Name: Um sistema simplificado para a Avaliação celular Mechanosensing e Durotaxis In Vitro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprenda a preparar substratos de PDMS com rigidez definida para estudar durotaxi celular in vitro. Este método simplificado utiliza microscopia de células vivas para analisar a migração direcionada de células mamíferas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabalho é apoiado pelo NIH R01 GM47607, CA163296 e NSF 1334493 a CET. Agradecemos a membros do laboratório Turner para a leitura crítica do manuscrito. Todos os dados apresentados neste relatório foram reproduzidas com permissão a partir de 2014 11 Wormer et al..

1. Preparação de Durotaxis Chambers <ol><li> Para preparar uma placa de 6 poços de cultura de tecidos, tarar a balança com um tubo cónico de 50 ml. Pesar aproximadamente 10 g de solução de base de PDMS no tubo de 50 ml (a solução é bastante viscosa). </li><li> Para uma 90: 1 substrato (Conformidade de ~ 1 kPa), dividir o peso medido da solução de base de PDMS no tubo por 90 para determinar a quantidade correcta de agente reticulante solução necessário. Adicionar a quantidade calculada da solução de agente reticulante PDMS ao mesmo tubo. Exemplo: 10 g / 90 = 0,11 g. Adicionar 0,11 g da solução de agente de reticulação à solução PDMS base de PDMS. NOTA: A base e do agente reticulante soluções são ambos fornecidos no kit de PDMS. </li><li> Misturar vigorosamente a mistura de base / agente de reticulação de PDMS durante 5 min à temperatura ambiente usando uma pequena espátula. Nesta fase, a mistura conterá um grande número de bolhas de ar. </li><li> Centrifuga-se o substrato de PDMS numa centrífuga de bancada durante 5 minutos a 50 xg à temperatura ambiente para remover a bubbles. Se ainda houver bolhas após a 5 min, centrifugar novamente. </li><li> Pipete 1 mL de 90: 1 PDMS substrato em cada poço de cultura de tecidos de 6 cavidades tratadas placa. As bolhas de ar restantes presentes nos PDMS pode ser eliminado nesta fase por popping-los usando uma agulha 21 G. Permitir que o PDMS para espalhar durante 30 min no poço. </li><li> Ferva 12 milímetros de vidro # 1 lamelas em água destilada por 5 min. Repita duas vezes e armazenar as lamelas em água destilada. </li><li> Coloque um, secou-se a lamela em cada poço da placa de cultura de tecidos tocando suavemente um lado da lamela na solução, em seguida, deixar cair o PDMS lamela para o PDMS. À medida que a lamela se instala, o PDMS começará a invadir ao longo dos bordos da lamela, mas não se cobri-lo completamente. Isto vai gerar uma interface entre o PDMS e de vidro após a cura (ver Figura 1A, B). </li><li> Incubar a placa a 70 ° C num forno durante 16 horas para curar (Harden) do PDMS. Coloque o plate em uma capa de cultura de células e UV esterilizar durante 10 min. NOTA: É melhor fazer as placas dentro de alguns dias de uso. No entanto, as placas podem ser envoltos em parafilme sem qualquer tampão e armazenado a 4 ° C durante até 2 semanas, sem qualquer queda significativa na qualidade. </li></ol> 2. celular Galvanização NOTA: Se se estudar o efeito do knockdown mediada por siRNA, executar o knockdown utilizando as instruções do fabricante ou o protocolo optimizado para o tipo de célula de escolha. <ol><li> Revestimento durotaxis cada câmara com 1 ml de 10 ug / ml de fibronectina em PBS sem cálcio e magnésio durante 1 hora a 37 ° C. Alternativamente, a fibronectina pode ser aplicado no dia antes da análise por incubação das PDMS com 10 ug / ml de fibronectina em PBS durante 16 horas a 4 ° C. Certifique-se de toda a superfície é submersa na solução de fibronectina em PBS. </li><li> Prepare desnaturado termicamente 1% BSA. Pesar 0,5 g de BSA e dissolvê-lo em 50 ml de PBS.Filtro de esterilizar a solução através de um filtro de 0,22 um e de calor a 80 ° C durante 12 min. Nota: Preparar esta solução no dia antes da célula de galvanização e armazenar a 4 ° C. </li><li> Aspirar a solução de fibronectina e lavar 3 vezes com PBS. Adicionar 1 ml de BSA desnaturado por calor em PBS a cada poço e incubar durante 30 min à temperatura ambiente. </li><li> Trypsinize e contar as células de escolha, enquanto as câmaras durotaxis estão bloqueando com o calor desnaturado BSA. </li><li> Placa 1 x 10 5 células em um volume de 2 ml em cada poço da câmara durotaxis, usando os meios necessários para o tipo particular de célula de escolha. Permitir que as células aderir e espalhada sobre o substrato durante 4 horas numa incubadora humidificada a 37 ° C com 5% de CO 2. NOTA: As células U2OS são rotineiramente mantidas em DMEM com 10% de FBS, suplementado com 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, e 10 UI / ml de penicilina, 10 ug / ml de estreptomicina. NOTA: O número de células utilizado neste exemplo é optimizado paraU2OS células. Optimização para outros tipos de células pode não ser necessária. Esta densidade dá as células espaço suficiente para migrar sem interações significativas com outras células. </li></ol> Imagem 3. Em células vivas <ol><li> Execute imagens de células vivas em um microscópio invertido, usando contraste de fase com uma objetiva de 10X. O microscópio deve ser equipado com uma câmara humidificada ambiente fechado, permitindo o controlo de temperatura a 37 ° C e 5% de CO 2 durante o exame a longo prazo. </li><li> Depois que as células se espalharam por cerca de 3,5 horas, montar a placa na câmara de microscópio. Deixar a amostra (s) para equilibrar na câmara durante 30 min. </li><li> Configure automatizado, multi-ponto de visitação no microscópio, se disponível. Concentre-se na interface entre as 90: 1 PDMS ea lamela de vidro e escolher aponta para imagem em todo o interface com um média de 40 pontos por durotaxis câmara. Imagem das células a cada 10 minutos até 16 horas. NOTA: A região de interesse aparece como duas linhas, com a linha exterior, correspondente ao bordo da lamela e a linha interna correspondente à interface real entre o PDMS e a lamela. Ver Figura 1B. </li></ol> Análise 4. Dados <ol><li> Gerar uma planilha como na Tabela 1. </li><li> Contar o número de eventos de passagem a partir dos PDMS à superfície do vidro e vice-versa de cada filme gerado. Grave o número de eventos de passagem na coluna apropriada na planilha excel. NOTA: Um evento de cruzamento é definido como o núcleo da célula, passando através da fronteira entre o PDMS e de vidro em um ou outro sentido. </li><li> Para quantificar múltiplos cruzamentos, contar o número de vezes que a célula atravessada a interface. Este número deve ser gravado na coluna Excel correspondente ao substrato sobre o qual a célula foi localizado no final do filme. Repita a análise para cada célula que atravessa a interface em tfilme que ele. Excluir células que migram para fora do campo de visão durante o exame. NOTA: É também importante para verificar, por contagem de células no início da experiência, as células que são capazes de aderir igualmente aos PDMS revestido com fibronectina e superfícies de lamela de vidro. </li><li> Calcula-se a percentagem de células que migraram a partir de PDMS para a superfície do vidro (isto é, submetidos a durotaxis). Adicione o número de cruzar eventos de suave a difícil e os múltiplos eventos de passagem, que terminou no disco e dividir pelo número total de eventos de passagem. </li><li> Calcula-se a percentagem de passagens múltiplas através da divisão do número de passagens múltiplas pelo número total de cruzamentos. </li></ol>

<ol><li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126 (4), 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8 (3), 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139 (5), 891-906 (2009).</li>
<li>Lo, C. M., Wang, H. B., Dembo, M., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+movement+is+guided+by+the+rigidity+of+the+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell movement is guided by the rigidity of the substrate.</a> Biophysical Journal. 79 (1), 144-152 (2000).</li>
<li>Plotnikov, S. V., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guiding+cell+migration+by+tugging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Guiding cell migration by tugging.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 619-626 (2013).</li>
<li>Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+rigidity+causes+strengthening+of+integrin-cytoskeleton+linkages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin-cytoskeleton linkages.</a> Cell. 88 (1), 39-48 (1997).</li>
<li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+focal+adhesion+assembly%3A+a+close+relationship+studied+using+elastic+micropatterned+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Force and focal adhesion assembly: a close relationship studied using elastic micropatterned substrates.</a> Nature Cell Biology. 3 (5), 466-472 (2001).</li>
<li>Provenzano, P. P., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+signaling+through+the+cytoskeleton+regulates+cell+proliferation+by+coordinated+focal+adhesion+and+Rho+GTPase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical signaling through the cytoskeleton regulates cell proliferation by coordinated focal adhesion and Rho GTPase signaling.</a> Journal of Cell Science. 124 (8), 1195-1205 (2011).</li>
<li>Wang, Y. L., Pelham, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+flexible%2C+porous+polyacrylamide+substrate+for+mechanical+studies+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a flexible, porous polyacrylamide substrate for mechanical studies of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 489-496 (1998).</li>
<li>Prager-Khoutorsky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+polarization+is+a+matrix-rigidity-dependent+process+controlled+by+focal+adhesion+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast polarization is a matrix-rigidity-dependent process controlled by focal adhesion mechanosensing.</a> Nature Cell Biology. 13 (12), 1457-1465 (2011).</li>
<li>Wormer, D. B., Davis, K. A., Henderson, J. H., Turner, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+focal+adhesion-localized+CdGAP+regulates+matrix+rigidity+sensing+and+durotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+ONE%22%5BJournal%5D)">The focal adhesion-localized CdGAP regulates matrix rigidity sensing and durotaxis.</a> PloS ONE. 9 (3), e91815(2014).</li>
<li>Trichet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+a+large-scale+mechanosensing+mechanism+for+cellular+adaptation+to+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Evidence of a large-scale mechanosensing mechanism for cellular adaptation to substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (18), 6933-6938 (2012).</li>
<li>Eyckmans, J., Boudou, T., Yu, X., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hitchhiker%E2%80%99s+guide+to+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A hitchhiker’s guide to mechanobiology.</a> Developmental Cell. 21 (1), 35-47 (2011).</li>
<li>Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensitive+ion+channels%3A+molecules+of+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanosensitive ion channels: molecules of mechanotransduction.</a> Journal of Cell Science. 117 (12), 2449-2460 (2004).</li>
<li>Jafar-Nejad, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec15%2C+a+component+of+the+exocyst%2C+promotes+notch+signaling+during+the+asymmetric+division+of+Drosophila+sensory+organ+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Sec15, a component of the exocyst, promotes notch signaling during the asymmetric division of Drosophila sensory organ precursors.</a> Developmental Cell. 9 (3), 351-363 (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm conflitos a divulgar.

Aqui nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis em células migrando. Uma grande força deste ensaio é a facilidade de preparação das câmaras durotaxis utilizando PDMS. A rigidez dos substratos pode ser facilmente manipulado por alteração da proporção de solução de base de PDMS de agente de reticulação para permitir o estudo de vários elementos de rigidez no ensaio. No entanto, uma limitação potencial do sistema é que apenas as células são expostas a uma única mudança na rigidez do substrato em oposição a ex...

A matriz extracelular (ECM) é constituído por uma matriz complexa de proteínas estruturais e de reticulação, incluindo colagénio, fibronectina e laminina. Embora seja bem estabelecido que a ECM fornece um suporte estrutural importante para os tecidos celulares, há evidências crescentes de que indicam que as células respondem activamente a mudanças físicas no seu ambiente de ECM para regular processos celulares, incluindo diversas sobrevivência celular, diferenciação e migração da célula. Por exemplo, diferenças na rigidez do ECM podem conduzir as células estaminais mesenquimais para linhagens diferentes, com substratos macios (~ 1 kPa) a promoção de linhagens neurogénicos enquanto substratos rígidos (~ 25 kPa) promover a diferenciação osteogénica 1. Da mesma forma, foi demonstrado um aumento na rigidez da matriz estromal para promover a tumorigénese célula epitelial mamaria e invasão do tecido circundante 2,3. Um aspecto particularmente interessante deste mechanosignaling resultados da actividade em um processo conhecido como durotaxis, em que as células migram preferencialmente para um substrato mais rígido 4,5. Células sentir constantemente as características físicas do ambiente extracelular através da ligação do receptor de integrina ao ECM. Este, por sua vez, promove a acumulação de numerosas proteínas estruturais e de sinalização para os seus domínios citoplasmáticos para conduzir a formação de estruturas adesivas conhecidas como adesões focais ou contactos focais 6,7. Dado que as integrinas não têm actividade enzimática inerente, os sinais são transmitidos a partir do ECM através destas proteínas acessórias para coordenar a resposta da célula ao seu ambiente em mudança 8. Consequentemente, a identificação e caracterização das proteínas-chave envolvidas na regulação mechanosignaling durotaxis e é uma área importante de investigação. Vários sistemas de modelos têm sido desenvolvidos para estudar durotaxis in vitro, mas a maioria têmutilizados substratos de poliacrilamida revestidos com colagénio 4. No entanto, a preparação dos substratos de poliacrilamida pode ser tecnicamente exigente e o colagénio utilizado nestes ensaios devem ser quimicamente reticulado ao substrato 9. Polidimetilsiloxano (PDMS) substratos têm mostrado exibir propriedades mecânicas comparáveis ​​aos substratos de poliacrilamida a 10. No entanto, os substratos PDMS são preparadas simplesmente misturando uma proporção de base para o agente de reticulação e esses substratos podem ser revestidos com proteínas de ECM sem a necessidade de reticulação química, tornando assim mais fácil PDMS uma ferramenta para estudar os efeitos de rigidez no comportamento de células. Aqui, nós descrevemos como preparar uma câmara durotaxis simples em que um substrato macio PDMS é integrado com uma lamela de vidro rígida. O ensaio, conforme descrito abaixo, proporciona um método rápido e simples para estudar durotaxis. Para este estudo foram utilizadas células de osteossarcoma U2OS humanos, combinado com siRNA mediadaknockdown de cdGAP para estudar o papel desta proteína de adesão focal em durotaxis 11. É importante ressaltar que este protocolo pode ser facilmente adaptado às necessidades individuais. Outros tipos celulares podem ser substituídos para as células U2OS e qualquer proteína pode ser batido ou sobre-expresso para determinar os efeitos sobre o comportamento das células durante durotaxis. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para incorporar proteínas fluorescente etiquetado para analisar sua dinâmica e comportamento usando FRAP ou FRET abordagens.

<table><tbody><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Kit de Elastômero</td></tr> <tr><td>de Silicone#1 Vidro de cobertura 12 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td></td></tr><tr><td>Placa de 6 poços</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CM</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Cellgro</td><td>25-005-CI</td><td></td></tr><tr><td>Sódio Pyruvate</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP356-100</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BD Biosciences</td><td>610077</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Celltreat</td><td>229456</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Soro Bovino</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Células de albumina bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr></tbody></table>

um sistema simplificado para a avaliação celular mechanosensing e durotaxis<em&gt; in vitro</em

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

As propriedades mecânicas da composição e da matriz extracelular são altamente variáveis ​​entre tipos de tecidos. Este tecido conjuntivo diversidade estroma grandemente impactos comportamento celular para regular os processos normais e patológicos, incluindo a proliferação celular, diferenciação, migração e adesão de sinalização direccional. A este respeito, a capacidade inata de determinados tipos de células para migrar em direcção um substrato mais rígido, ou menos complacente matriz é referida como durotaxis. Este fenómeno desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário, cicatrização de feridas e a invasão de células do cancro. Aqui, nós descrevemos um ensaio simples para estudar durotaxis, in vitro, utilizando PDMS (polidimetilsiloxano) substratos. Preparação do descrito durotaxis câmaras cria uma interface entre a rigidez do gel PDMS relativamente macio e uma lamela de vidro rígida. No exemplo fornecido, temos usado estes durotaxis câmaras para demonstrar um papel para o cdc42 / Rac1 GTPase ativando proteem, cdGAP, em mechanosensing e durotaxis regulamentação em células U2OS osteossarcoma humano. Este ensaio é facilmente adaptável a outros tipos e / ou knockdown de outras proteínas de interesse celulares para explorar seus respectivos papéis na mechanosignaling e durotaxis.

Um esquema da câmara durotaxis é mostrado na Figura 1A. Substrato PDMS macio (uma 90: 1 mistura de base de PDMS de reticulador soluções) é espalhada em uma 6 bem prato e uma lamela de vidro é colocado no topo do PDMS, que, em seguida, cobre parcialmente a superfície superior da lamela, criando, assim, uma interface entre os dois substratos de conformidade diferente. A rigidez do substrato macio PDMS é ~ 1 kPa, o que é comparável ao cumprimento típica do tecido do cérebro, enquanto que a...

Muitas células de mamíferos migram preferencialmente para uma matriz ou substrato mais rígido por meio da durotaxia. O objetivo deste protocolo é fornecer um sistema in vitro simples que possa ser usado para estudar e manipular comportamentos de durotaxia celular, incorporando substratos de polidimetilsiloxano (PDMS) de rigidez definida, fazendo interface com lamínulas de vidro.

Um sistema simplificado para a Avaliação celular Mechanosensing e Durotaxis<em&gt; In Vitro</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um sistema simplificado para a análise da dureza celular através do qual muitas células de mamíferos migram preferencialmente em direção a um substrato mais rígido. Isso é realizado primeiramente preparando substratos de polidimetilsiloxano ou PDMS com rigidez definida. Em seguida, o PDMS preparado é despejado em cada poço de uma placa de seis poços e todas as bolhas de ar são removidas.As câmaras Durex são então finalizadas com a colocação de uma lamínula esterilizada sobre o PDMS em cada poço, criando uma sobreposição. O passo final é semear células nas câmaras Duro taxes numa densidade que forneça às células espaço suficiente para migrar sem interações significativas com outras células. Por fim, utiliza-se microscopia de células vivas para estudar axxis em células migratórias.A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o poliacrilamida, é que há um único passo entre o PDMS macio e o vidro rígido, ao contrário das alternativas com géis em gradiente. Além disso, revestir o PDMS com componentes da matriz extracelular, como fibronectina, não requer ligação cruzada química, que é necessária para géis de poliacrilamida. Para preparar uma placa de cultura de tecidos de seis poços, primeiro rasgue o equilíbrio com um tubo cônico de 50 mililitros.Pese aproximadamente 10 gramas da solução base de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS no tubo de 50 mililitros. Para uma proporção de 90 para 1 do substrato, divida o peso medido da solução base de PDMS por 90. Para determinar a quantidade correta de solução de reticulante necessária, adicione a quantidade calculada de solução de reticulante de PDMS ao tubo e misture vigorosamente a mistura de base de PDMS com reticulante por cinco minutos à temperatura ambiente.Usando uma espátula pequena nesta etapa, a mistura conterá um pequeno número de bolhas de ar. Centrifugue o substrato de PDMS em uma centrífuga de bancada por cinco minutos a 50 vezes. Adicione temperatura ambiente para remover as bolhas, caso ainda haja bolhas.Após os cinco minutos, centrifugue novamente e pipete um mililitro do substrato PDMS na proporção de 90 para 1 em cada poço da placa de cultura de tecidos tratada. Placa de seis poços. Quaisquer bolhas de ar remanescentes presentes no PDMS podem ser eliminadas nesta etapa perfurando-as com uma agulha de 21 graus.Deixe a PDMS espalhar por 30 minutos no poço. Em seguida, ferva lâminas de vidro nº 1 de 12 milímetros em água destilada por cinco minutos, repetindo o processo por um total de três vezes. Coloque uma lâmina seca em cada poço da placa de cultura de tecidos tocando suavemente um dos lados da lâmina.Coloque o lamínula na solução de PDMS e, em seguida, deposite o lamínula sobre o PDMS. À medida que o lamínula assenta, o PDMS começará a avançar pelas bordas do lamínula, mas não o cobrirá completamente. Isso gerará uma interface entre o PDMS e o vidro após a cura.Incube a placa a 70 graus Celsius em uma estufa por 16 horas para curar o PDMS. Por fim, coloque a placa em uma câmara de cultura celular e esterilize com UV por 10 minutos. Revesta cada câmara durox com um mililitro de fibronectina em solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio durante uma hora a 30 graus Celsius.Certifique-se de que toda a superfície esteja submersa na solução de fibronectina em PBS. Prepare albumina sérica bovina desnaturada pelo calor a 1% ou BSA pesando 0,5 gramas de BSA e dissolvendo em 50 mililitros de filtro de PBS. Esterilize uma solução por meio de um filtro de 0,22 mícron antes de aquecer a 80 graus Celsius por 12 minutos.Em seguida, aspire a solução de fibronectina e lave as câmaras três vezes com PBS. Adicione um mililitro de BSA desnaturada por calor em PBS a cada poço e incube por 30 minutos à temperatura ambiente, tripsinize as células e conte as células de interesse enquanto as câmaras Durèx estão sendo bloqueadas com a BSA aquecida. Aspire a solução de BSA desnaturada pelas câmaras imediatamente antes do plaqueamento das células.Plaque 10.000 células em um volume de dois mililitros em cada poço da câmara doax. Utilizando o meio necessário para o tipo celular específico escolhido, permita que as células adiram e se espalhem sobre o substrato por quatro horas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO₂. Realize a microscopia de células vivas em um microscópio invertido utilizando contraste de fase com uma objetiva de 10x. O microscópio deve estar equipado com uma câmara ambiental fechada e umidificada, permitindo o controle da temperatura a 37 graus Celsius e de 5% de CO₂ durante a microscopia de longa duração.Após as células terem se espalhado por aproximadamente 3,5 horas, monte a placa na câmara do microscópio. Deixe as amostras equilibrarem na câmara por 30 minutos. Configure a visita automática multiponto no microscópio, se disponível.Foque na interface entre o PDMS e a lamínula de vidro e escolha pontos para obter imagens ao longo de toda a interface. Com uma média de 40 pontos por câmara Durex, capture imagens das células a cada 10 minutos durante até 16 horas; a região de interesse aparecerá como duas linhas, sendo a linha externa correspondente à borda da lamínula e a linha interna correspondente à interface real entre o PDMS e a lamínula. Para analisar os dados, gere uma planilha semelhante à mostrada no protocolo textual.Conte o número de eventos de travessia do PDMS para a superfície de vidro e vice-versa em cada filme gerado. Um evento de travessia é definido como o núcleo celular atravessando o limite entre o PDMS e o vidro em qualquer direção. Registre o número de eventos de travessia na coluna apropriada na planilha do Excel para quantificar múltiplas travessias.Conte o número de vezes que a célula atravessou a interface. Esse número deve ser registrado na coluna do Excel correspondente ao substrato no qual a célula estava localizada ao final do filme. Repita a análise para cada célula que atravessar a interface no filme.Exclua as células que migram para fora do campo de visão durante a aquisição de imagens. Calcule a porcentagem de células que migraram do PDMS para a superfície de vidro e, portanto, passaram por Duro Texas. Para tanto.Some o número de eventos de travessia de macio para rígido e os eventos múltiplos de travessia que terminaram em rígido, e divida pelo número total de eventos de travessia. Calcule a porcentagem de travessias múltiplas dividindo o total de travessias múltiplas pelo número total de travessias para começar a compreender o mecanismo molecular pelo qual as células respondem a estímulos mecânicos em seu ambiente. Proteínas específicas podem ser silenciadas usando RNAi, conforme mostrado aqui.Cerca de 70% das células controle tratadas com RNAi exibiram eixo. Em acentuado contraste, quando a proteína CD gap foi silenciada usando RNAi, as células não apresentaram preferência quanto à migração para o substrato rígido ou macio. Além disso, as células com silenciamento de CD gap cruzaram o limite múltiplas vezes.Enquanto as células tratadas com irna controle geralmente atravessam o limite apenas uma vez, trilhas representativas de células com irna controle mostram que essas células normalmente migram através do limite uma única vez e permanecem preferencialmente na superfície mais rígida em comparação com as células tratadas com irna para CD gap, que não demonstraram preferência por nenhuma das rigidezes e atravessaram o limite múltiplas vezes.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar os substratos de PDMS, montar as câmaras duris e quantificar os DUR taxes.

a-simplified-system-for-evaluating-cell-mechanosensing-durotaxis

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O sistema ECIS / Taxis é um sistema automatizado, o ensaio em tempo real que mede a quimiotaxia celulares. Neste ensaio, as células se movem por baixo de uma camada de agarose para se chegar a um eléctrodo de destino. Movimento celular é medida pelo aparecimento de resistência a AC 0 actual.

Medição de Quimiotaxia celulares com ECIS / Taxis

Para identificar novas mutações que afetam a mecanosensação, projetamos um ensaio que mede a resposta comportamental à estimulação tátil de cerdas de moscas em clones mutantes gerados pelo método MARCM. A combinação de técnicas permite a identificação de mutações mecanossensíveis que, de outra forma, seriam letais.

Clones em um ensaio comportamental para Mechanosensation de MarcM baseada em<em&gt; Drosophila melanogaster</em

aderências na superfície celular são centrais na mecanotransdução, como eles transmitem tensão mecânica e iniciar as vias de sinalização envolvidos na homeostase e desenvolvimento do tecido. Aqui, apresentamos um protocolo para dissecar as vias bioquímicas que são ativadas em resposta à tensão, utilizando microesferas magnéticas revestidas com ligando e aplicação de força para receptores de adesão.

Analisando celular superfície de adesão remodelação em resposta à tensão mecânica usando pérolas magnéticas

Aqui descrevemos os métodos para avaliar a resposta celular à estimulação mecânica aguda. No ensaio baseado em microscopia, examinamos a localização de biosensores fluorescente-etiquetadas após estimulação breve com fluxo de cisalhamento. Também testamos a ativação de várias proteínas de interesse em resposta à estimulação mecânica aguda bioquimicamente.

Avaliação de Dictyostelium discoideum resposta à estimulação mecânica aguda

Novas ferramentas para pesquisa de mechanobiology são necessários para compreender o estresse mecânico como ativa vias bioquímicas e elicia respostas biológicas. Aqui, vamos mostrar um novo método para a estimulação mecânica seletiva dos animais imobilizados com uma armadilha de microfluidic permitindo imagens de alta resolução de respostas celulares.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

Apresentamos uma instalação da pinça óptica acoplada a um microscópio de folha de luz e a sua aplicação a sonda mecânica de células sem grânulos no embrião da drosófila .

Sondando a célula mecânica com pinça óptica de grânulo-livre no embrião da drosófila

As forças mecânicas são importantes para controlar a migração celular. Este protocolo demonstra o uso de hidrogéis elásticos que podem ser deformados usando uma micropipeta de vidro e um micromanipulador para estimular as células com um gradiente de rigidez local para provocar mudanças na estrutura celular e migração.

Ensaio de Durotaxis de célula única para avaliar o controle mecânico do movimento celular e eventos de sinalização relacionados

A plataforma Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiza o processo de medição simultânea de uma grande variedade de sinais químicos e mecânicos em células aderentes. O iTACS foi projetado para facilitar o desenvolvimento orientado pela comunidade e permitir que os pesquisadores usem todos os recursos da plataforma, independentemente de sua formação educacional.

Kit de ferramentas integrativas para analisar sinais celulares: forças, movimento, morfologia e fluorescência

Este trabalho apresenta um protocolo flexível para utilizar a tecnologia de superfícies contraíveis elastoméricas rotuladas fluorescentes (FLECS) em formato de microwell para quantificação simplificada e prática de forças contraídas unicelulares com base em deslocamentos visualizados de micropatterns de proteína fluorescente.

Análise simplificada e de alto rendimento da contractilidade unicelular usando Elastômeros Micropatterned

O presente protocolo descreve o projeto, fabricação e caracterização de um sistema microfluídico capaz de alinhar, imobilizar e comprimir com precisão centenas de embriões de Drosophila melanogaster com intervenção mínima do usuário. Este sistema permite imagens de alta resolução e recuperação de amostras para análise pós-estimulação e pode ser dimensionado para acomodar outros sistemas biológicos multicelulares.

Mecanoestimulação de organismos multicelulares através de um sistema de compressão microfluídica de alto rendimento

Apresentamos aqui um método para fenótipo mecânico de células individuais usando uma plataforma microfluídica baseada em eletrônica chamada detecção de mechano-node-pore (mechano-NPS). Esta plataforma mantém um rendimento moderado de 1-10 células/s enquanto mede as propriedades biofísicas elásticas e viscosas das células.

Mechano-Node-Pore Sensing: Uma plataforma rápida e sem rótulos para medições viscoelásticas de célula única multiparâmetro

Aprenda a preparar substratos de PDMS com rigidez definida para estudar durotaxi celular in vitro. Este método simplificado utiliza microscopia de células vivas para analisar a migração direcionada de células mamíferas.

Um sistema simplificado para a Avaliação celular Mechanosensing e Durotaxis

Explorar mais vídeos