Um sistema simplificado para a Avaliação celular Mechanosensing e Durotaxis

O objetivo geral deste procedimento é fornecer um sistema simplificado para a análise da dureza celular através do qual muitas células de mamíferos migram preferencialmente em direção a um substrato mais rígido. Isso é realizado primeiramente preparando substratos de polidimetilsiloxano ou PDMS com rigidez definida. Em seguida, o PDMS preparado é despejado em cada poço de uma placa de seis poços e todas as bolhas de ar são removidas.

As câmaras Durex são então finalizadas com a colocação de uma lamínula esterilizada sobre o PDMS em cada poço, criando uma sobreposição. O passo final é semear células nas câmaras Duro taxes numa densidade que forneça às células espaço suficiente para migrar sem interações significativas com outras células. Por fim, utiliza-se microscopia de células vivas para estudar axxis em células migratórias.

A principal vantagem desta técnica em relação a métodos existentes, como o poliacrilamida, é que há um único passo entre o PDMS macio e o vidro rígido, ao contrário das alternativas com géis em gradiente. Além disso, revestir o PDMS com componentes da matriz extracelular, como fibronectina, não requer ligação cruzada química, que é necessária para géis de poliacrilamida. Para preparar uma placa de cultura de tecidos de seis poços, primeiro rasgue o equilíbrio com um tubo cônico de 50 mililitros.

Pese aproximadamente 10 gramas da solução base de poli(dimetilsiloxano) ou PDMS no tubo de 50 mililitros. Para uma proporção de 90 para 1 do substrato, divida o peso medido da solução base de PDMS por 90. Para determinar a quantidade correta de solução de reticulante necessária, adicione a quantidade calculada de solução de reticulante de PDMS ao tubo e misture vigorosamente a mistura de base de PDMS com reticulante por cinco minutos à temperatura ambiente.

Usando uma espátula pequena nesta etapa, a mistura conterá um pequeno número de bolhas de ar. Centrifugue o substrato de PDMS em uma centrífuga de bancada por cinco minutos a 50 vezes. Adicione temperatura ambiente para remover as bolhas, caso ainda haja bolhas.

Após os cinco minutos, centrifugue novamente e pipete um mililitro do substrato PDMS na proporção de 90 para 1 em cada poço da placa de cultura de tecidos tratada. Placa de seis poços. Quaisquer bolhas de ar remanescentes presentes no PDMS podem ser eliminadas nesta etapa perfurando-as com uma agulha de 21 graus.

Deixe a PDMS espalhar por 30 minutos no poço. Em seguida, ferva lâminas de vidro nº 1 de 12 milímetros em água destilada por cinco minutos, repetindo o processo por um total de três vezes. Coloque uma lâmina seca em cada poço da placa de cultura de tecidos tocando suavemente um dos lados da lâmina.

Coloque o lamínula na solução de PDMS e, em seguida, deposite o lamínula sobre o PDMS. À medida que o lamínula assenta, o PDMS começará a avançar pelas bordas do lamínula, mas não o cobrirá completamente. Isso gerará uma interface entre o PDMS e o vidro após a cura.

Incube a placa a 70 graus Celsius em uma estufa por 16 horas para curar o PDMS. Por fim, coloque a placa em uma câmara de cultura celular e esterilize com UV por 10 minutos. Revesta cada câmara durox com um mililitro de fibronectina em solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio durante uma hora a 30 graus Celsius.

Certifique-se de que toda a superfície esteja submersa na solução de fibronectina em PBS. Prepare albumina sérica bovina desnaturada pelo calor a 1% ou BSA pesando 0,5 gramas de BSA e dissolvendo em 50 mililitros de filtro de PBS. Esterilize uma solução por meio de um filtro de 0,22 mícron antes de aquecer a 80 graus Celsius por 12 minutos.

Em seguida, aspire a solução de fibronectina e lave as câmaras três vezes com PBS. Adicione um mililitro de BSA desnaturada por calor em PBS a cada poço e incube por 30 minutos à temperatura ambiente, tripsinize as células e conte as células de interesse enquanto as câmaras Durèx estão sendo bloqueadas com a BSA aquecida. Aspire a solução de BSA desnaturada pelas câmaras imediatamente antes do plaqueamento das células.

Plaque 10.000 células em um volume de dois mililitros em cada poço da câmara doax. Utilizando o meio necessário para o tipo celular específico escolhido, permita que as células adiram e se espalhem sobre o substrato por quatro horas em um incubador umidificado a 37 graus Celsius com 5% de CO₂. Realize a microscopia de células vivas em um microscópio invertido utilizando contraste de fase com uma objetiva de 10x. O microscópio deve estar equipado com uma câmara ambiental fechada e umidificada, permitindo o controle da temperatura a 37 graus Celsius e de 5% de CO₂ durante a microscopia de longa duração.

Após as células terem se espalhado por aproximadamente 3,5 horas, monte a placa na câmara do microscópio. Deixe as amostras equilibrarem na câmara por 30 minutos. Configure a visita automática multiponto no microscópio, se disponível.

Foque na interface entre o PDMS e a lamínula de vidro e escolha pontos para obter imagens ao longo de toda a interface. Com uma média de 40 pontos por câmara Durex, capture imagens das células a cada 10 minutos durante até 16 horas; a região de interesse aparecerá como duas linhas, sendo a linha externa correspondente à borda da lamínula e a linha interna correspondente à interface real entre o PDMS e a lamínula. Para analisar os dados, gere uma planilha semelhante à mostrada no protocolo textual.

Conte o número de eventos de travessia do PDMS para a superfície de vidro e vice-versa em cada filme gerado. Um evento de travessia é definido como o núcleo celular atravessando o limite entre o PDMS e o vidro em qualquer direção. Registre o número de eventos de travessia na coluna apropriada na planilha do Excel para quantificar múltiplas travessias.

Conte o número de vezes que a célula atravessou a interface. Esse número deve ser registrado na coluna do Excel correspondente ao substrato no qual a célula estava localizada ao final do filme. Repita a análise para cada célula que atravessar a interface no filme.

Exclua as células que migram para fora do campo de visão durante a aquisição de imagens. Calcule a porcentagem de células que migraram do PDMS para a superfície de vidro e, portanto, passaram por Duro Texas. Para tanto.

Some o número de eventos de travessia de macio para rígido e os eventos múltiplos de travessia que terminaram em rígido, e divida pelo número total de eventos de travessia. Calcule a porcentagem de travessias múltiplas dividindo o total de travessias múltiplas pelo número total de travessias para começar a compreender o mecanismo molecular pelo qual as células respondem a estímulos mecânicos em seu ambiente. Proteínas específicas podem ser silenciadas usando RNAi, conforme mostrado aqui.

Cerca de 70% das células controle tratadas com RNAi exibiram eixo. Em acentuado contraste, quando a proteína CD gap foi silenciada usando RNAi, as células não apresentaram preferência quanto à migração para o substrato rígido ou macio. Além disso, as células com silenciamento de CD gap cruzaram o limite múltiplas vezes.

Enquanto as células tratadas com irna controle geralmente atravessam o limite apenas uma vez, trilhas representativas de células com irna controle mostram que essas células normalmente migram através do limite uma única vez e permanecem preferencialmente na superfície mais rígida em comparação com as células tratadas com irna para CD gap, que não demonstraram preferência por nenhuma das rigidezes e atravessaram o limite múltiplas vezes.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como preparar os substratos de PDMS, montar as câmaras duris e quantificar os DUR taxes.