TRAP-rc, Traduzindo Ribossomo Affinity Purificação de populações de células raras Drosophila Os embriões

O objetivo geral deste procedimento é isolar o RNA envolvido na tradução de uma maneira específica do tipo celular em embriões de drosófila. Isso é feito primeiro coletando embriões de uma linhagem de mosca transgênica, permitindo a expressão específica de uma subunidade ribossômica marcada com GFP no tipo de célula alvo, neste caso, as células musculares desleixadas. O segundo passo é gerar um lisado para obter uma preparação polissômica contendo uma mistura de ribossomos marcados e não marcados.

Em seguida, a concentração de proteína no lisado é estimada e a purificação de afinidade é realizada com grânulos acoplados a anticorpos GFP para capturar complexos de RNA de ribossomo do tipo de célula de interesse. A etapa final é dedicada ao triol, RNA, extração e purificação. Em última análise, as avaliações de qualidade e especificidade são realizadas com um bioanalisador e R-T-Q-P-C-R, respectivamente.

O RNA pode então ser usado para análise quantitativa global por sequenciamento de RNA ou microarrays. A principal vantagem desta técnica do nosso método existente, como a classificação VX, é que ela não requer uma etapa labológica de dissociação celular. Pode ser realizado no banco.

É rápido e permite a identificação direta do RNA traduzido em populações muito pequenas de células, o que é um benefício de medida para a compreensão da aquisição de propriedades celulares. Mesmo que este método possa fornecer informações sobre a miogênese no embrião de Josephine, ele também pode ser aplicado a outros tecidos ou organismos modernos, como plantas, zebras, peixes ou camundongos, e também pode ajudar após o impacto do tratamento na síntese de proteínas em caso de patologia. Demonstrando o procedimento estará Benjamin Berta, um estudante de doutorado do meu laboratório Após a engenharia, ambas as linhas transgênicas de acordo com as instruções na parte escrita do protocolo e o cruzamento para criar a linha transgênica cruzada dupla da armadilha, amplificar a linha preparando primeiro oito grandes gaiolas populacionais cilíndricas contendo cerca de 40 gramas de moscas jovens por gaiola, o que corresponde a cerca de 180.000 moscas por gaiola.

Prepare placas de Petri de 11 centímetros de diâmetro contendo uma mistura de ágar solidificado e suco de uva com um terço da superfície coberta com pasta de fermento recém-feita e deixe as moscas botarem ovos nessas placas por uma hora. Repita esse processo em mais dois conjuntos de pratos de suco de uva fresco para permitir que as moscas esvaziem completamente seus ucts. Os embriões transgênicos duplos desejados do cruzamento serão colocados na quarta placa.

Remova as placas contendo os embriões desejados das gaiolas e deixe-os incubar até o estágio de desenvolvimento desejado à temperatura ambiente. Uma incubação de 13 horas é usada aqui. Em seguida, ressuspenda o conteúdo da placa com cerca de 50 mililitros de água usando um pincel.

Separar os embriões das moscas mortas passando o líquido por três peneiras de 700, 355 e 112 mícrons de diâmetro. Enxágue os embriões coletados na peneira de menor diâmetro com a água ionizada. Coate os embriões em água sanitária a 4,5% na água ionizada por dois minutos e, em seguida, enxágue abundantemente com a água ionizada por 30 a 60 segundos.

Incubar os embriões em PBS 0,01%T entre 20 e 100 microgramas por mililitro. Ciclo heide por cinco a 10 minutos em temperatura ambiente com agitação. Depois de secar os embriões em folhas absorventes de celulose, transfira-os para tubos de microcentrífuga, pese os tubos e congele os embriões por imersão em nitrogênio líquido.

Nesta fase, os embriões secos podem ser armazenados por vários meses a 80 graus Celsius negativos. Transferência de tendência de 1,5 gramas dos embriões secos para tubos pré-resfriados de 15 mililitros, contendo quatro mililitros de extração de polissomos, tampão e homogeneizado. Usando uma pipeta sorológica estéril de 10 mililitros.

Em seguida, espalhe os embriões homogeneizados em dois tubos pré-resfriados, dois mililitros e triture os embriões em um moedor de esferas multidirecional de velocidade rápida. Configurado para funcionar duas vezes por 10 segundos a 5.000 RPM com uma pausa de 15 segundos entre cada ciclo. Após 10 minutos de centrifugação a 2000 G, transferir o lisado para um novo tubo de microcentrífuga pré-refrigerado sobre gelo.

Adicione 10% não P 40 ao sobrenadante S até uma concentração final de 0,1% e misture suavemente invertendo o tubo. Adicionar 300 micromolares de DHPC a uma concentração final de 30 milimolares e misturar suavemente invertendo o tubo. Incubar a mistura no gelo durante cinco minutos, misturando várias vezes por inversão durante a incubação.

Após a incubação no gelo. Preparar o supinato pós-mitocondrial por centrifugação a quatro graus Celsius durante 10 minutos a 20 000 G.Depois de medir a concentração de proteínas pelo método de Bradford e obter uma concentração de proteínas entre 60 e 80 miligramas por mililitros, transferir o SNAT para um novo tubo de microcentrífuga pré-refrigerado e prosseguir imediatamente para a fase de pré-absorção. Ressuspenda os grânulos magnéticos com agitação suave e, em seguida, transfira 30 microlitros de grânulos para cada mililitro de lisado em um tubo de microcentrífuga.

Recolha as esferas no ímã, pipete o snat e ressuspenda as contas e 500 microlitros de tampão de extração de polissomos. Em seguida, colete as contas no ímã. Novamente, adicione embrionário, lisado e incube por uma hora a quatro graus Celsius em um rotador.

Remova as contas e coloque o agente supino no gelo até a etapa de imunopurificação. Reservando 100 microlitros do supinato como amostra global de RNA para comparação com a amostra coletada após a imunopurificação para imunopurificar a amostra, adicione um mililitro de lisado pré-absorvido a um tubo livre de RNA contendo 90 microlitros de grânulos bloqueados acoplados ao anticorpo GFP. Incubar a amostra a quatro graus Celsius por duas horas ou durante a noite com uma mistura suave de ponta a ponta em um rotador de tubo após a incubação.

Lave as contas girando primeiro as contas restantes em uma mini centrífuga. Em seguida, colete em um ímã ressuspenda em 500 microlitros de lavagem, tampone e incube por e mais. Termine de misturar 10 minutos na câmara fria e, novamente, colete as contas no ímã.

Transfira as contas para um tubo livre de RNAs R pré-escudo novo e lave mais duas vezes. Finalmente, depois de coletar as esferas no ímã, prossiga para a extração de RNA adicionando um mililitro de TRIOL às esferas e realizando a extração de acordo com as instruções do fabricante. Siga isso pela limpeza de RNA, usando um micro kit RNEZ de acordo com as instruções do fabricante.

Para testar a especificidade do RNA aprisionado, execute a transcrição reversa em três nanogramas de RNA imunopurificado e de entrada de acordo com os procedimentos padrão. Em seguida, use o CDNA obtido para QPCR com conjuntos de primers específicos do gene. Esta imagem confocal de um embrião em estágio 16 mostra a expressão de RPL 10 A-E-G-F-P, especificamente nas seis células musculares desleixadas em cada segmento HEMI, observa-se a colocalização de RPL 10 A-E-G-F-P com o marcador muscular geral beta três tubulina.

O RNA aprisionado foi executado em um bioanalisador para fins de controle de qualidade. Observe a integridade perfeita de um RNA ribossômico de oito s e dois oito s. Esta figura mostra os resultados de uma análise de RT QPCR em três réplicas biológicas de embriões em estágio 16 e demonstra a alta especificidade do mRNA isolado por armadilha.

A alteração de FO foi calculada em comparação com a entrada e normalizada em relação à metanfetamina do gene RPL 32. Dois transcritos presentes em todas as linhagens musculares são 2,3 vezes enriquecidos em comparação com a entrada, enquanto os transcritos desleixados mais restritos são 5,6 vezes enriquecidos células neurais que expressam prospero e meias e genes são esgotados 2,2 vezes e 5,5 vezes, respectivamente, após seu desenvolvimento. Essa técnica abriu caminho para pesquisadores, particularmente no campo da biologia do desenvolvimento, explorarem o compromisso de autoajuda e a aquisição de propriedades celulares durante a diferenciação de embriões doof.