Name: TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras Drosophila Os embriões (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Aprenda a isolar mRNA traduzido em populações celulares raras de embriões de Drosophila usando o protocolo TRAP. Este método permite capturar tradução específica por tipo celular sem dissociação.

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Os autores agradecem a Nicolas Allegre, Maud Peyny e Jean-Philippe Da Ponte por sua excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pela Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), a bolsa inicial do INSERM, a bolsa ANR ID-CELL-SPE, a Equipe FRM e a bolsa AFM 15845.

1. Fly Linha Geração <ol><li> Gerar duas construções diferentes. Na primeira construção, RpL10A ADNc (subunidade ribossomal proteína L10A) é clonado a jusante da GFP em UPAEP-PL-GFP-nter plasmídeo (versão modificada a partir de 32). A utilização de um promotor de linha germinal permite um uso mais polivalente da linha transgénica. NOTA: Obter a segunda construção através da clonagem da sequência reguladora conduzir a expressão específica de tecido do gene de GAL4 a montante desleixo (TF) usando pPTGAL4 plasmídeo. </li><li> Injecte separadamente em plasmídeos moscas W 1118 e inserir as construções no genoma da mosca por P-elemento de inserção (de acordo com o procedimento padrão) 33. </li><li> Seleccione transformantes, a fim de recuperar linhas de voar com construções em dois cromossomas diferentes. A linha de TRAP final é criado pela combinação destas duas linhas (cruzes genéticos), a fim de obter uma linha estável double-transgênico. F0: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx w-; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: w-; Cyo, UAS EGFP :: RpL10A; Desleixo Gal4 / TM6B. Massively ampliar esta linha e coletar os embriões desejar-encenadas. </li></ol> Coleção 2. Embryo <ol><li> Prepare 8 grandes gaiolas população cilíndrico contendo cerca de 40 g de jovens moscas por gaiola (cerca de 180 mil moscas / gaiola). </li><li> Prossiga com os chamados pré-Lays que permitem moscas para limpar embriões em desenvolvimento a partir de suas tubas uterinas. Para isso, coloque as moscas para 1 hr em dois pratos de petri de 11 cm de diâmetro, contendo uma mistura de suco de uva e agar solidificado e cobrir ⅓ da superfície com recém-feitos pasta de levedura. Após 3 trocas de placas de uva suco coletar os embriões reais em placas semelhantes feitas na hora. NOTA: O tempo de incubação irão variar de acordo com a janela de tempo de desenvolvimento estudado. </li><li> Remover placas de gaiolas e deixá-los na mesma temperatura, durante o tempo necessário para obter estágio de desenvolvimento correto (por exemplo, 3 horas de postura de ovos + 10 hr de additional incubação dá embriões de fase 10-13 horas após colocação de ovo (AEL)). Ressuspender o conteúdo placa (embriões, levedura pasta, moscas mortas) com 50 ml de água usando um pincel. </li><li> Passar por uma série de peneiras (700 mm, 355 mm, 112 mm) para separar embriões de moscas mortas e restantes partes do corpo e coletar embriões retidos na peneira de menor diâmetro, em seguida, lavar brevemente em água deionizada. Não use mais de 18 placas por coleção, pois pode entupir as peneiras. </li><li> Dechorionate embriões em 4,5% de alvejante em água deionizada para 2 minutos e enxaguar abundantemente com água deionizada por 30-60 seg. Incubar os embriões em PBS 0,01% de Tween 20, 100 ug / ml de ciclo-heximida, durante 5-10 min à temperatura ambiente sob agitação. </li><li> Embriões secos em folhas absorventes de celulose e transferi-los para novos microtubos. Pesar os tubos de flash e congelar os embriões por imersão em azoto líquido. Nesta fase, os embriões secos podem ser armazenados durante vários meses a -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Preparação de esferas magnéticas acopladas a GFP Anticorpo <ol><li> Completamente ressuspender a Proteína G esferas magnéticas no frasco de origem por agitação suave. </li><li> Transferência de 90 ul de pérolas para um tubo livre de RNase e coletá-los em um ímã (30-60 seg). 90 ul de pérolas é necessária a realização de imunoprecipitação (IP) com 1 ml de lisado contendo 60-80 mg / mL de proteínas. Respeitar rácios para evitar a saturação do grânulo. Use vários tubos de acordo com a quantidade de proteína. </li><li> Grânulos de lavagem com 1 × PBS 0,01% de Tween 20 (500 mL) e coletar pérolas no ímã para descartar sobrenadante. Adicionar 30 g de anticorpo GFP em 350 ul de PBS, 0,01% de Tween 20 para os grânulos e incubar com extremidade lento sobre a extremidade de mistura durante 30 min à TA. </li><li> Coletar pérolas no ímã (30-60 seg), elimine o sobrenadante e enxaguar em 500 mL de tampão de extracção polysome (HEPES 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton a 1%, Cicloheximida 100 mg / ml , Protease inibidor 1 ×, inibidor de RNase L 100). </li><li> Recolhe grânulos sobre o íman e adicionar 500 ul de tampão de bloqueio (BSA a 0,1 mg / mL, ARNt de levedura a 0,1 mg / mL, glicogénio 0,1 mg / mL em tampão de extracção polissoma). </li><li> Incubar durante 30 min à TA e repetir este passo uma vez com tampão de bloqueio fresco. </li><li> Coletar pérolas no ímã e enxaguar em 500 mL de tampão de extracção polysome, em seguida, lembrar pérolas e proceder imediatamente à etapa imunopurificação (secção 6). </li></ol> 4. Preparação Lysate <ol><li> Antes de começar, configure o programa no multi-direcional contas de velocidade rápida moedor: 2 × 10 segundos a 5.000 rpm, 15 segundos de pausa. Transferência de embriões secos (1,5 g) para tubos de 15 ml pré-arrefecido em gelo que contém tampão de extracção em polissoma, e homogeneizar imediatamente. Homogeneizar 1,5 g de embriões em 4 ml de tampão de extracção polissoma. </li><li> Espalhe homogeneizada embriões em duas pré-arrefecido 2 tubos mL e moer o EmbryOS executando o programa de homogeneizador. Transferir o lisado para tubos de microcentrífuga fresco previamente arrefecido em gelo e preparar um sobrenadante pós-nuclear por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 2000 g. </li><li> Transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco previamente arrefecido em gelo, adicionar 1/100 volume de amostra de 10% de Nonidet P-40 ao sobrenadante (concentração final = 0,1%), e misturá-lo suavemente por inversão do tubo. </li><li> Pulso-centrifugar a amostra num minifuge para recolher o líquido na parte inferior do tubo, adicionar 1/9 de volume de amostra de 300 mM de 1,2-Diheptanoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DHPC) (concentração final = 30 mM ), misturá-lo suavemente por inversão do tubo, e incuba-se a mistura em gelo durante 5 min (mistura invertendo várias vezes durante a incubação). </li><li> Prepara-se o sobrenadante pós-mitocondrial por centrifugação a 4 ° C durante 10 min a 20.000 g. Medir a concentração de proteína pelo método de Bradford: concentração no ligado deve estar entre 60-80 mg / ml. Take o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga prechilled fresco e avança imediatamente para a etapa de pré-absorção (seção 5). </li></ol> 5. Pré-absorção <ol><li> Completamente ressuspender as esferas magnéticas, por agitação suave e transferir 30 ul de pérolas para um tubo de microcentrífuga à TA (30 ul de contas / 1 mL de ligado embrionária). </li><li> Coletar pérolas no ímã, pipeta fora o sobrenadante e ressuspender as contas em tampão de extração polysome (500 mL). Recolhe grânulos sobre o íman, adicionar lisado embrionário, e incubar durante 1 hora a 4 ° C num rotor. <ol><li> Remover grânulos e manter sobrenadante em gelo durante o passo imunopurificação. Antes imunopurificação, manter 100 l de sobrenadante (entrada) para comparar amostras RNA global com a amostra de RNA coletadas após imunopurificação, RT-qPCR por, por exemplo. </li></ol></li></ol> 6. imunopurificação <ol><li> Adicionar 1 ml (correspondendo a 60-80 mg / ml de proteína) depré-absorvido ligado a um tubo contendo RNase livre de 90 ul de contas bloqueadas acopladas ao anticorpo GFP. Incubar as amostras a 4 ° C durante 2 h com agitação suave a-extremidade sobre extremidade numa rotador tubo. Alternativamente, realizar a incubação O / N a 4 ° C. </li><li> Após a incubação, coletar pérolas no ímã. Usar um minifuge a girar para baixo os grânulos, em seguida ressuspender-los em 500 ul de tampão de lavagem (HEPES 10 mM, KCl 350 mM, MgCl2 5 mM, Nonidet P-40 a 1%, DTT 0,5 mM, ciclo-heximida 100 ug / mL, RNase inibidor de 100 L ) e recolhê-las sobre o ímã. Repita este passo mais duas vezes. </li><li> Mudar as esferas para um novo tubo livre de RNase previamente arrefecido e lavar duas vezes. Colete contas em um ímã e proceder à extração de RNA, adicionando 1 ml TRIZOL diretamente para as contas e siga as instruções do fabricante. </li></ol> 7. RNA Clean-up e Avaliação da Qualidade <ol><li> Use um Kit RNeasy Micro, conforme as instruções do fabricante. Em conclusão, elute RNA com (x) ul de água sem RNase. Quente durante 2 min a 60 ° C, e armazenar amostras snap-congelados a -80 ° C. Verifique a qualidade da RNA usando Bioanalyzer (siga as instruções do fabricante). </li><li> Para testar a especificidade do Traped ARN, realizar a transcrição reversa em 3 ng de RNA purificado (de entrada e de IP) de acordo com as instruções do fabricante (sobrescritos III). Utilizar o cDNA obtido por qPCR utilizando conjuntos de iniciadores específicos para o gene. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Este artigo descreve um Traduzindo Ribossomo Affinity protocolo de purificação modificado (apelidado de &quot;TRAP-rc&quot;) dedicada ao estudo de populações de células raras em embriões de Drosophila. A informação é fornecida sobre os passos principais para o isolamento bem sucedido de ARN específico com um rendimento adequados para análise de micro-arranjo ou ARN-SEQ, ou seja, 1) quantidade de material biológico necessário e procedimento otimizado para a lise embrião e extracção polissoma; 2) contas / anticorpo-a-imunoprecipitação de lisados ​​de rácios para óptima; 3) as etapas permitindo a redução de fundo incluindo a composição tampão de lavagem, de modo a executar experimentos TRAP-rc com alta especificidade e sensibilidade. Este protocolo produz dados reprodutíveis tornando-se facilmente aplicado a quaisquer outros tipos de células. Esta técnica torna possível analisar a expressão diferencial de genes em nível de mRNA ativamente traduzindo-e, assim, preparar o caminho para a compreensão da expressão da proteína em uma especificação<html> ific tipo de célula a uma janela de tempo específico. De notar contudo que a abundância da proteína vai depender da taxa de conversão e os processos de degradação. Uma das principais limitações do método TRAP é a sua incapacidade de medir o teor de proteína de uma forma exacta ou quantitativa para detectar a modificação pós-translacional. Melhorar a quantificação medindo a densidade ribossomo ao longo do corpo mRNA e, ao fazê-lo, de uma maneira específica do tipo celular pode fazer-TRAP combinado com ribossomo footprinting uma ferramenta muito poderosa. Em um recente artigo 34, esta combinação foi realizada em células embrionárias de rim 293 humanos. Os autores correu footprinting nuclease, seguido por purificação por afinidade de uma forma biotinilada indutível de RpL10A usando esferas de estreptavidina. Esta é uma prova do princípio de que é possível realizar a pegada de ribossoma em um organismo inteiro, enquanto alvo um tipo específico de célula, sendo a limitação da quantidade de material biológico necessário para a finalidade. &quot;&gt; Performing experimentos TRAP em paralelo com as análises transcriptomic globais tornará possível para rastrear proporções entre recém-transcritas e actively- traduzindo RNA. Este será profundamente informativo dos potenciais mecanismos de pós-transcrição que ocorrem em contextos de desenvolvimento específicos ou populações de células específicas microRNAs -por por exemplo. Em conclusão, a TRAP é um método altamente eficiente, sensível e específico para a identificação de RNAs ligados para activamente traduzindo-ribossomas de uma maneira especifica para a célula. Este método pode ser usado numa ampla variedade de organismos e tipos de tecidos. O novo protocolo TRAP-rc aqui descrito foi otimizado para populações de células raras (menos de 1% do número total de células) e para uma quantidade de material final suficiente para análises subsequentes a nível de todo o genoma. Uma possível limitação deste método é a exigência de um driver forte para produzir ribossomos marcados em quantidade suficiente para compete com os não marcados endógenas do tipo de célula alvo. Num estudo recente 25, os autores estimado para 10-30% do rácio de ribossomas contra etiquetado não marcados. Para superar este problema crescente UAS-RpL10A-EGFP número de cópias deve melhorar consideravelmente este equilíbrio. Alternativamente, a adição ao fundo genético descrito um transgene UAS-GAL4 vai amplificar a produção da proteína GAL4 e indirectamente aumentar a expressão de RpL10A-EGFP. Isso deve favorecer uma melhor ocupação dos ribossomos marcados em mRNA. Note-se que esta abordagem já eficiente pode ser feita ainda mais poderoso, adaptando métodos complementares para trazer um aspecto mais quantitativa ou para descobrir e desvendar os mecanismos moleculares que são essenciais para o controle da expressão gênica.

A compreensão de como as células adquirem propriedades específicas durante o desenvolvimento é crucial, a fim de apreciar a complexidade de órgãos e do seu potencial evolutivo em direção a condições patológicas. Há um grande esforço de investigação para decifrar as redes reguladoras de genes que underly especificação e diferenciação celular por perfis unrevealing globais de expressão do gene, o estado de ligação de pol II, factor de transcrição-ocupação em sequências reguladoras ou modificações pós-traducionais de histonas. Para avaliar a expressão gênica em um microarrays nível mundial e abordagens RNA-seq são usados. Microarrays permitem detectar abundância mRNA, enquanto RNA-seq é melhor do que vise informar sobre os diferentes tipos de RNAs, incluindo codificação e noncoding RNAs como microRNAs, lncRNAs ou snRNAs. No entanto, estas técnicas não podem diferenciar-activamente transcritas, ARNm em estado estacionário, activa-traduzir ARNm, e o ARNm de entrar no processo de degradação. Medindo steady-stComeram níveis de ARNm é conhecida por ser uma estimativa baixa de composição proteoma 1-3. Ao contrário, identificando ativamente traduzir-mRNA dá uma imagem mais precisa da produção de proteína. No entanto, estudos transcriptomic foram principalmente dirigida, no plano todo-organismo, comparando o ganho ou a perda de função de um factor específico para o tipo selvagem condição 4-7 ou no tecido dissecado, fazendo com que os perfis de expressão de gene de difícil interpretação. Recentes avanços em ferramentas de segmentação de células, purificação por afinidade e melhorias de sensibilidade permitem agora a realizar a nível genoma análises sobre as populações de células pequenas ou até mesmo células individuais em um organismo vivo. Em Drosophila, grandes colecções de linhas transgénicas permitir direccionamento temporal e espacial específica de diferentes tecidos e subpopulações de células através do sistema de GAL4 / UAS 8-10 originando quantificação mais precisa dos mecanismos moleculares necessários para a função celular. 11. Este método baseado na centrifugação em gradiente de sacarose permite a selecção da fracção de polissoma e determinação de ARNm traduzido à escala genoma quando analisados ​​com microarrays ou sequenciação de profundidade. Polissoma isolamento pode ser acoplado com a digestão da nuclease para identificar pegadas ribossomais correspondentes a fragmentos de ARN protegidas pelos ribossomas durante o processo de tradução 12. Footprinting Ribosomal aumenta a precisão da quantificação do RNA e tradução resolução RNA de nível sequência e posicionamento ribossomo, torna possível medir a taxa de tradução. No entanto, até à data não tem sido aplicado para o isolamento específico de células de translatomes, principalmente devido à forte redução no rendimento de ARN obtido no final do processo de footprinting ribossoma. Dado que a seleção de tamanho de RNA pode gerar potencial falso-positives de diferentes RNP que também poderia ser protectores de ARN de um modo semelhante, são necessários novos desenvolvimentos para melhorar ribossomal footprinting e adaptá-lo às abordagens específicos de células. Um desses métodos, o chamado Traduzindo Ribossoma A purificação por afinidade (TRAP) foi descrita em 2008 por Heiman et ai. e aplicado para isolar o translatome partir de um subconjunto de neurónios em ratos. Por epitopo de marcação de uma proteína ribossómica de uma forma específica do tipo de células-, polissomas pode ser purificado selectivamente sem o passo de dissociação de células trabalhoso e triagem. Neste caso, os ribossomal 60S da proteína L10A na superfície do ribossoma foi marcado com eGFP 13. Desde 2008, vários estudos têm utilizado este método em diferentes espécies, de ratos 14-19 a X. laevis 20,21, 22,23 e peixe-zebra Arabidopsis thaliana 24. O método TRAP também foi adaptada para o modelo de Drosophila e utilizado para purimRNAs de células neuronais e astrócitos 26 25 FY-específicos de células-tipo. O sistema de GAL4 / UAS binário versátil foi utilizado para expressar RpL10A GFP marcadas de um modo específico do tecido. Chefes de moscas adultas foram dissecados para realizar a seleção polysome a partir de células neuronais (alvo de pan-neural motorista elav-Gal4) e RNAs isolados foram sequenciados. O grande número de genes regulados positivamente correspondeu aos conhecidos a ser expresso no sistema nervoso, o que indica que a abordagem tem boa especificidade e levando-nos para adaptá-lo às populações de células raros (menos de 1% das células) presente no desenvolvimento de embriões de Drosophila . Dentro do modelo de Drosophila, a fase embrionária é um modelo de escolha para o estudo de processos de desenvolvimento, como os actores moleculares e movimentos morfogenéticas são evolutivamente conservados. As abordagens transcriptomic apenas específicos de tecidos conduzidos até agora neste modelo foram realizados utilizando células ou então nuclearrting e só foram capazes de estudar transcriptoma de estado estacionário 27-31, criando uma necessidade de métodos dedicados ao tecido / específico de células translatome profiling no embrião da mosca. Aqui nós relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado a embriões de Drosophila. Com este método, envolvidos-em-tradução de mRNA numa população de células muito restrita de cerca de 100 células musculares por embrião foi isolado com sucesso com alta qualidade e especificidade. O sistema / UAS GAL4 binário é usado para conduzir a expressão de RpL10A marcadas com GFP na subpopulação de músculos sem qualquer toxicidade, há fenótipos aparentes ou atraso de desenvolvimento, como mostrado anteriormente 25. Embriões de Drosophila possuem 30 músculos por hemisegmento que darão origem à musculatura da larva. Ao utilizar uma região reguladora descoberta na proximidade do gene identidade desleixo, 6 dos 30 músculos multi-nucleadas são segmentados. Neste ensaio, os ribossomas são imobilizados sobre o ARNm utilizando o alongamento traduçãoinibidor cicloheximida. Os extractos citossólicos são então utilizados para a purificação por afinidade com esferas magnéticas revestidas com anticorpo GFP. Qualidade do RNA purificado foi validado utilizando Bioanalyzer. Quantitative PCR de transcrição inversa (RT-qPCR) foi usada para determinar a especificidade e sensibilidade de isolamento de ARNm e demonstraram que o protocolo optimizado é altamente eficiente.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoil-sn-glicero-3-fosfocolina&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio</td><td>termocientífico&nbsp;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>BSA purificado 100X&nbsp;</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>TRNA de levedura&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Anticorpos Incorporados</td><td>75-132&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&nbsp;</td><td>Homogeneização</td><td>Roche 11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Lysis&nbsp;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease&nbsp;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio (KCl)</td><td>Applied Biosystem&nbsp;</td><td></td><td></td>AM96406</tr><tr><td>Cloreto de Magnésio (MgCl2)&nbsp;</td><td>Biossistema Aplicado&nbsp;</td><td></td><td></td>AM95306</tr><tr><td>Pasta de celulose não branqueada&nbsp;</td><td>VWR</td><td>115-2597&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Peneiras 112, 355, 710 um&nbsp;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&nbsp;</td><td></td><td></td>28948964</tr><tr><td>Pontas de filtro de baixa ligação&nbsp;</td><td>Tubo</td> livre de Rnase ClearLine <td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Biorreagente Fischer</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cicloheximida&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos inibidores de protease, Mini-Completos, sem EDTA&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, traduzindo ribossomo affinity purificação de populações de células raras<em&gt; drosophila</em&gt; os embriões

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

A medição dos níveis de mRNAs no processo de tradução em células individuais fornece informações sobre as proteínas envolvidas nas funções celulares em um determinado momento. O protocolo apelidado de Purificação de Afinidade de Ribosssomos de Tradução (TRAP) é capaz de capturar esse processo de tradução de mRNA de maneira específica do tipo de célula. Com base na purificação de afinidade de polissomos portadores de uma subunidade ribossômica marcada, o TRAP pode ser aplicado a análises de translatomo em células individuais, tornando possível comparar tipos de células durante o curso dos processos de desenvolvimento ou rastrear o progresso do desenvolvimento da doença e o impacto de terapias potenciais em nível molecular. Aqui relatamos uma versão otimizada do protocolo TRAP, chamada TRAP-rc (células raras), dedicada a identificar RNAs engajados na tradução de populações de células raras. O TRAP-rc foi validado usando o sistema de direcionamento Gal4 / UAS em uma população restrita de células musculares em embriões de Drosophila. Este novo protocolo permite a recuperação de RNA específico do tipo de célula em quantidades suficientes para análise global de expressão gênica, como microarrays ou RNA-seq. A robustez do protocolo e as grandes coleções de drivers Gal4 tornam o TRAP-rc uma abordagem altamente versátil com aplicações potenciais em estudos de todo o genoma específico da célula.

O sistema muscular somática embrionária Drosophila é composta por 30 músculos por hemisegmento, e cada músculo tem um conjunto específico de propriedades: Código de genes de identidade, posição, número de eventos de fusão, locais de fixação e inervação. Identificando ARNm traduzido em um subconjunto específico do músculo dará informação sobre as proteínas necessárias para formar estas características específicos do músculo. Utilizando o método à base de TRAP, o ARN a partir de uma subpopulação de músculos que expressam o gene de desleixo identidade foi purificado (Figura 1A-B). Uma preocupação importante desta abordagem é a qualidade e especificidade do RNA isolado. O protocolo otimizado relatado aqui habilitado recuperação sistemática de RNA de alta qualidade avaliada com análise Bioanalyzer. Os perfil mostra obtidos nenhuma degradação do RNA (Figura 1C). Em outros estudos desenvolvidos em torno do método TRAP, questões foram levantadas sobre a especificidade dos dados. Aqui nós improve método para suprimir o fundo ligada para a ligação não específica de ARN para os grânulos ou os tubos e pela optimização do tampão de lavagem. De modo a avaliar o nível de fundo e a eficiência de isolamento de células que expressam desleixo, que conduziu os ensaios de RT-qPCR em 3 repetições do mesmo estágio embrionário. Dobre-enriquecimentos de 4 genes diferentes (MEF2, desleixo, prospero, soxNeuro) foram calculados em relação a entrada e normalizado contra o gene RpL32 (Figura 1D). Estes resultados demonstraram enriquecimento de 2,3 vezes de MEF2 gene pan-musculares e enriquecimento de 5,6 vezes o gene de desleixo. Em contraste, os dois genes expressos no sistema neural foram reduzidos em comparação com a entrada. Valores muito similares foram observadas mudanças de dobragem em 3 réplicas biológicas, o que demonstra que o protocolo é robusta. Com desleixo-Gal4 condutor e começando com 1,5 g, cerca de 1,5x10 ^ 6 embriões foram obtidos que contêm 100 células de GFP / embrião (total de 150 x 10 ^ 6 positivacélulas). Depois de executar o experimento TRAP, o rendimento é de cerca de 25-45 ng de RNA específico dependendo do estágio de interesse. Este material é suficiente para executar a análise de micro-arranjo ou ARN-SEQ usando um protocolo de amplificação para construir uma biblioteca de ARN-SEQ. Eficiência dependerá fortemente a força do piloto usada para expressar RpL10A-EGFP. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figura 1. Qualidade e avaliação especificidade do RNA isolado-TRAP de Slouch-GAL4&gt; embriões UASRpL10A-EGFP. (AB) imagens confocais de uma fase de embrião-16 que mostra a expressão RpL10A-EGFP especificamente nas células musculares seis Slouch por hemisegmento (A). Co-localização de RpL10A-EGFP com o general marcador músculo Beta3tubulin é observado na foto merge (B). (C) Controle de qualidade de Traped RNA ran no Bioanalyzer mostrando perfeita integridade de rRNA 18S e 28S. Análise (D) RT-qPCR mostrando alta especificidade das experiências de mRNA isolado armadilha em 3 repetições biológicas do estágio-16 embriões. Dobre mudança é calculada em comparação com entrada e normalizado contra o gene RpL32. Transcrições Mef2 presentes em todas as linhagens musculares são 2,3 vezes enriquecido em comparação com entrada Considerando transcrições desleixo mais restritos são-5.6-fold enriquecido. Células neurais que expressam prospero e genes soxN estão esgotados 2,2 vezes e 5,5 vezes, respectivamente. As barras de erro representam o desvio padrão (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A Purificação de Afinidade de Ribosssomos Traduzível (TRAP) é capaz de capturar a tradução específica do tipo de célula do mRNA. Aqui relatamos o primeiro protocolo TRAP dedicado ao isolamento de mRNA em populações de células raras de embriões de Drosophila.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras<em&gt; Drosophila</em&gt; Os embriões

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

O objetivo geral deste procedimento é isolar o RNA envolvido na tradução de forma específica a um tipo celular em embriões de drosófila. Isso é realizado primeiramente coletando embriões de uma linhagem de mosca transgênica, permitindo a expressão específica de uma subunidade ribossômica marcada com GFP no tipo celular alvo, neste caso, as células musculares slouch. O segundo passo é gerar um lisado para obter uma preparação de polissomos contendo uma mistura de ribossomos marcados e não marcados.Em seguida, estima-se a concentração proteica no lisado e realiza-se a purificação por afinidade com microesferas conjugadas a anticorpos anti-GFP para capturar os complexos de RNA ribossômico do tipo celular de interesse. O passo final destina-se à extração e purificação de RNA. Por fim, são realizadas avaliações de qualidade e especificidade com um bioanalisador e R-T-Q-P-C-R, respectivamente.O RNA pode então ser usado para análise quantitativa global por sequenciamento de RNA ou microarranjos. A principal vantagem desta técnica em relação ao nosso método existente, como a triagem VX, é que ela não requer uma etapa laboratorial de dissociação celular. Pode ser realizada diretamente na bancada.É rápido e permite a identificação direta de RNA traduzido em uma população muito pequena de células, o que representa uma vantagem significativa para a compreensão da aquisição de propriedades celulares. Embora este método possa fornecer informações sobre a miogênese no embrião de Josephine, ele também pode ser aplicado a outros tecidos ou organismos modernos, como plantas, zebrafish ou camundongos, e poderia ajudar a acompanhar o impacto de tratamentos sobre a síntese proteica em casos de patologia. O procedimento será demonstrado por Benjamin Berta, um estudante de doutorado do meu laboratório. Após a engenharia, ambas as linhagens transgênicas de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo e o cruzamento para criar a linhagem transgênica duplo marcador, amplifique a linhagem primeiramente preparando oito gaiolas cilíndricas grandes contendo cerca de 40 gramas de moscas jovens por gaiola, o que corresponde a aproximadamente 180.000 moscas por gaiola.Prepare placas de Petri de 11 centímetros de diâmetro contendo uma mistura de ágar solidificado e suco de uva, com um terço da superfície coberto com pasta de levedura recém-preparada, e permita que as moscas depositem ovos nessas placas por uma hora. Repita este processo em mais dois conjuntos de placas frescas com suco de uva para permitir que as moscas esvaziem completamente seus ductos. Os embriões duplo transgênicos desejados do cruzamento serão depositados na quarta placa.Retire as placas contendo os embriões desejados das gaiolas e deixe-as incubar até o estágio de desenvolvimento desejado em temperatura ambiente. Neste procedimento, utiliza-se uma incubação de 13 horas. Em seguida, ressuspenda o conteúdo da placa com cerca de 50 mililitros de água utilizando uma escova.Se pare os embriões das moscas mortas passando o líquido por três peneiras de diâmetros 700, 355 e 112 mícrons. Enxágue os embriões coletados na peneira de menor diâmetro com água ionizada. Cubra os embriões com água sanitária a 4,5% em água ionizada por dois minutos e, em seguida, enxágue abundantemente com água ionizada por 30 a 60 segundos.Incube os embriões em PBS com 0,01% de T entre 20 e 100 microgramas por mililitro. Cyclo heide por cinco a dez minutos à temperatura ambiente com agitação. Após secar os embriões em folhas absorventes de celulose, transfira-os para tubos de microcentrífuga, pese os tubos e congele rapidamente os embriões por imersão em nitrogênio líquido.Nesta fase, os embriões secos podem ser armazenados por vários meses a menos 80 graus Celsius. Transfira 1,5 gramas dos embriões secos para tubos de 15 mililitros previamente resfriados, contendo quatro mililitros de tampão de extração de polissomos, e homogeneíze utilizando uma pipeta serológica estéril de 10 mililitros.Em seguida, distribua os embriões homogeneizados em dois tubos de dois mililitros pré-resfriados e triture os embriões em um moinho de esferas de alta velocidade e múltiplas direções. Configure para executar duas vezes por 10 segundos a 5.000 RPM, com uma pausa de 15 segundos entre cada ciclo. Após 10 minutos de centrifugação a 2.000 ×g, transfira o lisado para um tubo novo de microcentrífuga pré-resfriado sobre gelo.Adicione 10% de nonil fenoxipoli(etilenoglicol) ao sobrenadante S para obter uma concentração final de 0,1% e misture suavemente invertendo o tubo. Adicione 300 micromolar de DHPC para uma concentração final de 30 milimolar e misture suavemente invertindo o tubo. Incube a mistura em gelo por cinco minutos, misturando por inversão várias vezes durante a incubação.Após a incubação no gelo, prepare o sobrenadante pós-mitocondrial por centrifugação a quatro graus Celsius durante 10 minutos a 20.000 ×g. Após medir a concentração de proteína pelo método de Bradford e obter uma concentração proteica entre 60 e 80 miligramas por mililitro, transfira o SNAT para um tubo de microcentrífugo previamente resfriado e prossiga imediatamente para a etapa de pré-absorção. Ressuspenda as esferas magnéticas com agitação suave e, em seguida, transfira 30 microlitros de esferas para cada mililitro de lisado para um tubo de microcentrífugo.Colete as microesferas no ímã, remova o sobrenadante com pipeta e reconstitua as microesferas em 500 microlitros de tampão de extração de polissomos. Em seguida, recolha novamente as microesferas no ímã. Adicione então lisado embrionário e incube por uma hora a quatro graus Celsius em um agitador rotativo.Remova as esferas e coloque o sobrenadante em gelo até a etapa de imunopurificação. Reservando 100 microlitros do sobrenadante como amostra global de RNA para comparação com a amostra coletada após a imunopurificação, adicione um mililitro de lisado pré-absorvido a um tubo livre de RNA contendo 90 microlitros de esferas bloqueadas conjugadas ao anticorpo GFP. Incube a amostra a quatro graus Celsius por duas horas ou durante a noite com mistura suave em rotação end-over-end em um rotador de tubos após a incubação.Lave as microesferas primeiro centrifugando as microesferas remanescentes em uma centrífuga mini. Em seguida, recolha-as com um ímã, ressuspensas em 500 microlitros de tampão de lavagem e incube com agitação. Finalize a mistura após 10 minutos na câmara fria e, novamente, recolha as microesferas no ímã.Transfira as esferas para um tubo novo livre de RNAs pré-shield e lave mais duas vezes. Por fim, após recolher as esferas no ímã, prossiga para a extração de RNA adicionando um mililitro de TRIOL às esferas e realizando a extração de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, realize a purificação do RNA, utilizando um kit RNEZ micro conforme as instruções do fabricante.Para testar a especificidade do RNA retido, realize a transcrição reversa de três nanogramas de RNA imunopurificado e de RNA de entrada segundo procedimentos padrão. Em seguida, utilize o cDNA obtido para PCR quantitativa com conjuntos de primers específicos para o gene. Esta imagem confocal de um embrião na fase 16 mostra a expressão de RPL 10 A-E-G-F-P, especificamente nas seis células musculares slouch em cada segmento HEMI, sendo observada a colocalização de RPL 10 A-E-G-F-P com o marcador geral de músculo beta três tubulina.O RNA aprisionado foi analisado em um bioanalisador para fins de controle de qualidade. Observe a integridade perfeita dos RNAs ribossomais de dezoito s e vinte e oito s. Esta figura mostra os resultados de uma análise de RT-qPCR em três réplicas biológicas de embriões na fase 16, demonstrando a alta especificidade do mRNA isolado pelo método de aprisionamento.A alteração na metilação de FO foi calculada em comparação com a entrada e normalizada em relação ao gene RPL32. Dois transcritos presentes em todas as linhagens musculares apresentam enriquecimento de 2,3 vezes em relação à entrada, enquanto transcritos mais restritos de slouch apresentam enriquecimento de 5,6 vezes. Células neurais que expressam prospero e socks, bem como genes, estão empobrecidas em 2,2 vezes e 5,5 vezes, respectivamente, após seu desenvolvimento. Esta técnica abriu caminho para pesquisadores, particularmente na área da biologia do desenvolvimento, explorarem o comprometimento autônomo e a aquisição de propriedades celulares durante a diferenciação de embriões doof.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Um grande impedimento para análises bioquímicas dos ribossomos contendo nascente peptidil-tRNAs foi a presença de ribossomos outros nas mesmas amostras, os ribossomos não estão envolvidos na tradução da seqüência de mRNA específico que está sendo analisado. Nós desenvolvemos uma metodologia simples para purificar, exclusivamente, os ribossomos que contém a nascente peptidil-tRNA de interesse.

Isolamento de Ribossomos Traduzindo Contendo peptidil-tRNAs para análises funcionais e estruturais

O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta e econômica para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g) e a preparação de extratos de proteínas que podem ser utilizados em aplicações proteômicas a jusante, como a purificação por afinidade - espectrometria de massa (AP-MS ).

Preparação em média<em&gt; Drosophila</em&gt; Extractos de embrião para experiências proteômicas

Nós apresentamos uma aproximação para purificar o mRNA ribosome-ligado das pilhas endothelial vasculares (ECS) diretamente no cérebro do rato, nos tecidos do pulmão e do coração através do Tag genético EC-specific da proteína verde aumentada da fluorescência (EGFP) nos ribossomas em combinação com a purificação do RNA .

Traduzindo a purificação de afinidade Ribossome (TRAP) para isolamento de RNA de células endoteliais in vivo

Traduzir purificação de afinidade costela (TRAP) oferece a possibilidade de dissecar programas de desenvolvimento com processamento mínimo de órgãos e tecidos. O protocolo produz RNA de alta qualidade a partir de células direcionadas com uma subunidade ribossômica rotulada como proteína fluorescente verde (GFP). Ferramentas de análise a jusante, como qRT-PCR ou RNA-seq, revelam perfis de expressão específicos de tecido e célula.

Traduzindo a Purificação da Afinidade ribossófica (TRAP) para investigar o desenvolvimento raiz arabidopsis thaliana em uma escala específica de tipo de célula

Aqui, descrevemos a imunoprecipitação de ribossomos e o RNA associado de populações selecionadas de células de germes de camundongos machos adultos usando o sistema RiboTag. A reprodução estratégica e a imunoprecipitação cuidadosa resultam em resultados limpos e reprodutíveis que informam sobre o traduzo meme das células germinativas e fornecem uma visão dos mecanismos dos fenótipos mutantes.

Imunoprecipitação ribotag nas células germinativas do rato macho

As interações co-translacionais desempenham um papel crucial nas modificações da cadeia nascente, na segmentação, na dobra e nas vias de montagem. Aqui, descrevemos o Perfil Ribossomo Seletivo, um método para in vivo, análise direta dessas interações no modelo eucariote Saccharomyces cerevisiae.

Identificação Global de Redes de Interação Co-Translacional por Perfil Seletivo Ribosome

Este protocolo tem como objetivo isolar mRNAs ribossomais de tradução específicos do tipo celular usando o modelo de camundongo NuTRAP.

Isole RNAs específicos do tipo celular de amostras de tecido heterogêneo congeladas sem triagem celular

Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, neste protocolo, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endogenso Drosophila TRP.

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

A Biotinilação Iluminada Restrita por Localização específica (ALIBi) é um método optogeneticamente ativado inovador desenvolvido para marcar e purificar populações subcelulares de ribossomos para sequenciamento a jusante e análise proteômica.

Isolamento de Subpopulações Subcelulares de Ribossomo Baseado em Biotinilação Iluminada Aprimorada por Localização Específica de Etiquetas Peptídicas Recombinantes

O protocolo descreve o método de hibridização in situ de fluorescência sensível a polimorfismos de nucleotídeo único (SNP-FISH) para distinguir transcritos de RNA ribossômico derivados do locus de DNA ribossômico do cromossomo X ou Y em Drosophila melanogaster.

Detecção de FISH sensível ao polimorfismo de nucleotídeo único da transcrição de RNA ribossômico específico do locus em Drosophila melanogaster

Aqui, fornecemos detalhes sobre como preparar lisados e realizar tradução in vitro usando embriões de Drosophila .

Tradução de mRNA In Vitro Livre de Células em Lisados de Drosophila

Aprenda a isolar mRNA traduzido em populações celulares raras de embriões de Drosophila usando o protocolo TRAP. Este método permite capturar tradução específica por tipo celular sem dissociação.

TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras

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