Um sistema simplificado para a Avaliação celular Mechanosensing e Durotaxis In Vitro

Muitas células de mamíferos migram preferencialmente para uma matriz ou substrato mais rígido por meio da durotaxia. O objetivo deste protocolo é fornecer um sistema in vitro simples que possa ser usado para estudar e manipular comportamentos de durotaxia celular, incorporando substratos de polidimetilsiloxano (PDMS) de rigidez definida, fazendo interface com lamínulas de vidro.

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um sistema simplificado para a análise de durex celular através do qual muitas células de mamíferos migram preferencialmente para um substrato mais rígido. Isso é feito primeiro preparando substratos de polimetil suboxano ou PDMS de rigidez definida. Em seguida, o PDMS preparado é despejado em cada poço de uma placa de seis poços e quaisquer bolhas de ar são removidas.

As câmaras Durex são então completadas pela colocação de uma lamínula esterilizada no topo do PDMS em cada poço para criar uma sobreposição. A etapa final é semear células nas câmaras de impostos Duro em uma densidade que dê às células espaço suficiente para migrar sem interações significativas com outras células. Em última análise, a microscopia de células vivas é usada para estudar axxis em células migratórias.

A principal vantagem dessa técnica sobre os métodos existentes, como a poliacrilamida, é que há uma única etapa entre o PDMS macio e o vidro rígido, em vez de alternativas de gel gradiente. Também revestindo PDMS com matriz extracelular Componentes como fibronectina não requerem reticulação química, que é necessária para géis de poliacrilamida. Para preparar primeiro uma placa de cultura de tecidos de seis poços, rasgue a balança com um tubo cônico de 50 mililitros.

Pesar cerca de 10 g da solução de base de polidimetilsuboxano ou PDMS no tubo de 50 mililitros. Para um substrato de 90 para um, divida o peso medido da solução de base PDMS por 90. Para determinar a quantidade correta de solução de reticulador necessária, adicione a quantidade calculada de solução de reticulador PDMS ao tubo vigorosamente misturado com a mistura de reticulador de base APDS por cinco minutos em temperatura ambiente.

Usando uma pequena espátula nesta fase, a mistura conterá um pequeno número de bolhas de ar. Centrifugue o substrato PDMS em uma centrífuga de bancada por cinco minutos a 50 vezes. G. Adicione a temperatura ambiente para remover as bolhas se ainda houver bolhas.

Após os cinco minutos, centrifugue novamente pipetar um mililitro do substrato 90 para um PDMS em cada poço da cultura de tecidos tratada. Placa de seis poços. Quaisquer bolhas de ar remanescentes presentes no PDMS podem ser eliminadas nesta fase, estourando-as com uma agulha de calibre 21.

Deixe o PDMS se espalhar por 30 minutos no poço. Em seguida, ferva o vidro de 12 milímetros Número um, a tampa desliza em água destilada por cinco minutos, um total de três vezes. Coloque uma lamínula seca em cada alvéolo da placa de cultura de tecidos, tocando suavemente em um lado da tampa.

Deslize para a solução PDMS e, em seguida, solte a lamínula no PDMS. À medida que a lamínula se assenta, o PDMS começará a invadir as bordas da lamínula, mas não a cobrirá completamente. Isso gerará uma interface entre o PDMS e o vidro após a cura.

Incube a placa a 70 graus Celsius em um forno por 16 horas para curar o PDMS. Por fim, coloque a placa em uma capa de cultura de células e esterilize por UV por 10 minutos. Cubra cada câmara durox com um mililitro de fibronectina em solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio por uma hora a 30 graus Celsius.

Certifique-se de que toda a superfície esteja submersa na solução de fibronectina em PBS. Prepare albumina de soro bovino de natureza térmica a 1% ou BSA pesando 0,5 gramas de BSA e dissolvendo-o em 50 mililitros de filtro PBS. Esterilize uma solução através de um filtro de ponto 22 mícrons antes de aquecer a 80 graus Celsius por 12 minutos.

Em seguida, aspire a solução de fibronectina e lave as câmaras três vezes com PBS. Adicione um mililitro de BSA desnaturado por calor em PBS a cada poço e incube por 30 minutos em temperatura ambiente, olhos de tripsina e conte as células de escolha enquanto as câmaras durex estão bloqueando com o calor. Solução de BSA aspirada de BSA desnaturada de câmaras imediatamente antes de plaquear as células.

Placa 10.000 células em um volume de dois mililitros em cada poço da câmara doax. Usando o meio necessário para o tipo de célula específico de escolha, permita que as células adiram e se espalhem no substrato por quatro horas em uma incubadora umidificada a 37 graus Celsius com 5% de CO2, realize imagens de células vivas em um microscópio invertido usando contraste de fase com uma objetiva de 10 x. O microscópio deve ser equipado com uma câmara umidificada ambiental fechada, permitindo o controle da temperatura a 37 graus Celsius e 5% de CO2 durante imagens de longo prazo.

A imagem, após as células se espalharem por aproximadamente 3,5 horas, monte a placa na câmara do microscópio. Deixar as amostras equilibrarem-se na câmara durante 30 minutos. Configure a visita automatizada de vários pontos no microscópio, se disponível.

Concentre-se na interface entre o PDMS e a lamínula de vidro e escolha pontos para criar imagens em toda a interface. Com uma média de 40 pontos por imagem da câmara Durex, as células a cada 10 minutos por até 16 horas, a região de interesse aparecerá como duas linhas com a linha externa correspondendo à borda da lamínula e a linha interna correspondendo à interface real entre o PDMS e a lamínula. Para analisar os dados, gere uma planilha como a mostrada no protocolo de texto.

Conte o número de eventos de cruzamento do PDMS para a superfície do vidro e vice-versa de cada filme gerado. Um evento de cruzamento é definido como o núcleo da célula passando sobre o limite entre o PDMS e o vidro em qualquer direção. Registre o número de eventos de cruzamento na coluna apropriada na planilha do Excel para quantificar vários cruzamentos.

Conte o número de vezes que a célula cruzou a interface. Esse número deve ser registrado na coluna do Excel correspondente ao substrato no qual a célula estava localizada no final do filme. Repita a análise para cada célula que cruzar a interface no filme.

Exclua células que migram para fora do campo de visão Durante a geração de imagens. Calcule a porcentagem de células que migraram do PDMS para a superfície do vidro e, portanto, foram submetidas ao Duro Texas. Para fazer isso.

Adicione o número de eventos de cruzamento de suave a difícil e os vários eventos de cruzamento que terminaram em difícil e divida pelo número total de eventos de cruzamento. Calcule a porcentagem de cruzamentos múltiplos dividindo o total de cruzamentos múltiplos pelo número total de cruzamentos para começar a entender o mecanismo molecular pelo qual as células correspondem a pistas mecânicas em seu ambiente. Proteínas específicas podem ser eliminadas usando IRNA, como mostrado aqui.

Cerca de 70% das células controladas com irna exibiram axxis. Em contraste marcante, quando o intervalo de CD foi derrubado usando RNAi, as células não tiveram preferência quanto a se migraram para o substrato duro ou mole. Além disso, as células de knockdown do intervalo de CD cruzaram o múltiplo de limite.

Considerando que as células tratadas com irna de controle geralmente só cruzam a fronteira uma vez que as faixas representativas de controle. As células Irna mostram que as células geralmente migram através do limite uma vez e preferencialmente permanecem na superfície mais rígida em comparação com o intervalo de CD. Irna tratou células que não demonstraram preferência por rigidez e cruzaram o limite várias vezes.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento de como preparar os substratos PDMS, montar as câmaras duris e quantificar os impostos DUR.