Eletroencefalografia simultânea, em tempo real de medição da concentração de lactato e Manipulação optogenética da atividade neuronal do córtex cerebral de roedores

O objetivo geral deste procedimento é medir a concentração de sono e lactato definida por EEG durante a estimulação optogenética em coordenadas estereotáxicas precisas. Implante cirurgicamente os eletroeletrodos e cânulas eletroencefalográficos necessários para um sensor de lactato e cabo de fibra óptica. Em seguida, insira o cabo de fibra óptica e o sensor de lactato pré-calibrado em suas cânulas guia no crânio do animal.

Em seguida, ajuste a intensidade do estímulo de luz azul para obter a resposta eletrofisiológica desejada. Em seguida, proceda à coleta dos dados eletroencefalográficos, eletromiográficos e de concentração de lactato enquanto o animal pode se comportar espontaneamente e/ou dormir. Em comparação com outros métodos, como estudos farmacológicos do EEG, essa abordagem experimental tem a vantagem de monitorar a bioquímica e a eletrofisiologia do cérebro, enquanto a atividade dos neurônios é manipulada em tempo real em uma escala de tempo inferior a um segundo.

Portanto, o potencial para produzir novos insights para o campo de pesquisa do sono é alto. Por exemplo, pode-se identificar concomitantes metabólicos e eletrofisiológicos do sono de ondas lentas. Esse tipo de experimento também pode ser aplicado em outras áreas da neurociência, como aprendizado e memória, plasticidade sináptica ou distúrbios convulsivos.

A técnica cirúrgica é tecnicamente desafiadora. Requer uma boa dose de destreza, mas isso pode ser alcançado através da prática. Nesta demonstração visual, vou iterar as etapas críticas de alguns procedimentos cirúrgicos complicados que complementarão a descrição escrita.

Depois que um animal se recupera da cirurgia, o desafio é inserir corretamente o sensor de lactato e o cabo de fibra óptica. Jonathan e eu demonstraremos como usar uma mão firme ao conter o animal para inserir esses dois delicados equipamentos. Por fim, mostraremos como otimizar a resposta do EEG ajustando a intensidade do estímulo em tempo real.

Para este experimento, use camundongos transgênicos que expressam o canal catiônico sensível à luz azul. O canal adota em dois neurônios corticais cerebrais. Primeiro anestesiar o camundongo usando 5% de flúor e 95% de oxigênio para indução, mantendo a anestesia com 3% de flúor e 97% de oxigênio.

Faça uma incisão medial na parte superior do crânio, entre os olhos e a parte de trás do crânio. Limpe o crânio com água oxigenada e soro fisiológico estéril. Localize e marque B e Lambda para determinar as coordenadas estereotáxicas para configurações de estímulo optogenético do eletrodo, faça os orifícios dos parafusos com uma broca odontológica de alta velocidade com uma broca esférica de 0,5 milímetro seguida por uma broca esférica de 0,7 milímetro.

Insira os parafusos kelo gram do eletrodo nos orifícios com uma chave de fenda manual. Dirija-os em aproximadamente quatro a cinco revoluções para obter a profundidade desejada. Segure as cânulas-guia no lugar com uma cânula estereotáxica e, em seguida, fixe-as no crânio e nas âncoras com cimento acrílico Para manter a permeabilidade, cada cânula-guia deve conter uma cânula ou estilete fictício desde o momento da cirurgia até o momento da experimentação.

Uma vez que os EEGs e as cânulas guia estejam posicionados no crânio, cole-os com uma fina camada de cimento acrílico dentário. Após os endurecimentos de cimento, posicione o conector de plástico acima do monte de cimento seco vendido nas extremidades dos fios que emanam do EEG leva aos contatos no conector de plástico, caso o fio conduza ao cimento. Em seguida, passe os fios do eletromiograma através dos músculos do núcleo, deslizando-os para dentro do cano de uma agulha de calibre 21.

Perfurado através do músculo amarrar um nó duplo do cirurgião, uma sutura de náilon de cinco zero ao redor desses fios, apenas distal de onde eles saem, a sutura muscular de volta a juntar a pele que foi retraída para acessar o tecido muscular com nós de cirurgião interrompidos únicos usando uma sutura de corte reverso P, três agulhas e cinco zero de náilon. Uma vez que a unidade de estímulo mc é programada, execute-a como um gerador de sinal autônomo como um sinal binário liga-desliga de cinco volts. Conecte a unidade de estímulo mc à unidade de potência habilitada para TTL do laser com conectores BNC.

Conecte a unidade de alimentação do laser ao laser por meio de um cabo de fita. Conecte também o laser ao conector FC macho no cabo de remendo de fibra óptica de origem. Conecte o cabo de fibra óptica de origem à junta rotativa.

Comutador A junta rotativa de fibra óptica serve como comutador. À medida que o animal se move em torno de sua gaiola, a junta rotativa gira para evitar a quebra dos cabos de fibra óptica devido ao torque rotacional. Com braçadeiras de plástico, fixe o comutador a um suporte de metal colocado acima da gaiola cilíndrica em que o animal está alojado.

Contenha o mouse usando uma mão para prendê-lo sob a palma da mão em concha. Oriente a cabeça entre o dedo médio e o indicador do experimentador. Agora limpe a cânula guia de detritos, detritos usando uma agulha estéril de calibre 25.

Em seguida, insira o cabo de fibra óptica manualmente e prenda-o à cânula guia de fibra óptica com uma tampa de rosca rosqueada. Controle a profundidade de inserção do cabo de fibra óptica no cérebro por um nó de sutura amarrado no cabo de fibra óptica a uma distância fixa da extremidade plana clivada. O sensor é equiparado em solução salina tamponada com fosfato e exposto a três concentrações de L lactato de forma gradual.

De acordo com os protocolos do fabricante, insira o sensor pré-calibrado na cânula guia de lactato montada no crânio de maneira idêntica ao procedimento de inserção do cabo de fibra óptica. Conecte o sensor de lactato ao pré-amplificador do biossensor pinnacle 8, 400 com conectores bipolares. Em seguida, conecte este pré-amplificador ao conector de oito pinos no suporte de cabeça implantado cirurgicamente.

Antes de coletar dados, use o botão de controle de intensidade do laser para ajustar a intensidade do estímulo optogenético. A amplitude da resposta do EEG varia entre os animais devido a fatores que não foram estudados sistematicamente. Portanto, é necessário ajustar a intensidade do estímulo optogenético e verificar se a resposta do EEG é adequada quando a resposta desejada é alcançada.

Colete dados usando o sistema Pinnacle 8, 400 com a pontuação neuro. Uma interface SEIA classifica os estados de sono por inspeção visual do processo de dados de EEG e EMG. Os dados em épocas de dez segundos como vigília sem movimento rápido dos olhos, sono ou sono de movimento rápido dos olhos com base no EEG e EMG.

Esta configuração de estímulo optogenético do biossensor mostra os eletrodos de EEG implantados cirurgicamente, o sensor de lactato e a cânula para estimulação optogenética. Na ausência de estimulação optogenética, este camundongo foi submetido a sono espontâneo. As transições do estado de vigília enquanto E-E-G-E-M-G e a concentração de lactato cerebral foram monitoradas continuamente vigília e os dois subtipos de sono.

O movimento rápido dos olhos e o movimento não rápido dos olhos são definidos com base no EEG e no EMG. Curiosamente, a corrente do biossensor de lactato aumenta em função do EEG de baixa amplitude e cai em função do EEG de alta amplitude. Ambos os canais do EEG respondem a estímulos optogenéticos fornecidos no córtex frontal.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como implantar cirurgicamente um camundongo para manipulação optogenética simultânea e medição do eletroencefalograma, eletromiograma e concentração de lactato no cérebro. Uma vez dominada, esta técnica cirúrgica pode ser realizada adequadamente em 90 a 120 minutos. Lembre-se de monitorar constantemente a respiração do animal como um medidor da profundidade da anestesia.

Se o animal respirar com menos frequência do que uma vez a cada quatro a cinco segundos, a anestesia pode ser muito profunda. Se o animal respirar com mais frequência do que uma vez a cada dois segundos, a anestesia pode ser muito leve. Lembre-se de tomar as devidas precauções de segurança ao usar o agente anestésico gasoso de flúor.

Garanta ventilação adequada na sala cirúrgica para proteger sua retina do laser usado para estimulação optogenética. Use óculos de proteção ou coloque o animal em um armário à prova de luz. Você vai querer praticar a implantação do biossensor de lactato e do cabo de fibra óptica em um mouse totalmente acordado.

Os camundongos não estão em conformidade com esses procedimentos e devem ser imobilizados. No entanto, a contenção não pode ser tão forte a ponto de ferir o animal ou impedir a respiração.