Automated Quantificação de células hematopoiéticas - Interações de células estromais em imagens histológicas de osso não descalcificadas

O objetivo geral deste procedimento é quantificar as associações entre subconjuntos específicos de células na medula óssea. Isso é realizado primeiramente coletando cortes criostáticos histológicos de tumores de fêmures de camundongos. Na segunda etapa, os cortes são corados para análise por imunofluorescência e são adquiridas imagens confocais.

As imagens são então analisadas digitalmente. Em última análise, as posições dos diferentes tipos celulares podem ser simuladas para calcular as taxas e a frequência de contato entre os tipos específicos de células imunológicas de interesse e seu microambiente. Tivemos inicialmente a ideia deste método ao analisar nichos microambientais para plasmócitos de longa duração na medula óssea, e sentimos a necessidade de um método para quantificar inequivocamente as associações celulares no tecido da medula óssea.

RA Maya demonstrará o procedimento para você realizar a sucção criogênica de ossos femurais de um camundongo adulto. Primeiro, configure a amostra e a temperatura da lâmina de um micrótomo padrão equipado com uma lâmina para tecidos duros em menos 24 graus Celsius. Após uma aclimatação de 15 minutos.

Fixe um fragmento da amostra ao suporte metálico utilizando meio de inclusão criogênico e ajuste a orientação do fragmento conforme necessário. Apare a amostra até que o osso esteja completamente aberto e a medula seja visível. Em seguida, ajuste a espessura de corte para sete micrômetros.

Em seguida, fixe um pedaço de fita adesiva kawamoto com o lado adesivo voltado para cima de um bloco de amostra utilizando uma espátula de madeira revestida com couro macio. Seccione a amostra e, com pinça, vire a fita de modo que a seção fique posicionada no lado superior. Transfira então a fita para uma lâmina de microscopia de vidro.

Fixe a fita na lâmina de vidro com fita adesiva quando a última seção tiver sido coletada. Deixe as amostras secarem por pelo menos 30 minutos e armazene as lâminas a -80 graus Celsius. Duas mulheres analisam as amostras corando as seções crioseccionadas descongeladas de acordo com protocolos comuns de imunofluorescência.

Certifique-se de incluir uma coloração nuclear para visualizar a integridade do tecido. Após as seções terem sido coradas, adicione uma gota de meio de montagem para lâmina a cada amostra, seguida por uma lamínula de vidro número um em um microscópio confocal de varredura a laser. Selecione a objetiva de 20 x e defina um campo de visão de 708,15 por 708,15 micrômetros.

Em seguida, adquira as amostras uma por vez com resolução de 2048 por 2048 pixels por imagem para manter os resultados comparáveis. Grave as imagens em um canal para visualização das estruturas estromais, um canal para os núcleos e canais adicionais para as células hematopoéticas de interesse, conforme necessário. Registre as imagens utilizando média de linhas.

Capturando idealmente imagens únicas adjacentes para cobrir toda a seção femoral. Em seguida, salve as imagens em um formato de arquivo de imagem microscópica. Depois, exporte um arquivo JPEG por canal para cada área capturada e utilize uma ferramenta de análise de imagem para realizar a quantificação da segmentação de imagem, análise de colocalização e análise de vizinhança antes de executar as simulações da célula aleatória.

Posicionamento nas imagens de medula óssea analisadas para cada imagem a ser simulada. Coloque os seguintes arquivos em uma única pasta: os arquivos CSV individuais fornecidos pela ferramenta de contato celular. Os arquivos JPEG originais do canal DPI e os arquivos JPEG originais do canal estromal para realizar simulações em lote na série de imagens provenientes de uma única amostra femoral, transferindo, neste momento, todos os arquivos JPEG originais e seus respectivos arquivos CSV individuais para outra pasta.

Quando todos os arquivos forem reunidos, inicie a ferramenta de simulação. Em seguida, marque a caixa de seleção carregar dados de imagem automaticamente. Com esta opção marcada, os arquivos CSV correspondentes às imagens analisadas são abertos automaticamente.

Em seguida, insira a tag comum para os arquivos CSV e o número de conjuntos de imagens que devem ser usados para a simulação em modo de lote. Depois, carregue o arquivo J peg gerado a partir do canal S stroma com um nome de arquivo terminando em três para gerar a máscara para o canal DPI. Marque a caixa aplicar máscara e defina o limiar para converter a imagem DPI em uma máscara binária para 10.

Marque as caixas de oito bits e dilatação e defina o grau de dilatação para cinco pixels. Em seguida, marque a caixa de erosão de largura. Depois, insira o valor desejado para o raio de vizinhança usado na análise das imagens simuladas e marque a caixa usar OSU para utilizar o algoritmo OSU na detecção automática das estruturas estromais para as células hematopoéticas.

Simuladas como formas circulares. Meça a distribuição do tamanho celular dos tipos celulares analisados com qualquer software de análise de imagem que inclua funções apropriadas de segmentação de objetos e determine o sigma para todos os tipos hematopoéticos a partir dessas medições. Pode-se determinar o limite de tamanho celular, que é o diâmetro em pixels que descreve o menor objeto ainda reconhecido como célula completa pela ferramenta de análise de imagem.

Em seguida, insira o valor limite do tamanho celular e o valor de sigma em pixels para a simulação da distribuição de tamanho das células vermelhas, verdes e azuis. Depois, na guia células e máscara, marque a caixa excluir para permitir que o programa escolha uma nova posição para uma célula caso ela se sobreponha a pelo menos um pixel dentro de uma área proibida da máscara. Na guia exclusão de células, marque também a caixa evitar sobreposição de células.

Em seguida, insira a distância mínima permitida entre os centros de duas células em pixels. Se a sobreposição for definida pela distância mínima do centro de uma célula ao centro de outra, defina a área máxima de sobreposição como 100%. Depois, configure a ferramenta de simulação para 1000 repetições. Em seguida, marque a caixa de seleção para salvar automaticamente as coordenadas dos objetos simulados para todas as repetições de cada imagem do lote como arquivos quebrados em formato de texto.

Insira também uma tag comum para os arquivos salvos. Por fim, clique em executar simulação e determine as frequências médias de contato e de proximidade dos conjuntos de 1000 imagens simuladas correspondentes a cada imagem registrada. Para isso, divida as contagens médias de contato e de proximidade pelo número de células registradas por imagem e compare as frequências com os resultados da análise automatizada de colocalização da imagem registrada.

Nesta figura, apresenta-se uma análise de localização de eosinófilos, plasmócitos e células B com o microambiente de células estromais utilizando medula óssea quimérica fluorescente. Os arquivos CSV gerados pelas ferramentas de contato celular e proximidade contêm a contagem de células e a área total para cada população celular em pixels, bem como as contagens de contato ou proximidade. Antes de realizar uma simulação do posicionamento aleatório das células, os parâmetros que descrevem a distribuição do tamanho celular como uma distribuição gaussiana precisam ser determinados; nessa simulação, os valores relativos do sigma medidos para as três populações celulares foram mantidos.

Embora os valores Sigma definidos em pixels tenham sido ajustados para corresponder à aparência visual das células registradas, a fim de delimitar as áreas onde as células podem ser posicionadas, uma máscara foi gerada a partir do canal DAPI. Um valor de 10 foi então determinado como o limiar de densidade ótimo para gerar as imagens binárias. A relevância dos contatos entre plasmócitos, eosinófilos ou linfócitos B com as células estromais foi então testada conforme esperado.

Essas análises revelaram taxas de contato significativamente mais altas nas imagens registradas em comparação com a simulação para as células plasmáticas e células B. Em contraste, nenhuma diferença clara foi observada para o contato entre eosinófilos e células estromais. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em qualquer área que exija a análise da estrutura tecidual complexa da medula óssea, como imunologia, hematologia, patologia ou biologia de células-tronco.