Name: Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprenda a isolar e cultivar tecido neuronal de embriões de rato E17 em matrizes de microeletrodos para estudar dinâmicas de rede relacionadas à aprendizagem e memória.

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Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation conceder CMMI-1300007. Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório anterior, que ajudaram com o desenho desses protocolos e com a manutenção das culturas por mais de cinco anos na Universidade George Mason: Dr. Joseph J. Pancrazio, Dr. Hamid Charkhkar, Dr. Gretchen Knaack , Dr. Franz Hamilton, Michael Maquera e Robert Graham.

<ol><li>Charkhkar, H., Frewin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+cortical+neuronal+networks+for+in+vitro+material+biocompatibility+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Use of cortical neuronal networks for in vitro material biocompatibility testing.</a> Biosens Bioelectron. 53, 316-323 (2014).</li>
<li>Bologna, L. L., Nieus, T., Tedesco, M., Chiappalone, M., Benfenati, F., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-frequency+stimulation+enhances+burst+activity+in+cortical+cultures+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Low-frequency stimulation enhances burst activity in cortical cultures during development.</a> Neuroscience. 165 (3), 692-704 (2010).</li>
<li>Fröhlich, F., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+electric+fields+may+guide+neocortical+network+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Endogenous electric fields may guide neocortical network activity.</a> Neuron. 67 (1), 129-143 (2010).</li>
<li>Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephaptic+coupling+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ephaptic coupling of cortical neurons.</a> Nature Neurosci. 14 (2), 217-223 (2011).</li>
<li>Ozen, S., Sirota, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcranial+electric+stimulation+entrains+cortical+neuronal+populations+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcranial electric stimulation entrains cortical neuronal populations in rats.</a> J. Neurosci. 30 (34), 11476-11485 (2010).</li>
<li>Wagenaar, D. A., Madhavan, R., Pine, J., Potter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+bursting+in+cortical+cultures+with+closed-loop+multi-electrode+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Controlling bursting in cortical cultures with closed-loop multi-electrode stimulation.</a> J. Neurosci. 25 (3), 680-688 (2005).</li>
<li>Shahaf, G., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Learning in networks of cortical neurons.</a> J. Neurosci. 21 (22), 8782-8788 (2001).</li>
<li>Marom, S., Shahaf, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development%2C+learning+and+memory+in+large+random+networks+of+cortical+neurons%3A+lessons+beyond+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Development, learning and memory in large random networks of cortical neurons: lessons beyond anatomy.</a> Q Rev Biophys. 35 (1), 63-87 (2002).</li>
<li>Marom, S., Eytan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Learning+in+ex-vivo+developing+networks+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Learning in ex-vivo developing networks of cortical neurons.</a> Prog Brain Res. 147, 189-199 (2005).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+learning+in+cultured+neuronal+networks+with+antagonists+of+glutamate+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of learning in cultured neuronal networks with antagonists of glutamate receptors.</a> Biophys. J. 93 (12), 4151-4158 (2007).</li>
<li>Li, Y., Zhou, W., Li, X., Zeng, S., Liu, M., Luo, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synchronized+bursts+in+cultured+hippocampal+neuronal+networks+with+learning+training+on+microelectrode+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Characterization of synchronized bursts in cultured hippocampal neuronal networks with learning training on microelectrode arrays.</a> Biosens Bioelectron. 22 (12), 2976-2982 (2007).</li>
<li>Chiappalone, M., Massobrio, P., Martinoia, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+plasticity+in+cortical+assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Network plasticity in cortical assemblies.</a> Eur. J. Neurosci. 28 (1), 221-237 (2008).</li>
<li>le Feber, J., Stegenga, J., Rutten, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+slow+electrical+stimuli+to+achieve+learning+in+cultured+networks+of+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">The effect of slow electrical stimuli to achieve learning in cultured networks of rat cortical neurons.</a> PloS one. 5 (1), 8871(2010).</li>
<li>Ruaro, M. E., Bonifazi, P., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+neurocomputer%3A+image+processing+and+pattern+recognition+with+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Toward the neurocomputer: image processing and pattern recognition with neuronal cultures.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 52 (3), 371-383 (2005).</li>
<li>Hamilton, F., Graham, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Dependent+Increase+in+Network+Response+to+Stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Time-Dependent Increase in Network Response to Stimulation.</a> PloS one. 10 (11), 0142399(2015).</li>
<li>Guidelines for Euthanasia of Rodents Using Carbon Dioxide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf">https://oacu.oir.nih.gov/sites/default/files/uploads/arac-guidelines/rodent_euthanasia_adult.pdf</a> (2016).</li>
<li>Banker, G., Goslin, K. <a target="_blank" href="https://mitpress.mit.edu/books/culturing-nerve-cells">Culturing Nerve Cells: Business Source</a>. , MIT Press. Cambridge. (1998).</li>
<li>Gullo, F., Maffezzoli, A., Dossi, E., Wanke, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-latency+cross-and+autocorrelation+identify+clusters+of+interacting+cortical+neurons+recorded+from+multi-electrode+array%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Short-latency cross-and autocorrelation identify clusters of interacting cortical neurons recorded from multi-electrode array.</a> J. Neurosci. Methods. 181, 186-198 (2009).</li>
<li>Eytan, D., Brenner, N., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+Adaptation+in+Networks+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective Adaptation in Networks of Cortical Neurons.</a> J. Neurosci. 23 (28), (2003).</li>
<li>Bonifazi, P., Ruaro, M. E., Torre, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+properties+of+information+processing+in+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Statistical properties of information processing in neuronal networks.</a> Eur. J. Neurosci. 22 (11), 2953-2964 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As etapas descritas neste protocolo fornecem detalhes suficientes para que o iniciante aplique suas próprias culturas neuronais nos MEAs e registre a atividade da rede. Este protocolo ajudará a garantir que as culturas aderem adequadamente, formando uma camada de carpete de células sobre as matrizes de eletrodos, e permanecer saudável e livre de contaminantes por meses. Embora seja melhor aderir a todas as partes do protocolo, existem etapas ao longo do processo que são fundamentais para o resultado bem sucedido. O uso de técnica asséptica ao longo de todo o processo é imperativo para evitar que as culturas se contaminem. Os novos MEAs devem ser hidrófilos, como descrito no protocolo, ou então resultará numa adesão celular fraca. Evitar pipetting áspero ea formação de bolhas de ar durante a dissociação reduzirá o número de pilhas danificadas chapeadas e conduzirá a um rendimento mais elevado e mais saudável. Comutação de DMEM 5/5 para DMEM + após a primeiraAlimentação também é importante. O DMEM 5/5 contém soro de cavalo, o que fará com que as células gliais dominem a cultura se usadas continuamente e resultarão em baixa atividade neuronal, embora as culturas pareçam saudáveis 17 . Alimentar as culturas conforme programado e mantê-las em condições de incubação adequadas também é crucial. Plating culturas de células em MEAs envolve muitas variáveis ​​que podem levar a menos do que os melhores resultados. Embora a meta seja um &quot;tapete&quot; perfeito de células, a incapacidade de resolver os passos críticos mencionados acima resultará em fraca maturação de células ou em contaminação. A baixa aderência celular, que é diferente da má maturação celular, também é uma preocupação. Isto pode ser causado por vários fatores, incluindo preparação de MEA pobres antes de chapeamento ou o uso de meio velho. Se um meio antigo contendo uma forma estabilizada de L-glutamina e um suplemento sem soro para cultura de células neurais (ver Tabela de Materiais), As células inicialmente aderem mas flutuam depois de cerca de duas semanas. Se a contaminação bacteriana é um problema persistente, um antibiótico, tal como ampicilina ou pen-strep, pode ser adicionado ao meio. Existem também fungicidas disponíveis para tratar a contaminação por fungos. Estas são algumas das variáveis ​​mais comuns que podem afetar o resultado das culturas. Há muitos outros que só serão encontrados depois do tempo e da experiência. Em comparação com o uso de microeletrodos de vidro, esta técnica é excelente para estudar dinâmica de rede e respostas farmacológicas. Permite o uso de muitos padrões de estimulação espaço-temporais diferentes e permite a gravação de respostas neuronais de múltiplas áreas ao mesmo tempo. Os grupos anteriores demonstraram resultados interessantes usando protocolos semelhantes aos aqui descritos 18 . Como as culturas duram por semanas ou meses e as mesmas culturas podem ser reutilizadas, esta técnicaPara várias experiências ao longo do tempo na mesma rede. No entanto, existem limitações a esta técnica. Os MEAs não são invasivos. Portanto, eles só podem registrar atividade extracelular, em oposição ao patch-clamping ou gravação intracelular com pipetas. Além disso, uma vez que cada eléctrodo numa matriz é coberto por várias células, não é possível resolver a actividade de um único neurónio. Por outro lado, por serem culturas in vitro , não conseguem reproduzir integralmente as propriedades estruturais das redes no cérebro. Também, a actividade só pode ser registada durante menos de 30 min de cada vez sem algum mecanismo proporcionando uma atmosfera de CO 2 para as células manterem o seu equilíbrio de pH. Uma vez que esta técnica é dominada, manipulações farmacológicas com ou sem estimulação elétrica podem ser exploradas. Novos protocolos para sondar a aprendizagem ea formação de memória em redes neuronais também podem ser projetados e testados, juntamente com pRotocolos para redes do hipocampo ou da medula espinhal. Protocolos para estimulação e treinamento de redes foram publicados anteriormente, e alguns deles foram desenvolvidos em protocolos in vivo , como a &quot;adaptação seletiva&quot; proposta por Eytan et al. 19 . Vários protocolos foram testados. No entanto, apenas os resultados de uma modificação do procedimento de tétano proposto por Ruaro em 2005 são apresentados aqui 14 , 20 .

Micro-eletrodo arrays (MEAs) pode ser usado para investigar toxicidade de drogas, paradigmas de design para a próxima geração de medicina personalizada, e estudar dinâmica de rede em culturas neuronais 1 . Em contraste com métodos mais tradicionais - como o patch-clamping, que só pode registrar a atividade de uma única célula, ou gravação de campo com uma pipeta de vidro, que pode registrar respostas extracelulares dos neurônios que cercam o eletrodo em um único local - MEAs pode simultaneamente Registro de vários locais em uma cultura de células sem exigir a árdua tarefa de colocar cada eletrodo individualmente. Isso permite o estudo das interações dinâmicas entre grupos de células que formam uma rede dentro dessa cultura. Além disso, os efeitos da estimulação elétrica em padrões de disparo de rede 2 , 3 , 4 , 5 e controle de rede 6 &lt;/ Sup&gt; em culturas neuronais têm sido bem documentadas, e numerosas configurações de estimulação elétrica e controles podem ser facilmente aplicados dentro da mesma configuração experimental, permitindo uma ampla gama de dinâmicas espaço-temporais a serem exploradas. Uma das principais dinâmicas de interesse nesses estudos in vitro foi a extensão em que as redes cultivadas exibem propriedades indicativas de aprendizagem 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . O Laboratório Peixoto examinou previamente os efeitos dos sinais de treino de alta frequência, tal como descrito em Ruaro et al. 14 , em redes de neurônios de camundongos banhados em matrizes de microeletrodos 15 . Nestas experiências, as redes apresentaram um aumento na respostaG induzido por estimulação elétrica. A resposta aumentada foi considerada uma forma de aprendizagem através do reconhecimento de estímulo, pelo que as redes responderam de forma consistente a uma mudança no estímulo após a aplicação de um protocolo específico de estimulação ( ie, treinamento). Este protocolo demonstra como cultivar células neuronais em MEAs, registrar com sucesso mais de 95% dos pratos banhados, estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação, classificar atividade de unidade única, plotar histogramas e interpretar os resultados de Experiências. O uso de um sistema proprietário (veja a Tabela de Materiais ) para a estimulação e registro de culturas neuronais é demonstrado, bem como a aplicação de pacotes de software (veja a Tabela de Materiais ) para classificar unidades neuronais . Uma interface gráfica personalizada (veja a Tabela de Materiais ) é usada para visualizar asTempo timulus histogramas, inter-burst intervalos, e burst duração, bem como para comparar a resposta celular para a estimulação antes e após um protocolo de treinamento.

<table><tbody><tr><td>Ácido ascórbico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4403</td><td>Faça alíquotas de 4 mg / mL</td></tr><tr><td>B-27</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Suplemento sem soro para cultura de células neurais. Faça alíquotas de 1 mL e congele</td></tr><tr><td>Copos - vidro - 100 mL</td><td>VWR</td><td>13912-160</td><td></td></tr><tr><td>Copos - vidro - 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-956</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de polegar com ponta romba</td><td>World Precision Instruments</td><td>500365-G</td><td></td></tr><tr><td>Frasco criogênico - estéril, 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-26</td><td></td></tr><tr><td>Frasco criogênico - estéril, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-500-27</td><td></td></tr><tr><td>DMEM com Glutamax</td><td>Gibco Life Technology</td><td>10569-010</td><td>Meio de cultura celular que contém uma forma estabilizada de L-glutamina</td></tr><tr><td>DNase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003172</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2030</td><td></td></tr><tr><td>Pinça</td> <td>de polegar de ponta finaWorld Precision Instruments</td><td>501324-G</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de Vidro</td><td>VWR</td><td>14673-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX -- I (100X)</td><td>Gibco Life Technology</td><td>35050-061</td><td>Uma forma estabilizada de L-glutamina usada como um chip de</td></tr><tr><td>hemocitômetro</td> suplementar <td>Fisher Scientific</td><td>22-600-101</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate EB completo</td><td>BrainBits</td><td>D00118</td><td>Ambiente CO2</supMídia de armazenamento de células ></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12195H</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma Amplificador</td> de filtro MCS Aldrich <td>L2020-1MG</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sistema Multicanal Sistema Multicanal</td><td>FA60SBC</td><td></td></tr><tr><td>MCS headstage/pré-amplificador</td><td>Sistema Multicanal</td><td>MEA1060-INV</td><td></td></tr><tr><td>MCS matriz de microeletrodos</td><td>Sistema Multicanal</td><td>60MEA200/ Fonte de alimentação 10iR-ITO</td><td></td></tr><tr><td>MCS Sistema</td><td>multicanal</td><td>PS20W</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de sinal MCS</td><td>Sistema multicanal</td><td>SDMEA</td><td></td></tr><tr><td>Gerador de estímulo MCS</td><td>Sistema multicanal</td><td>STG4002</td><td></td></tr><tr><td>controlador de temperatura MCS</td><td>Sistema multicanal</td><td>TC02</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de armazenamento de mídia - vidro 500 mL</td><td>VWR</td><td>10754-818</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de autoclave - 0,4 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3485</td> Tubos de microcentrífuga <td>de autoclave</td></tr><tr><td>- 2 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>3434ECONO</td><td></td></tr><tr><td>Pontas de micropipeta de autoclave - 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>37001-166</td><td>Autoclave</td></tr><tr><td>Micropipetas Pontas - 1.000 &mu; L&nbsp;</td><td>VWR</td><td>13503-464</td> Pontas de micropipeta <td>de autoclave</td></tr><tr><td>- 200 &mu; L&nbsp;</td>Micropipetador <td>de Autoclave</td> <td>VWR</td><td>37001-596</td></tr><tr><td>- 10 &mu; L&nbsp;</td><td>Micropipetter Thermo Fisher</td><td>4641170N</td><td></td></tr><tr><td>- 1,000 &mu; L&nbsp;</td><td>Micropipetter Thermo Fisher</td><td>4641210N</td><td></td></tr><tr><td>- 200 &mu; L&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>4641230N</td><td></td></tr><tr><td>Papaína - 0.22 Filtrada</td><td>Worthington Bioquímica</td><td>LK003178</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (Estreptococo de Caneta)</td>Placas <td>de Petri 15070063</td><td></td> <td>Thermo Fisher</td></tr><tr><td>-100 mm descartáveis</td><td>Placas de Petri Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>-Placas de Petri de vidro de 100 mm</td><td>VWR</td><td>10754-788</td><td></td></tr><tr><td>-35 mm&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100A</td><td></td></tr><tr><td>Tampão fosfato salino (PBS) (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Limpeza de Plasma</td><td>Plasma Etch, Inc.</td><td>PE-50</td><td></td></tr><tr><td>Bromidrato de poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico (centrífugo) de polietileno -15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico (centrífuga) de polipropileno -50 mL</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Máscaras de procedimento</td><td>Imco</td><td>1530-imc</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4562-5G</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de bisturi</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; Tesoura 500237-G</td><td></td></tr><tr><td>- íris</td><td>World Precision Instruments</td><td>14111-G</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura - grande</td><td>Tesoura World Precision Instruments</td><td>14214</td><td></td></tr><tr><td>- pequena cirúrgica</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 501733-G</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica - estéril, 1 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-892</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serológica - estéril, 2 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica - estéril, 25 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-900</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica - estéril, 50 mL&nbsp;</td><td>VWR</td><td>89130-902</td><td></td></tr><tr><td>Software: Matlab GUI</td><td>Peixoto Lab</td><td>npeixoto@gmu.edu</td><td>Usado para analisar arquivos .mat.&nbsp; Disponível gratuitamente mediante solicitação.&nbsp; Entre em contato npeixoto@gmu.edu para solicitar uma cópia.</td></tr><tr><td>Software: MCS MC_Rack</td><td>Sistema Multicanal</td><td>N/A</td><td>Usado para aquisição de dados</td></tr><tr><td>Software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/neuroexplorer</td><td>Usado para converter arquivos .nex para .mat</td></tr><tr><td>Software: Classificador Offline</td><td>Plexon&nbsp;</td><td>http://www.plexon.com/products/offline-sorter</td><td>Usado para classificar picos neurais e converter arquivos de dados para .plx e depois para .nex</td></tr><tr><td>Manual do Software: MCS MC_Rack</td><td>Sistema</td><td></td> Multicanal <td>https://www.multichannelsystems.com/sites/multichannelsystems.com/files/documents/manuals/MC_Rack_Manual.pdf</td></tr><tr><td>Manual do Software: NeuroExplorer</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>https://www.neuroexplorer.com/downloads/Nex3Manual.pdf</td></tr><tr><td>Manual do Software: Classificador Offline</td><td>Plexon&nbsp;</td><td></td><td>www.plexon.com/system/files/downloads/Offline%20Sorter%20v2.8%20Manual.pdf</td></tr><tr><td>Espátula - pequena de duas pontas</td><td>World Precision Instruments</td><td>&nbsp; 503440</td><td></td></tr><tr><td>Stericup 0.22 &micro; m - 250 mL</td><td>Pipeta de transferência de SCGVU02RE</td><td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td>- grande diâmetro&nbsp;</td><td>Pipeta de transferência Thermo Fisher</td><td>335-1S</td><td></td></tr><tr><td>- pequeno furo&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>242-1S</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Papel de filtro Whatman</td><td></td><td>1442 150</td><td>Corte em 8 fatias de torta e autoclave em uma placa de Petri de vidro</td></tr></tbody></table>

aumento time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-eletrodo arrays (MEAs) pode ser usado para investigar toxicidade de drogas, paradigmas de design para a próxima geração de medicina personalizada, e estudar dinâmica de rede em culturas neuronais. Em contraste com os métodos mais tradicionais, como o patch-clamping, que só pode registrar a atividade de uma única célula, os MEAs podem gravar simultaneamente a partir de múltiplos sites em uma rede, sem exigir a árdua tarefa de colocar cada eletrodo individualmente. Além disso, numerosas configurações de controle e estimulação podem ser facilmente aplicadas dentro da mesma configuração experimental, permitindo uma ampla gama de dinâmicas a serem exploradas. Uma das principais dinâmicas de interesse nestes estudos in vitro foi a extensão em que as redes cultivadas exibem propriedades indicativas de aprendizagem. Células neuronais de rato cultivadas em MEAs exibem um aumento na resposta após o treino induzido por estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar células neuronais em MEAs; Com sucessoMais de 95% dos pratos banhados; Estabelecer um protocolo para capacitar as redes a responder aos padrões de estimulação; E classificar, plotar e interpretar os resultados de tais experimentos. O uso de um sistema proprietário para estimular e registrar culturas neuronais é demonstrado. Pacotes de software também são usados ​​para classificar unidades neuronais. Uma interface de usuário gráfica personalizada é usada para visualizar histogramas de tempo pós-estímulo, intervalos entre rajadas e duração de rajada, assim como comparar a resposta celular à estimulação antes e depois de um protocolo de treinamento. Finalmente, são discutidos os resultados representativos e as direções futuras deste esforço de pesquisa.

Células neuronais de rato cultivadas em matrizes de múltiplos eléctrodos apresentam um aumento na resposta após estimulação eléctrica. Este protocolo demonstra como cultivar neurônios, como registrar a atividade, e como estabelecer um protocolo para treinar as redes para responder a padrões de estimulação.

Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar e associar tecido neuronal de camundongo E17, com a finalidade de cultivar, registrar e estimular redes neuronais em matrizes de microeletrodos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no estudo da dinâmica de redes, relacionadas aos mecanismos básicos de aprendizado e memória. A principal vantagem desta técnica é que as matrizes de microeletrodos são capazes de registrar sinais em múltiplos sítios simultaneamente e, portanto, podem fornecer melhor resolução espacial e temporal, em comparação com o registro tradicional em único sítio por meio de pipetas de vidro.Embora este método possa fornecer informações sobre a dinâmica em rede da aprendizagem e da memória, ele também pode ser usado para investigar a toxicidade de fármacos ou projetar paradigmas para medicina personalizada de nova geração. A demonstração visual deste processo é essencial, pois a manipulação do tecido durante o processo de dissecção e dissociação é difícil de aprender apenas com a leitura de protocolos. Para preparar o arranjo, adicione de 40 a 50 microlitros de laminina descongelada ao centro de cada MEA e 0,2 mililitros de laminina às placas controle, utilizando ponteiras estéreis.Cubra todas as MEAs e as placas-controle na câmara de fluxo laminar e transfira-as para uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, remova cuidadosamente o excesso de laminina do centro das MEAs utilizando sucção com pipetas Pasteur estéreis e deixe a superfície secar ao ar antes do plaqueamento. Em seguida, despeje o meio L-15 em quatro placas de Petri de 100 milímetros, cubra-as e coloque-as em um congelador a menos 20 graus Celsius por cerca de 40 a 60 minutos, até que o meio atinja uma consistência semelhante à de uma pasta, mas sem congelar completamente.Para se preparar para a dissecação, coloque uma placa de Petri de vidro virada para baixo em uma bandeja cheia de gelo. Agora, pulverize o abdômen inferior do animal com etanol 70%. Usando tesoura cirúrgica pequena, faça um corte em forma de V através da pele e da gordura subcutânea do abdômen inferior, estendendo o corte até as extremidades distais da cavidade torácica, expondo o útero.Usando pin&ccedil;as, levante cuidadosamente o &uacute;tero entre os embri&otilde;es. Corte o tecido conjuntivo com tesoura de disseca&ccedil;&atilde;o at&eacute; que todo o &uacute;tero esteja livre. Em seguida, enxague brevemente o &uacute;tero com etanol 70% para remover qualquer sangue e coloque-o em um dos quatro recipientes de Petri contendo L-15 frio.Posteriormente, libere cada embrião do útero e do saco embrionário interno, utilizando dois pares de pinças de ponta fina. Coloque os embriões liberados no segundo recipiente cheio de L-15 frio, depois transfira as cabeças para o terceiro recipiente de Petri e os corpos para o quarto. Na cabine de biossegurança, coloque uma fatia de papel de filtro autoclavado sobre a platina de vidro resfriada do recipiente de Petri e posicione uma cabeça de embrião sobre o papel de filtro.A seguir, posicione a borda de corte da lâmina inferior da tesoura de íris na base do crânio, mantendo a lâmina inferior contra a superfície interna do crânio e afastada do cérebro; corte através da placa occipital e depois ao longo da linha média entre as placas parietais. Continue cortando rostralmente entre as placas cranianas frontais cartilaginosas. Em seguida, começando no centro da placa occipital, faça um corte perpendicular para a esquerda e para a direita do corte central.Em seguida, deslize cuidadosamente uma espátula pequena entre a superfície ventral do cérebro e as placas ósseas inferiores do crânio, até que fique completamente sob o cérebro. Em seguida, levante a espátula para remover o cérebro. Usando uma espátula limpa, remova primeiro o bulbo olfatório e depois dissecione o lobo frontal em um padrão trapezoidal.Em seguida, transfira o tecido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo meio de armazenamento. Neste procedimento, utilize duas lâminas de bisturi estéreis para picar o tecido. Em seguida, adicione 2,5 mililitros da mistura de DNAse e papaína ao tecido picado na placa de Petri.Agite suavemente a placa de Petri para garantir que todo o tecido esteja livre na solução e não aderido ao fundo da placa. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 15 minutos. Na câmara de fluxo laminar, use uma pipeta de transferência estéril de grande diâmetro para transferir todo o meio e tecido para um tubo criogênico estéril de cinco mililitros.Coloque a ponta da mesma pipeta de transferência próximo ao fundo do tubo e pipete suavemente a mistura de 10 a 15 vezes. Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM 5/5 aquecido à mistura de células dissociadas e tampe o tubo de centrífuga. Misture suavemente por inversão e centrifugue a 573 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.No biohood, descarte todo o sobrenadante sem romper o pellet. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM 5/5 aquecido ao pellet no tubo para ressuspender as células. Use uma pipeta estéril de pequeno orifício para desagregar o pellet, pipetando suavemente para cima e para baixo até que a mistura fique homogênea.Em seguida, transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Fora da cabine de segurança biológica, adicione 10 microlitros de azul de tripano aos 10 microlitros de suspensão celular no tubo de microcentrífuga. Em seguida, carregue 10 microlitros da suspensão celular com azul de tripano em uma lâmina descartável de hemocitômetro para contagem das células.No interior da câmara de segurança, use uma micropipeta estéril para transferir 50 microlitros de suspensão celular para o centro de cada matriz e de cada placa de Petri controle. Em seguida, coloque as placas de Petri tampadas em um incubador ajustado a 37 graus Celsius por três a quatro horas. A seguir, adicione cuidadosamente um mililitro de DMEM 5/5 aquecido a cada MEA.Adicione cuidadosamente o meio, uma gota por vez, ao longo das bordas internas da MEA, evitando lavar as células para longe do centro da matriz. Em seguida, coloque uma tampa contendo uma membrana FEP permeável a gases sobre cada MEA antes de devolvê-las ao incubador. Após dois dias, realize uma troca completa do meio com DMEM+ aquecido, removendo o meio do recipiente.Coloque cuidadosamente a ponta da pipeta na parede interna e dispense um mililitro de DMEM+ aquecido. Para as alimentações subsequentes, retire 500 microlitros de meio da placa e dispense 500 microlitros de DMEM+ aquecido novamente. Neste procedimento, examine as amostras da placa a cada dois dias sob microscópio, para verificar a cobertura celular sobre a matriz e contaminação por bactérias ou fungos. Antes de retirar as culturas do incubador, conecte o controlador de temperatura e ligue o sistema, permitindo que a base aquecida do pré-amplificador atinja 35 graus Celsius.Em seguida, coloque o cultivo tampado no pré-amplificador, de modo que a linha preta no poço MEA esteja alinhada com o terra de referência. Certifique-se de que os pinos do pré-amplificador estejam alinhados para que a parte superior do pré-amplificador fique fixada, e a tampa do cultivo permaneça colocada. Depois, pressione iniciar no ambiente de software para começar a visualizar os sinais.Na janela principal, selecione Spikes, Detection, Automatic, altere o valor do desvio padrão para menos cinco e clique em Refresh para redefinir o limiar. Após visualizar os sinais, clique em Stop, Record e Play para iniciar a gravação da atividade. Neurônios de camundongo embrionários são cultivados em MEAs de 60 canais, que permitem a gravação simultânea da atividade neuronal em toda a rede a partir de cada eletrodo.Aqui está um exemplo de gráfico de raster de atividade proveniente de oito eletrodos em resposta à estimulação antes e após o treinamento. A linha vermelha vertical indica o momento do estímulo, e as marcas pretas indicam potenciais de ação. Antes do treinamento, há uma resposta imediata ao pulso de estímulo em todos os canais.No pós-treinamento, a rede exibe uma resposta de atividade mais prolongada, bem como a resposta imediata à estimulação. Aqui é mostrada a média de 12 redes treinadas e 10 redes controle; as redes treinadas indicam frequências de disparos significativamente alteradas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e associar tecido neuronal de camundongos embrionários, além de ser capaz de cultivar, registrar e estimular redes neuronais a partir de matrizes de microeletrodos.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Este protocolo fornece as informações necessárias para a criação, cuidando, e gravação de estimular eletricamente as culturas na AAM.

Como gravar, Cultura e estimular redes neuronais em Micro-Arrays eletrodo (MEA)

A forma robusta para estudar avalanches neuronal, ou seja, escala-invariante rajadas espaço-temporal atividade, indicativo da dinâmica do estado crítico no córtex. Avalanches surgem espontaneamente no desenvolvimento de camadas superficiais do córtex cultura que permite medições a longo prazo da atividade com arrays planar integrada multi-eletrodo (MEA), sob condições estritamente controladas.

Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

O vídeo demonstra como usar um arranjo de microeletrodos (MEA) para registrar a atividade eletrofisiológica de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs). A atividade eletrofisiológica de um MEA multipoço contendo uma co-cultura neurônio-astrócitos é registrada para detectar potenciais de ação de vários neurônios na rede, confirmando a diferenciação bem-sucedida de hiPSCs em neurônios.

Medindo a atividade eletrofisiológica de redes neuronais usando matrizes de microeletrodos

Este vídeo demonstra o procedimento de uso da matriz de multieletrodos (MEA) para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D. Este método permite entender a dinâmica da rede neural e a atividade de explosão da rede sináptica dentro das esferas 3D.

Utilizando matrizes de multieletrodos para medir a fisiologia sináptica em esferas de cocultura 3D

Neste trabalho, um novo modelo experimental no qual culturas neuronais 3D são acopladas a matrizes planares de microeletrodos (MEAs) é presented. 3D redes são construídas semeando neurônios em um andaime composto de microesferas de vidro nas quais os neurônios crescem e formam estruturas 3D interconectadas.

Interface 3D Engineered culturas neuronais para Micro-Arrays eletrodo: An Innovative<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo Experimental

Apresentamos um protocolo para cultivar explantes primários de neurônios do gânglio espiral murino em matrizes de múltiplos eletrodos para estudar perfis de resposta neuronal e otimizar parâmetros de estimulação. Tais estudos visam melhorar a interface neurônio-eletrodo do implante coclear para beneficiar a audição dos pacientes, bem como o consumo de energia do dispositivo.

Do gânglio espiral Neuron Explant Cultura e Eletrofisiologia em multi-eléctrodos Arrays

Exposição a toxinas ambientais aguda pode afetar o desenvolvimento de embriões. Endócrinos produtos químicos tais como bisfenóis são conhecidos por afetar o sistema nervoso. Aqui descrevemos um protocolo utilizando um modelo de rede neuronal in vitro vertebrado (embrião do pintinho) para estudar o impacto funcional de exposição toxina em embriões adiantados.

Avaliação dos efeitos endócrinos compostos no desenvolvimento da função de vertebrados Rede Neural utilizando eletrodos multi matrizes

Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.

Microfluídica interfaceamento com matrizes de microeletrodos para estudar comunicação Neuronal e propagação de sinal Axonal

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

A impressão 3D em escala micrométrica permite a prototipagem rápida de dispositivos poliméricos para culturas de células neuronais. Como prova de princípio, as conexões estruturais entre os neurônios foram restringidas pela criação de barreiras e canais que influenciam o crescimento dos neuritos, enquanto as consequências funcionais de tal manipulação foram observadas pela eletrofisiologia extracelular.

Polimerização de dois fótons Impressão 3D de dispositivos de cultura de células neuronais em microescala

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Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

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Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

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