Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

O objetivo geral deste procedimento é isolar e associar tecido neuronal de camundongo E17, a fim de cultivar, registrar e estimular redes neuronais em matrizes de microeletrodos. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no estudo da dinâmica de rede, pois elas se relacionam com os mecanismos básicos de aprendizagem e memória. A principal vantagem dessa técnica é que os feixes de microeletrodos são capazes de gravar de vários locais simultaneamente e, portanto, podem fornecer melhor resolução espacial e temporal, em comparação com a pipeta de vidro mais tradicional na gravação em um único local.

Embora esse método possa fornecer informações sobre a dinâmica da rede de aprendizado e memória, ele também pode ser usado para investigar a toxicidade de drogas ou projetar paradigmas para a medicina personalizada de próxima geração. A demonstração visual desse processo é crítica, pois a manipulação do tecido durante o processo de dissecção e dissociação é difícil de aprender simplesmente lendo apenas os protocolos. Para preparar a matriz, adicione 40 a 50 microlitros de laminina descongelada no centro de cada MEA e 0,2 mililitros de laminina nas placas de controle, usando pontas de pipeta estéreis.

Cubra todos os MEAs e os pratos de controle na biohood e transfira-os para uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, remova cuidadosamente o excesso de laminina do centro dos MEAs usando sucção com pipetas Pasteur estéreis e deixe a superfície secar ao ar antes de plaquear. Em seguida, despeje o meio L-15 em quatro placas de Petri de 100 milímetros, cubra-as e coloque-as em um freezer de 20 graus Celsius negativos por cerca de 40 a 60 minutos, até que o meio tenha uma consistência lamacenta, mas não esteja congelado.

Para se preparar para a dissecação, coloque uma placa de Petri de vidro virada para baixo em uma bandeja cheia de gelo. Agora pulverize o abdômen inferior dos animais com 70% de etanol. Usando uma pequena tesoura cirúrgica, faça um corte em forma de V na pele e na gordura subcutânea da parte inferior do abdômen, estendendo o corte até as extremidades distais da cavidade torácica e expondo o útero.

Usando uma pinça, levante cuidadosamente o útero entre os embriões. Corte o tecido conjuntivo com uma tesoura de dissecção até que todo o útero esteja livre. Em seguida, enxágue brevemente o útero com etanol a 70% para remover o sangue e coloque-o em uma das quatro placas de Petri cheias de L-15 frio.

Posteriormente, libere cada embrião do útero e do saco embrionário interno, usando dois pares de pinças de ponta fina. Coloque os embriões liberados no segundo prato cheio de L-15 frio, depois transfira as cabeças para o terceiro Petri Na biocapa, coloque uma cunha de papel de filtro autoclavado no estágio de placa de Petri de vidro resfriado e coloque uma cabeça de embrião no papel de filtro.

Em seguida, coloque a aresta cortante do cisalhamento inferior da tesoura de íris na base do crânio, mantendo o cisalhamento inferior contra a superfície interna do crânio e longe do cérebro, corte a placa occipital e depois ao longo da linha média entre as placas parietais. Continue cortando rostralmente entre as placas cranianas frontais cartilaginosas. Em seguida, começando no centro da placa occipital, faça um corte perpendicular à esquerda e à direita do corte central.

Depois disso, deslize cuidadosamente uma pequena espátula entre a superfície ventral do cérebro e as placas inferiores do crânio, até que esteja completamente sob o cérebro. Em seguida, levante a espátula para remover o cérebro. Usando uma espátula limpa, primeiro remova o bulbo olfatório e, em seguida, disseque o lobo frontal em um padrão trapezoidal.

Em seguida, transfira o tecido para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo meio de armazenamento. Neste procedimento, use duas lâminas de bisturi estéreis para picar o tecido. Em seguida, adicione 2,5 mililitros da mistura de papaína Dnase ao tecido picado na placa de Petri.

Agite suavemente a placa de Petri para garantir que todo o tecido esteja livre na solução e não aderido ao fundo da placa. Depois, coloque o prato em uma incubadora a 37 graus Celsius por 15 minutos. Na biocapa, use uma pipeta de transferência estéril de diâmetro largo para transferir todos os meios e tecidos para um tubo criogênico estéril de cinco mililitros.

Coloque a ponta da mesma pipeta de transferência perto do fundo do tubo e chitere suavemente a mistura 10 a 15 vezes. Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM 5/5 aquecido à mistura de células dissociadas e tampe o tubo da centrífuga. Misturar delicadamente por inversão e centrifugar a 573 vezes g durante cinco minutos à temperatura ambiente.

No biohood, descarte todo o sobrenadante sem quebrar o palete. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM 5/5 aquecido ao palete no tubo para ressuspender as células. Use uma pipeta de transferência estéril de pequeno calibre para quebrar o palete, canalizando suavemente para cima e para baixo até que a mistura fique homogênea.

Em seguida, transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Fora do biohood, adicione 10 microlitros de azul de tripano aos 10 microlitros de suspensão celular no tubo da microcentrífuga. Em seguida, carregue 10 microlitros da suspensão de células azuis de tripano em um chip de hemocitômetro de descarte para contar as células.

No biohood, use uma micropipeta estéril para transferir 50 microlitros de suspensão celular para o centro de cada matriz e cada placa de Petri de controle. Em seguida, coloque as placas de Petri cobertas em uma incubadora ajustada para 37 graus Celsius por três a quatro horas. Em seguida, adicione delicadamente um mililitro de DMEM 5/5 aquecido a cada MEA.

Adicione cuidadosamente o meio, uma gota de cada vez, ao redor das bordas internas do MEA e evite lavar as células do centro da matriz. Em seguida, coloque uma tampa contendo uma membrana FEP permeável a gás em cada MEA antes de devolvê-los à incubadora. Após dois dias, faça uma substituição completa do meio com DMEM+ aquecido retirando o meio do prato.

Coloque cuidadosamente a ponta da pipeta na parede interna e dispense um mililitro de DMEM+Para as mamadas subsequentes, retire 500 microlitros de meio do prato e dispense 500 microlitros de DMEM+novamente aquecido. Neste procedimento, inspecione as amostras de pratos a cada dois dias ao microscópio, para procurar cobertura celular sobre a matriz e contaminação por bactérias ou fungos. Antes de retirar as culturas da incubadora, conecte o controlador de temperatura e ligue o sistema, permitindo que a placa de base aquecida do pré-amplificador atinja 35 graus Celsius.

Em seguida, coloque a cultura tampada no pré-amplificador, de modo que a linha preta no MEA se alinhe bem com o aterramento de referência. Certifique-se de que o préamppinos do amplificador alinhados de forma que a parte superior do préamplifier está preso, e a tampa de cultura ainda está colocada. Em seguida, pressione iniciar no ambiente de software para começar a visualizar os sinais.

Na janela principal, selecione Picos, Detecção, Automático, altere o valor do desvio padrão para menos cinco e clique em Atualizar para redefinir o limite. Depois de visualizar os sinais, clique em Parar, Gravar e Reproduzir para iniciar a atividade de gravação. Os neurônios embrionários de camundongos são plaqueados em MEAs de 60 canais, que permitem o registro simultâneo da atividade neuronal em toda a rede de cada eletrodo.

Aqui está um gráfico raster representativo da atividade de oito eletrodos em resposta à estimulação antes e depois do treinamento. A linha vermelha vertical indica o tempo do estímulo e as marcas pretas indicam potenciais de ação. No pré-treino, há uma resposta imediata ao pulso do estímulo através dos canais.

No pós-treino, a rede exibe uma resposta de atividade mais prolongada, bem como a resposta imediata à estimulação. Aqui está a média de 12 redes treinadas e 10 de controle, as redes treinadas indicam frequências de pico significativamente alteradas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar e associar tecido neuronal de camundongos embrionários e ser capaz de cultivar, registrar e estimular redes neuronais de matrizes de microeletrodos.