticas excitadoras ou inibidoras. As correntes injetadas correspondentes, excitadora, inibidora e total, na célula são mostradas no gráfico.O gráfico raster dos potenciais de ação gerados ao longo de 20 ensaios mostra que o neurônio pode ser extremamente confiável e preciso em resposta ao mesmo estímulo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar experimentos de estímulo dinâmico utilizando a caixa de ferramentas de software gratuitamente disponível LCG. Este procedimento pode ser estendido a outros protocolos de malha fechada para investigar uma ampla variedade de temas, que vão desde a excitabilidade neural até interações complexas em redes.

real-time-electrophysiology-using-closed-loop-protocols-to-probe

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Um procedimento é descrito para manipular a actividade de neurónios piramidais corticais cerebrais optogenetically enquanto o electroencefalograma, electromiograma, e concentração do lactato cerebral são monitorados. Gravações experimentais são realizados em ratinhos de cabo-cativos, enquanto eles sofrem espontâneas do sono / vigília ciclos. Optogenética equipamento é montado no nosso laboratório, o equipamento de gravação encontra-se comercialmente disponível.

Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

Neste artigo, é apresentada uma estrutura experimental para realizar experimentos de malha fechada, na qual o processamento de informações (ou seja, codificação e decodificação) e o aprendizado de montagens neuronais são estudados durante a interação contínua com um corpo robótico.

De circuito fechado experiências neuro-robótico para testar as propriedades computacionais da Neuronal Networks

Células neuronais de rato cultivadas em matrizes de múltiplos eléctrodos apresentam um aumento na resposta após estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar neurônios, como registrar a atividade, e como estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Neste estudo, a metodologia é apresentada sobre como realizar gravações eletrofisiológicas in vivo multi-site a partir da via hiperdiretiva sob anestesia com uretano.

Agudo<em&gt; In Vivo</em&gt; Gravações eletrofisiológicas de Potenciais de campo locais e atividade de múltiplas unidades a partir do caminho hiperdiretivo em ratos anestesiados

Este protocolo demonstra como usar um sistema eletrofisiológico para estimulação de circuito fechado desencadeada por padrões de atividade neuronal. O código matlab da amostra que pode facilmente ser modificado para dispositivos diferentes da estimulação é fornecido igualmente.

Usando a atividade de spiking do neurônio para provocar estímulos do Closed-Loop em experiências neurophysiological

Descrevemos um protocolo para avaliação de curvas dose-resposta para estimulação extracraniana em termos de medidas de campo elétrico cerebral e um biomarcador relevante de fluxo sanguíneo cerebral. Como esse protocolo envolve a colocação invasiva de eletrodos no cérebro, a anestesia geral é necessária, com respiração espontânea preferida em vez de respiração controlada.

Colocação de eletrodos estimuladores extracranianos e mensuração do fluxo sanguíneo cerebral e campos elétricos intracranianos em camundongos anestesiados

Aqui, empregamos HD-MEA para nos aprofundarmos na dinâmica computacional de conjuntos neuronais de grande escala, particularmente em hipocampo, circuitos de bulbos olfativos e redes neuronais humanas. A captura da atividade espaço-temporal, combinada com ferramentas computacionais, fornece insights sobre a complexidade do conjunto neuronal. O método melhora a compreensão das funções cerebrais, potencialmente identificando biomarcadores e tratamentos para distúrbios neurológicos.

Gravação e Análise da Dinâmica Multimodal de Conjuntos Neuronais em Larga Escala em Microeletrodos de Alta Densidade Integrados CMOS

Aqui, apresentamos um sistema de implante de sonda leve e econômico para eletrofisiologia crônica em roedores otimizado para facilidade de uso, recuperação de sonda, versatilidade experimental e compatibilidade com o comportamento.

O implante DREAM: um sistema de implante leve, modular e econômico para eletrofisiologia crônica em camundongos com cabeça fixa e comportamento livre

Desenvolvemos uma abordagem simplificada e econômica para a fabricação de eletrodos e realizamos gravações de sinais em várias regiões em camundongos em movimento livre. A utilização da optogenética, juntamente com a eletrofisiologia multirregional e o registro do sinal de cálcio, permitiu a revelação de atividades neuronais em todas as regiões do modelo de acendimento de convulsões.

Um método integrado para criar otérios eletrofisiológicos flexíveis e convenientes para gravação in vivo em várias regiões

A eletrofisiologia dinâmica do clamp pode estabelecer ligações causais entre déficits de disparo neuronal e disfunção do canal iônico. Descrevemos métodos e protocolos de grampo dinâmico em neurônios de Purkinje cerebelares de camundongos, observando recursos úteis e considerações técnicas. Em um estudo representativo, adicionamos condutância de sódio modelada aos neurônios Tsc1-/- Purkinje para resgatar disparos repetitivos.

Métodos dinâmicos de grampo para investigar a excitabilidade neuronal prejudicada associada ao autismo

Aprenda a realizar dynamic clamp em neurônios corticais usando o software LCG. Este método automatiza protocolos eletrofisiológicos para caracterizar células e simular eventos sinápticos in vitro.

Eletrofisiologia em tempo real: Usando protocolos de circuito fechado para sondar Neuronal Dynamics and Beyond

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