Aumento Time-dependente na resposta da rede à estimulação de culturas de pilha neuronais em matrizes do micro-elétrodo

O objetivo geral deste procedimento é isolar e associar tecido neuronal de camundongo E17, com a finalidade de cultivar, registrar e estimular redes neuronais em matrizes de microeletrodos. Este método pode ajudar a responder questões fundamentais no estudo da dinâmica de redes, relacionadas aos mecanismos básicos de aprendizado e memória. A principal vantagem desta técnica é que as matrizes de microeletrodos são capazes de registrar sinais em múltiplos sítios simultaneamente e, portanto, podem fornecer melhor resolução espacial e temporal, em comparação com o registro tradicional em único sítio por meio de pipetas de vidro.

Embora este método possa fornecer informações sobre a dinâmica em rede da aprendizagem e da memória, ele também pode ser usado para investigar a toxicidade de fármacos ou projetar paradigmas para medicina personalizada de nova geração. A demonstração visual deste processo é essencial, pois a manipulação do tecido durante o processo de dissecção e dissociação é difícil de aprender apenas com a leitura de protocolos. Para preparar o arranjo, adicione de 40 a 50 microlitros de laminina descongelada ao centro de cada MEA e 0,2 mililitros de laminina às placas controle, utilizando ponteiras estéreis.

Cubra todas as MEAs e as placas-controle na câmara de fluxo laminar e transfira-as para uma incubadora a 37 graus Celsius por uma hora. Após uma hora, remova cuidadosamente o excesso de laminina do centro das MEAs utilizando sucção com pipetas Pasteur estéreis e deixe a superfície secar ao ar antes do plaqueamento. Em seguida, despeje o meio L-15 em quatro placas de Petri de 100 milímetros, cubra-as e coloque-as em um congelador a menos 20 graus Celsius por cerca de 40 a 60 minutos, até que o meio atinja uma consistência semelhante à de uma pasta, mas sem congelar completamente.

Para se preparar para a dissecação, coloque uma placa de Petri de vidro virada para baixo em uma bandeja cheia de gelo. Agora, pulverize o abdômen inferior do animal com etanol 70%. Usando tesoura cirúrgica pequena, faça um corte em forma de V através da pele e da gordura subcutânea do abdômen inferior, estendendo o corte até as extremidades distais da cavidade torácica, expondo o útero.

Usando pinças, levante cuidadosamente o útero entre os embriões. Corte o tecido conjuntivo com tesoura de dissecação até que todo o útero esteja livre. Em seguida, enxague brevemente o útero com etanol 70% para remover qualquer sangue e coloque-o em um dos quatro recipientes de Petri contendo L-15 frio.

Posteriormente, libere cada embrião do útero e do saco embrionário interno, utilizando dois pares de pinças de ponta fina. Coloque os embriões liberados no segundo recipiente cheio de L-15 frio, depois transfira as cabeças para o terceiro recipiente de Petri e os corpos para o quarto. Na cabine de biossegurança, coloque uma fatia de papel de filtro autoclavado sobre a platina de vidro resfriada do recipiente de Petri e posicione uma cabeça de embrião sobre o papel de filtro.

A seguir, posicione a borda de corte da lâmina inferior da tesoura de íris na base do crânio, mantendo a lâmina inferior contra a superfície interna do crânio e afastada do cérebro; corte através da placa occipital e depois ao longo da linha média entre as placas parietais. Continue cortando rostralmente entre as placas cranianas frontais cartilaginosas. Em seguida, começando no centro da placa occipital, faça um corte perpendicular para a esquerda e para a direita do corte central.

Em seguida, deslize cuidadosamente uma espátula pequena entre a superfície ventral do cérebro e as placas ósseas inferiores do crânio, até que fique completamente sob o cérebro. Em seguida, levante a espátula para remover o cérebro. Usando uma espátula limpa, remova primeiro o bulbo olfatório e depois dissecione o lobo frontal em um padrão trapezoidal.

Em seguida, transfira o tecido para um tubo cônico de 15 mililitros contendo meio de armazenamento. Neste procedimento, utilize duas lâminas de bisturi estéreis para picar o tecido. Em seguida, adicione 2,5 mililitros da mistura de DNAse e papaína ao tecido picado na placa de Petri.

Agite suavemente a placa de Petri para garantir que todo o tecido esteja livre na solução e não aderido ao fundo da placa. Em seguida, coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius por 15 minutos. Na câmara de fluxo laminar, use uma pipeta de transferência estéril de grande diâmetro para transferir todo o meio e tecido para um tubo criogênico estéril de cinco mililitros.

Coloque a ponta da mesma pipeta de transferência próximo ao fundo do tubo e pipete suavemente a mistura de 10 a 15 vezes. Em seguida, adicione dois mililitros de DMEM 5/5 aquecido à mistura de células dissociadas e tampe o tubo de centrífuga. Misture suavemente por inversão e centrifugue a 573 × g durante cinco minutos à temperatura ambiente.

No biohood, descarte todo o sobrenadante sem romper o pellet. Em seguida, adicione um mililitro de DMEM 5/5 aquecido ao pellet no tubo para ressuspender as células. Use uma pipeta estéril de pequeno orifício para desagregar o pellet, pipetando suavemente para cima e para baixo até que a mistura fique homogênea.

Em seguida, transfira 10 microlitros da suspensão celular para um tubo de microcentrífuga. Fora da cabine de segurança biológica, adicione 10 microlitros de azul de tripano aos 10 microlitros de suspensão celular no tubo de microcentrífuga. Em seguida, carregue 10 microlitros da suspensão celular com azul de tripano em uma lâmina descartável de hemocitômetro para contagem das células.

No interior da câmara de segurança, use uma micropipeta estéril para transferir 50 microlitros de suspensão celular para o centro de cada matriz e de cada placa de Petri controle. Em seguida, coloque as placas de Petri tampadas em um incubador ajustado a 37 graus Celsius por três a quatro horas. A seguir, adicione cuidadosamente um mililitro de DMEM 5/5 aquecido a cada MEA.

Adicione cuidadosamente o meio, uma gota por vez, ao longo das bordas internas da MEA, evitando lavar as células para longe do centro da matriz. Em seguida, coloque uma tampa contendo uma membrana FEP permeável a gases sobre cada MEA antes de devolvê-las ao incubador. Após dois dias, realize uma troca completa do meio com DMEM+ aquecido, removendo o meio do recipiente.

Coloque cuidadosamente a ponta da pipeta na parede interna e dispense um mililitro de DMEM+ aquecido. Para as alimentações subsequentes, retire 500 microlitros de meio da placa e dispense 500 microlitros de DMEM+ aquecido novamente. Neste procedimento, examine as amostras da placa a cada dois dias sob microscópio, para verificar a cobertura celular sobre a matriz e contaminação por bactérias ou fungos. Antes de retirar as culturas do incubador, conecte o controlador de temperatura e ligue o sistema, permitindo que a base aquecida do pré-amplificador atinja 35 graus Celsius.

Em seguida, coloque o cultivo tampado no pré-amplificador, de modo que a linha preta no poço MEA esteja alinhada com o terra de referência. Certifique-se de que os pinos do pré-amplificador estejam alinhados para que a parte superior do pré-amplificador fique fixada, e a tampa do cultivo permaneça colocada. Depois, pressione iniciar no ambiente de software para começar a visualizar os sinais.

Na janela principal, selecione Spikes, Detection, Automatic, altere o valor do desvio padrão para menos cinco e clique em Refresh para redefinir o limiar. Após visualizar os sinais, clique em Stop, Record e Play para iniciar a gravação da atividade. Neurônios de camundongo embrionários são cultivados em MEAs de 60 canais, que permitem a gravação simultânea da atividade neuronal em toda a rede a partir de cada eletrodo.

Aqui está um exemplo de gráfico de raster de atividade proveniente de oito eletrodos em resposta à estimulação antes e após o treinamento. A linha vermelha vertical indica o momento do estímulo, e as marcas pretas indicam potenciais de ação. Antes do treinamento, há uma resposta imediata ao pulso de estímulo em todos os canais.

No pós-treinamento, a rede exibe uma resposta de atividade mais prolongada, bem como a resposta imediata à estimulação. Aqui é mostrada a média de 12 redes treinadas e 10 redes controle; as redes treinadas indicam frequências de disparos significativamente alteradas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como isolar e associar tecido neuronal de camundongos embrionários, além de ser capaz de cultivar, registrar e estimular redes neuronais a partir de matrizes de microeletrodos.