Name: Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: Aprenda a criar cromossomos artificiais bacterianos contendo cDNA completo do vírus da encefalite japonesa. Este método permite resgatar partículas virais infecciosas para estudos de replicação viral e desenvolvimento de vacinas geneticamente definidas.

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Os autores gostariam de agradecer ao fundo de Ciência, Tecnologia e Pesquisa de Utah pelo apoio ao YML e às doações da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (2009-0069679 e 2010-0010154) pelo apoio ao SIY. Esta pesquisa foi apoiada pela Estação Experimental Agrícola de Utah, Universidade Estadual de Utah, e aprovada como artigo de periódico número UAES # 8753. Além disso, os autores agradecem à Dra. Deborah McClellan pela assistência editorial.

Os autores declararam que não têm interesses financeiros concorrentes.

O protocolo corrente foi utilizado com sucesso para gerar full-length clones de ADNc infecciosos de duas estirpes diferentes (CNU / LP2 27 e 14 SA -14-2 28) do JEV, um flavivírus cujo ADNc funcional demonstrou ser inerentemente difícil de construir e propagar por causa da toxicidade da célula hospedeira e a instabilidade genética do ADNc clonado 8,74-76 Este protocolo envolve três componentes principais:. em primeiro lugar, maximizando a síntese / amplificação de uma cópia fiel ADNc do ARN viral de alta fidelidade utilizando transcriptase reversa / ADN-polimerase; Em segundo lugar, a clonagem da região prM-E viral contendo sequências de codificação tóxicos (dados não publicados) 74,77,78 em um nível muito baixo número de cópias do vector BAC de cDNA inicial de subclonagem para os passos de comprimento completo de ADNc de montagem final; e em terceiro lugar, utilizando um vector de clonagem BAC que pode acomodar um ADN estranho com uma dimensão média de 120-350 kb, que, aparentemente, 19-21 tolera maiores ADN InSerts do que os outros vectores de clonagem. Esta abordagem de clonagem será geralmente aplicável a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva, particularmente aqueles com um grande genoma de ARN de ~ 10 a 32 kb. Geração de um ADNc de clone infeccioso é um passo chave no desenvolvimento de um sistema de genética inversa de vírus de ARN, especialmente para vírus de ARN de cadeia positiva, porque o seu genoma actua como ARNm viral que é traduzido em proteínas por ribossomas da célula hospedeira. Assim, a replicação virai pode ser iniciada pela introdução de um genoma de comprimento molécula de ARN derivado de ADNc numa célula hospedeiro susceptível. A disponibilidade de um clone infeccioso de cDNA JEV, quando combinado com a tecnologia de ADN recombinante, tem aumentado a compreensão dos vários aspectos do ciclo de vida virai, a nível molecular, tais como a expressão de genes e replicação do genoma 73,79. 63,64 Além disso, uma de comprimento completo JEV clone de ADNc tem provado ser uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de vacinas antivirais 28 e vectores de entrega de genes. &lt;sup&gt; 80,81 Tal como acontece com todos os vírus de ARN de cadeia positiva, existem vários passos críticos na construção de um ADNc funcional de confiança para o JEV a partir do qual os ARN altamente infecciosas podem ser sintetizados in vitro. Idealmente, a sequência dos ARN transcritos sintéticos a partir de um clone do ADNc de comprimento completo deve ser idêntico ao do ARN genómico viral, particularmente os 5&#39;- e 3&#39;-terminal de sequências que são necessárias para a iniciação da replicação de ARN viral . 60-62 No protocolo actual, o autêntico 5&#39;- e 3&#39;- extremidades foram assegurada colocando a sequência de promotor SP6 a montante do primeiro nucleótido adenina do genoma viral e o posicionamento de um local de restrição único artificial Xbal a jusante do último timina nucleótidos do genoma virai, respectivamente. Tampado RNAs sintéticos com o autêntico 5 &#39;e 3&#39; foram produzidos por transcrição de um Xba I-linearizado e tratou-MBN cDNA te run-offmplate utilizando polimerase SP6 ARN preparado com o m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Um análogo de tampão. Este protocolo pode ser modificado de várias maneiras. Para transcrição in vitro, uma outra polimerase de ARN do bacteriófago (por exemplo, T3 ou T7) pode ser utilizado em conjunto com a sua sequência promotora bem definida. 27 Como um local de escoamento, um local de restrição diferente pode ser utilizada se não está presente em do genoma viral e de ARN sintética se a partir do ADNc linearizado termina com o autêntico extremidade 3 &#39;. A importância da sequência de nucleótidos da extremidade 3 &#39;foi demonstrado por uma diminuição ~ 10 vezes na infectividade de ARN, quando uma ARN sintético contém três ou quatro nucleótidos de vírus não relacionados, na sua extremidade 3&#39;. 27 Em uma reacção de transcrição in vitro, tanto o m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) A e m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) G tampa analógico podem ser utilizados igualmente bem, embora o último lugares um não relacionado nucleótido G adicional a montante do viral 5 &#39;-end, mas issodisso não altera a capacidade de infecção ou replicação de RNA sintético. 27 Além disso, a remoção do molde de ADNc a partir dos transcritos de ARN por digestão com DNase I não é necessário para testes de ARN de infecciosidade, porque o modelo de cDNA em si não é infecciosa. 27 A tecnologia BAC foi agora aplicada à construção de clones de cDNA infecciosos para um punhado de vírus ARN de cadeia positiva, ou seja, dois JEVs, CNU / LP2 27 e SA 14 -14-2 28 (tamanho do genoma, ~ 11 kb); dois vírus da dengue, BR / 90 26 e NGC 29 (~ 11 kb); o vírus da diarréia viral bovina, SD1 (~ 12 kb); 25 dois vírus da peste suína clássica, C e Paderborn (~ 12 kb); 24 o vírus da doença da fronteira, Gifhorn (~ 12 kb); 24 o vírus suíno síndrome reprodutiva e respiratória , PL97-1 / LP1 (~ 15 kb); 30 o vírus da gastroenterite transmissível, PUR46-MAD (~ 29 kb); 16 o felino vírus da peritonite infecciosa,DF-2 (~ 29 kb); 32 a grave coronavírus Síndrome Respiratória Aguda, Urbani (~ 30 kb); 9 do Oriente Médio respiratória síndrome coronavírus, a EMC / 2012 (~ 30 kb); 17 eo coronavírus humano, OC43 (~ 31 kb) 31 A principal vantagem da utilização de BACs para a construção de cDNA é a elevada estabilidade genética das grandes, 1- ou 2-cópia BAC plasmídeos.; No entanto, a natureza intrínseca da sua número extremamente baixo número de cópias é também uma grande desvantagem, devido a rendimentos muito baixos de DNA de BAC e a consequente redução na pureza do DNA de BAC com respeito à sede de ADN cromossómico. No protocolo atual, o rendimento de DNA BAC é maximizada pela crescente E. coli DH10B transformada com o pBAC BAC infecciosa / SA 14 -14-2 em um meio rico em nutrientes, 2xYT. Apesar deste esforço, o rendimento médio é de apenas ~ 15 ug de DNA BAC a partir de 500 ml de caldo de 2xYT. Além disso, a pureza do DNA de BAC é melhor conseguido através da utilização de CsCl-EtBr centrifugação de gradiente de densidade para a purificação, Em vez do plasmídeo de isolamento à base de coluna utilizada. No entanto, é importante ter em mente que a E. transformado BAC- coli não deve crescer demais porque pode pôr em perigo a estabilidade genética do cDNA clonado, e um crescimento mais elevado não conduz necessariamente a maiores rendimentos ou DNA BAC maior pureza. O protocolo descrito aqui é um, e método aerodinâmico eficiente otimizada para a construção e propagação de um full-length cDNA infeccioso clone geneticamente estável como um BAC para JEV, um procedimento que se pensava praticamente impossível. Esta mesma estratégia de clonagem pode também ser aplicado a muitos outros vírus de ARN de cadeia positiva. Em geral, os clones de ADNc infecciosos permitir-nos introduzir uma variedade de mutações (por exemplo, deleções, inserções e mutações pontuais) num genoma de ARN viral para estudar as suas funções biológicas na replicação virai e patogénese. Este sistema de genética inversa à base de ADNc faz com que seja possível desenvolver e TESt vacina e candidatos terapêuticos que visam um factor de virulência (s) de um vírus de ARN de cadeia positiva de interesse particular. Além disso, esta tecnologia de cDNA infeccioso pode também ser utilizado como um vector virai, capaz de expressar um gene estranho (s) de interesse para muitas aplicações na investigação biomédica.

Para virologistas de ARN, o advento da tecnologia de DNA recombinante no final de 1970, foi possível converter os genomas virais de ARN em clones de ADNc, que pode então ser propagada como plasmídeos em bactérias para a manipulação genética de vírus de ARN. 1 O primeiro vírus de ARN ser molecularmente clonado foi Qp bacteriófago, um vírus de ARN de cadeia positiva que infecta Escherichia coli. Um plasmídeo contendo uma cópia de ADNc completa do ARN genómico Qp deu origem a Qp fagos infecciosos quando introduzido em E. coli. 2 Pouco tempo depois, esta técnica foi aplicada para poliovírus, um vírus de ARN de cadeia positiva de seres humanos e animais. Um plasmídeo que possui um ADNc de comprimento completo do ARN genómico poliovírus foi infecciosas quando transfectadas em células de mamífero e é capaz de produzir viriões infecciosos 3 Nesta abordagem &quot;lançou-ADN&quot;, os ADNc clonados deve ser transcrita intracelularmente para iniciar a replicação do ARN virai.;no entanto, não está claro como a transcrição é iniciada e como as transcrições são transformados com a sequência correcta viral. Esta preocupação tem levado ao desenvolvimento de uma alternativa &quot;lançou-ARN&quot; abordagem, em que uma cópia de cDNA do genoma completo de RNA viral é clonado sob um promotor reconhecido por uma E. coli ou ARN polimerase do fago para a produção de ARN sintéticos in vitro com definido 5 &#39;e 3&#39;, que se submetem a um ciclo completo de replicação virai quando introduzidos em células hospedeiras. 4,5 O primeiro sucesso com esta abordagem foi relatado para brome vírus do mosaico , 6,7 um vírus de ARN de cadeia positiva de plantas. Desde então, a abordagem lançada ARN foi desenvolvido para uma grande variedade de vírus de ARN de cadeia positiva, incluindo calicivírus, alfavírus, flavivírus, coronavírus, e arterivï¿½us. 1,4,5,8 Em ambos o ADN e ARN-lançado sistemas de genética inversa, a construção de um full-clone de ADNc de comprimento é a chave para a geração de ADN ou ARN infecciosos de vus de ARN de cadeia positiva, mas torna-se um considerável desafio técnico, conforme o tamanho do genoma viral aumenta. 9-17 Em particular, um grande genoma de ARN de ~ 10 -32 kb apresenta três principais obstáculos para a clonagem de um ADNc de comprimento completo funcional. 18 A primeira dificuldade é a síntese de um cDNA cópia fiel, uma vez que a fidelidade da RT-PCR é inversamente proporcional ao comprimento do RNA viral. O segundo obstáculo é a presença de sequências potencialmente tóxicos, uma vez que as moléculas de RNA longas são mais prováveis ​​de conter sequências inesperadas capazes de fazer o fragmento de cDNA em plasmídeos instáveis ​​em E. coli. O terceiro e mais importante causa é a disponibilidade de um vector adequado, uma vez que é difícil encontrar um vector de clonagem que pode alojar um inserto de cDNA viral de&gt; 10 kb. Ao longo das últimas três décadas, essas barreiras foram superadas por vários avanços na enzimologia, metodologia, umad vectorology. 1,4,5,8 Destes, o desenvolvimento mais promissor e inovador é a clonagem de grandes vírus de ARN de cadeia positiva cromossomas artificiais bacterianos (BACs como infecciosas). O vector BAC é um plasmídeo de baixo número de cópias de clonagem (1-2 cópias / célula), com base na E. coli factor de fertilidade, com um tamanho médio de inserção de ADN de 19-21 kb ~ 120-350 Um fragmento de DNA é inserida no vector BAC de uma forma semelhante à clonagem em vectores de clonagem gerais.; os clones BAC resultantes são estáveis ​​ao longo de muitas gerações, em E. coli. 22,23 Até à data, a tecnologia BAC foi usado para criar clones de ADNc infecciosos para&gt; 10 membros de três famílias de vírus ARN de cadeia positiva, isto é, Flaviviridae, 24-29 Arteriviridae, 30 e Coronaviridae. 9,16,17 , 31,32 Usando vírus da encefalite japonesa (JEV) como um exemplo, o presente trabalho relata os procedimentos detalhados que podem serutilizado para construir um de comprimento completo de BAC infeccioso geneticamente estável para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva. JEV é um flavivírus zoonótica 33 que é transmitida em natureza entre aves, porcos e outros hospedeiros vertebrados por vectores de mosquito. 34,35 Nos seres humanos, a infecção pode causar o JEV grave doença neurológica encefalite japonesa frequentemente fatal (JE), 36 que ocorre na Ásia e partes do Pacífico Ocidental, 37,38 com uma incidência anual estimada de ~ 50,000-175,000 casos clínicos. 39,40 O genoma do JEV é uma ~ 11 kb,, molécula de RNA de cadeia simples de sentido positivo e consiste em uma única estrutura de leitura aberta (ORF) flanqueada por duas regiões não codificantes (NCRs) nas extremidades 5 &#39;e 3&#39;. A ORF codifica 41,42 uma poliproteína que é clivada por proteases do hospedeiro e virais para produzir as proteínas individuais 10, designado C, prM, E, NS1, NS2a, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 na direcção N- para C-terminal. 34,43,44 Além disso, uma mensagemXtended forma de NS1 (NS1 &quot;) é expresso por -1 frameshifting ribossomal nos codões 8-9 da NS2a. 45,46 Destes 11 proteínas, as três proteínas estruturais (C, prM e E) são essenciais para a formação de infeccioso viriões, 47,48 e os restantes oito proteínas não estruturais (NS1 a NS5, e NS1 &quot;), são essenciais para a replicação viral de ARN, a montagem de partícula 49-51, 52-56 e 57-59 a imunidade inata evasão. Tanto a 5 &#39;e 3 &#39;NCRs contêm sequências conservadas estruturas primárias e secundárias de ARN forma terciária / 60-62, que são importantes para modular a replicação do ARN virai 63,64. Este protocolo descreve as ferramentas, métodos e estratégias para a geração de um de comprimento completo de BAC infeccioso do JEV SA 14 -14-2. 28 Este clone de BAC funcional contém uma cópia de cDNA completa do ARN genómico JEV, 65, que é abarcado por um promotor para a polimerase de ARN de SP6 a montantedo vírus da extremidade 5 &#39;e um local de restrição Xbal único a jusante da extremidade 3&#39; viral para a transcrição in vitro run-off. Esta tecnologia BAC é aplicável à construção de um clone molecular de cDNA totalmente funcional para uma variedade de vírus de ARN de cadeia positiva.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Caldo de Clonagem Molecular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377</td><td></td></tr><tr><td>[3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioativo</td></tr><tr><td>Tubo de 50 ml</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa de 250 ml Beckman</td><td>Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose (Baixo Ponto de Fusão)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>Novo Inglaterra BioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>Butanol Fisher</td><td>Scientific</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Césio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>Carcinogênico</td></tr><tr><td>DE-81 Papel de Filtro</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td> <td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Brometo de Etídio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>Coluna de Filtro Tóxico e altamente mutagênico</td></tr><tr><td>(Kit Maxiprep de Plasmídeo)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético Glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>Glicose</td></tr><tr><td>Irritante</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Glicogênio&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>DNA Polimerase de Alta Fidelidade</td><td>New England BioLabs</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>Álcool Isoamílico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9392</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol Inflamável&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Caldo LB inflamável</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de lítio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Transcriptase reversa</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease de feijão mungo</td><td>New England BioLabs</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>Agulha (18G, 20G)</td> <td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>de risco biológico (resíduos perfurocortantes)</td></tr> <tr><td>NotI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0189S Oligonucleotídeo</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Integrado DNA</td><td>Technologies Síntese</td><td></td>de oligonucleotídeos personalizados</tr><tr><td>PacI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Fenol (saturado por tampão)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>Tóxico e altamente corrosivo</td></tr><tr><td>Fenol:Clorofórmio:Álcool isoamílico</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>Tóxico e altamente corrosivo</td></tr><tr><td>Fenol:Isotiocianato de guanidina</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>Tóxico, corrosivo e irritante</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Potássio</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>Inibidor de RNase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>Conjunto rNTP Tubo</td> de Polipropileno Selado <td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>(16 &vezes; 76 mm)& nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>New England BioLabs</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de Sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA Polimerase</td><td>Coluna de Rotação New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>(Kit Miniprep de Plasmídeo)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>Seringa K2100-11</td><td></td></tr><tr><td></td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (levedura)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>New England BioLabs</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo<</td><td>strong>Comentários</td></tr><tr><td>2. Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alpha Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Cônico (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>Cristal Violeta&nbsp;</td><td>Prato de Cultura Sigma-Aldrich</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>(150 mm)&nbsp;</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta (Gap de 2 mm)</td> <td>Aparelho Harvard</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>Glutamina tóxica e cancerígena</td></tr><tr><td></td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>Placa de seis poços</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Life Technologies ( Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vitaminas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>3. Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Electrophoresis System</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Mesa&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Lâmpadas Ultravioleta de Onda Longa (Portátil)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga de Mesa</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>Scientific Industries</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Jeio Tech</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

bacteriana artificial chromosomes: uma ferramenta genómica funcional para o estudo da positivo-fio vírus rna

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

A genética reversa, uma abordagem para resgatar vírus infecciosos inteiramente de um cDNA clonado, revolucionou o campo dos vírus de RNA de fita positiva, cujos genomas têm a mesma polaridade do mRNA celular. O sistema de genética reversa baseado em cDNA é um método seminal que permite a manipulação direta do RNA genômico viral, gerando vírus recombinantes para estudos moleculares e genéticos de elementos de RNA viral e produtos gênicos na replicação e patogênese viral. Ele também fornece uma plataforma valiosa que permite o desenvolvimento de vacinas geneticamente definidas e vetores virais para a entrega de genes estranhos. Para muitos vírus de RNA de fita positiva, como o vírus da encefalite japonesa (JEV), no entanto, os cDNAs clonados são instáveis, representando um grande obstáculo para a construção e propagação do cDNA funcional. Aqui, o presente relatório descreve as considerações estratégicas na criação e amplificação de um cDNA infeccioso JEV de comprimento total geneticamente estável como um cromossomo artificial bacteriano (BAC) usando os seguintes procedimentos experimentais gerais: isolamento de RNA viral, síntese de cDNA, subclonagem e modificação de cDNA, montagem de um cDNA de comprimento total, linearização de cDNA, in vitro Síntese de RNA e recuperação de vírus. Este protocolo fornece uma metodologia geral aplicável à clonagem de cDNA de comprimento total para uma variedade de vírus de RNA de fita positiva, particularmente aqueles com um genoma de >10 kb de comprimento, em um vetor BAC, a partir do qual RNAs infecciosos podem ser transcritos in vitro com uma RNA polimerase bacteriófaga.

Para todos os vírus de ARN de cadeia positiva, a fiabilidade e eficiência de um sistema de genética inversa dependerá da estabilidade genética de um ADNc de comprimento completo clonado, cuja sequência é equivalente à sequência de consenso do ARN genómico virai. 27 A Figura 1 mostra uma de cinco passo estratégia para a construção de um cDNA infeccioso de comprimento completo como um BAC para o JEV SA -14-2 14 28: Passo 1, a purificação do RNA virai a partir do sobrenadante de cultura de células de JEV-infectadas células BHK-21 (Figura 1A); Passo 2, a síntese de quatro fragmentos amplificados de ADNc que se sobrepõem (F1 a F4) abrangendo todo o genoma viral (Figura 1B); Passo 3, subclonagem de cada um dos quatro fragmentos de ADNc contíguos num vector BAC, criando pBAC / F1 para pBAC / F4 (Figura 1C); Passo 4, a modificação de ADNc clonados para transcrição in vitro run-off com a ARN-polimerase SP6, isto é, colocando um SP6sequência de promotor imediatamente a montante da extremidade 5 &#39;virais (pBAC / F1 SP6), eliminação de uma pré-existente sítio interno Xba I no nucleótido 9131 através da introdução de uma mutação pontual silenciosa, 9134 Um → T (pBAC / F3 KO), e inserindo um local de run-off novo artificial Xbal imediatamente a jusante da extremidade 3 &#39;viral (pBAC / F4 RO) (Figura 1D); 28 e Passo 5, um conjunto de comprimento completo SA-14 -14-2 ADNc BAC, pBAC / SA 14 -14-2 (Figura 1E). A Tabela 1 lista os oligonucleótidos utilizados neste procedimento de clonagem. Para a construção de um JEV ADNc funcional, o primeiro passo importante é a síntese de quatro fragmentos de ADNc sobrepostos usando o RNA viral purificado como um molde para a RT-PCR. A Figura 2 proporciona um resultado representativo para os quatro produtos de RT-PCR que eram a electroforese em 0,8%em gel de agarose. Este gel demonstra claramente que um de comprimento completo JEV ADNc é amplificado em quatro fragmentos de ADNc que se sobrepõem. Ocasionalmente, as reacções de RT-PCR pode produzir um ou mais produtos adicionais específicos do vírus ou não específicos que são principalmente menor do que o produto esperado, porque o recozimento de inespecífica de iniciadores durante a síntese de cDNA / amplificação. Por outro lado, pouco ou nenhum produto esperado de RT-PCR será amplificado por causa da contaminação com RNase acidental durante o isolamento de ARN viral ou desempenho inadequado do RT-PCR. O próximo passo chave é a clonagem e modificação de um comprimento total de ADNc parcial ou JEV em BAC, que é um procedimento relativamente simples que utiliza técnicas de ADN recombinante convencionais. 69 A Figura 3 apresenta um resultado representativo para a purificação do clone de BAC contendo um cDNA de comprimento total de JEV SA 14 -14-2 por faixas em um gradiente de CsCl-EtBr.Nesta experiência, após a centrifugação durante 16 horas a 401.700 × g, duas bandas distintas, ou seja, a E. coli ADN cromossómico de cima e o ADN super-enrolado plasmídeo BAC abaixo, são visíveis no meio do tubo sob luz ultravioleta de onda longa. Um volume mínimo (~ 400 mL) a banda de DNA de BAC inferior foi cuidadosamente recolhido por abrir um furo com uma seringa, no lado do tubo. Subsequentemente, o EtBr foi extraída a partir do DNA de BAC por extracção com butanol, e o DNA de BAC livre de EtBr foi concentrado por precipitação com etanol. O passo final é a determinação da infecciosidade específica dos ARN transcritos sintéticos in vitro a partir de comprimento completo SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA -14-2 14) após transfecção de ARN em células permissivas (Figura 4). Este passo envolve três passos sequenciais: 1, Passo de linearização de comprimento completo SA 14 -14-2 cDNA no extremo 3 &#39;-end do genoma viral (Figura 4A); Passo 2, a produção de RNAs sintéticos a partir do cDNA linear, através do escoamento de transcrição (Figura 4B); e Passo 3, salvamento dos vírus recombinantes em células BHK-21 transfectadas com os ARN sintéticos (Figura 4C). Experimentalmente, dois clones independentes de pBAC / SA 14 -14-2 foram linearizado com Xbal e tratado com digestão NBM para remover a quatro bases 5 &#39;saliência gerada pela digestão com Xbal. Os BACs linearizados foram limpos por extracção com fenol-clorofórmio, seguido de precipitação com etanol. A linearização dos dois BACs purificados foi demonstrada em um gel de agarose a 0,8% (Figura 5A). A extracção com fenol-clorofórmio deve ser feito com cuidado para assegurar que os BACs linearizados são isentos de RNase. Cada um dos dois BACs linearizados serviu como molde cDNA para a transcrição run-off com a ARN-polimerase SP6 em presença do m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Um análogo cap. A integridade dos RNAs sintéticos foi mostrado através da execução aliquotas das duas misturas de reacção de transcrição em um gel de agarose a 0,6%, juntamente com uma referência de 1 kb escada de ADN (Figura 5B). Neste ensaio simples, a principal banda de ARN proeminente sempre migrado apenas abaixo dos 3 kb referência banda de DNA e parecia estar afiado. No entanto, o RNA degradado teria uma aparência manchada no mesmo gel. Um ensaio centro infecciosa é o padrão ouro para determinar a infecciosidade específica dos RNAs sintéticos. Este ensaio foi realizado por electroporating células BHK-21 com amostras de ARN, semeando alíquotas iguais de 10 vezes de células electroporadas diluídos em série em placas de 6 poços contendo naive células BHK-21 (3 x 10 5 células / poço), e da sobreposição de agarose sobre as monocamadas de células. Após incubação durante 4 dias, as células sobreviventes foram fixadas com formol e coradas com violeta de cristal um solution para quantificar o número de centros infecciosos (placas), que corresponde ao número de moléculas de ARN infecciosos entregues nas células (Figura 6A). Uma vez que o molde de ADNc utilizada para a transcrição in vitro foi demonstrado ser não-infeccioso, 27 de um alíquota da mistura de reacção de transcrição foi utilizado directamente para a electroporação. A electroporação é o método preferido para a transfecção de ARN; Alternativamente, os ARN podem ser transfectadas por outros métodos que utilizam lipossomas de DEAE-dextrano e catiónicos. ARN electroporação é muito eficaz, mas &quot;formação de arco&quot; do impulso eléctrico ocorre raramente se sais estão presentes na reacção de electroporação ou, se o cuvete de electroporação é reutilizado. A expressão de proteínas virais em células transf ectadas com ARN foi analisada por ensaios de imunofluorescência, utilizando um anti-soro de coelho anti-NS1 (Figura 6B). A produção de partículas virais acumulados nos sobrenadantes de células transfectadas com ARN foi umalyzed por ensaios de placas (Figura 6C). Os resultados destas experiências mostram claramente que os RNAs sintéticos derivados de ADNc infeccioso são permissivas em células BHK-21, gerando um título elevado de vírus recombinantes. <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Oligonucleotide </td><td> Sequência A (5 &#39;para 3&#39;) </td><td> Posição b </td><td> Polaridade </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td> FormigaiSense </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10.952-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10.956-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac ta </td><td></td><td> Sentido </td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638-662 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td> Antisense </td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10.670-10.694 </td><td> Sentido </td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10.954-10.977 </td><td> Antisense </td></tr><tr><td colspan="4"> uma sequência JEV são mostrados em letras maiúsculas, e as sequências BAC são indicados em letras minúsculas. posição b Nucleotide refere-se à sequência completa do genoma de JEV SA 14 -14-2 (número de acesso Genbank JN604986). </td></tr></tbody></table> Tabela 1: Os oligonucleótidos utilizados para a síntese de ADNc, amplificação por PCR, e mutagénese de BAC. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> Figura 1.0; Estratégia para a construção de um ADNc de comprimento completo do JEV SA 14 -14-2 como um BAC (A) Isolamento de RNA viral a partir de partículas de JEV.. É mostrado um diagrama esquemático do ARN genómico de JEV SA 14 -14-2. (B) Síntese de quatro fragmentos de ADNc que se sobrepõem (F1 a F4) que cobre todo o genoma viral. (C) A subclonagem de fragmentos de ADNc que se sobrepõem quatro num vector BAC, criando pBAC / F1 para pBAC / F4. (D) A modificação dos cDNAs clonados para transcrição run-off in vitro. pBAC / F1 SP6 é um derivado de pBAC / F1 que contém a sequência do promotor SP6 a montante da extremidade 5 &#39;virai. pBAC / F3 KO é um derivado de pBAC / F3 que contém uma mutação silenciosa ponto (A 9134 → t, asterisco). pBAC / F4 RO é um derivado de pBAC / F4 que contém um local artificial Xbal de escoamento a jusante da extremidade 3 &#39;virai. (E </<html> strong&gt;) O conjunto inclui um full-length SA 14 -14-2 BAC (pBAC / SA 14 -14-2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> Figura 2. Síntese de quatro fragmentos de cDNA sobrepostas (F1 a F4) que mede o RNA genómico de tamanho completo de JEV SA 14 -14-2. Os quatro produtos de RT-PCR são avaliados por electroforese em gel de agarose a 0,8%. H, 1 kb escada de DNA. Os tamanhos esperados dos quatro fragmentos de cDNA estão indicados na parte inferior da imagem do gel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3. Purificação de BAC contendo um ADNc de comprimento completo do JEV SA 14 -14-2. O plasmídeo BAC é isolado a partir de E. coli DH10B pelo método de lise alcalina-SDS e ainda purificado por bandagem num gradiente de CsCl-EtBr. Apresentado é um exemplo do gradiente de CsCl-EtBr usando um 16 × 76 milímetros tubo de polipropileno selado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> Figura 4. Resumo da recuperação de vírus infecciosos a partir de um de comprimento completo JEV SA 14 -14-2 ADNc montado num BAC. (A) A linearização do modelo de cDNA. O full-length JEV BAC é cortado comXbal e tratado com NBM. (B) Síntese dos transcritos de ARN. O ADNc linear é transcrito pela ARN-polimerase SP6 em presença do m 7 G (5 &#39;) ppp (5&#39;) Um análogo de tampão. (C) A recuperação do JEVs sintético. Os RNAs transcritos in vitro são transfectados em células BHK-21 por eletroporação, que gera um elevado título de vírus sintético. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> Figura 5. Síntese dos ARN por transcrição in vitro utilizando um de comprimento completo JEV BAC como um modelo de cDNA. (A) Produção do corpo inteiro linearizado JEV BAC, pBAC / SA 14 -14-2. Dois clones independentes de pBAC/ SA 14 -14-2 (Cl.1 e CL.2) são linearizados por digestão com Xba I e por tratamento subsequente com NBM. Os BACs linearizados são examinados por electroforese em gel de agarose a 0,8%. (B) A produção dos RNAs sintéticos por transcrição run-off. Cada um dos dois BACs linearizado é utilizado como um molde para a RNA-polimerase SP6 de transcrição run-off. Alíquotas das duas reacções de transcrição são corridos num gel de agarose a 0,6%. M, 1 kb DNA ladder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> Figura 6. infecciosidade específica dos ARN transcritos a partir de um sintéticos JEV BAC de comprimento completo e a recuperação do vírus sintético. Células BHK-21 electroporadas são falsamente (Mock) ou electroporadas com os transcritos de ARN derivados from cada um dos dois clones independentes de todo o comprimento do JEV BAC (Cl.1 e CL.2). (A) a infectividade de ARN. As células são cobertas com agarose e coradas com violeta de cristal a 4 dias após a transfecção. Infectividade de ARN é determinada por ensaios de centros infecciosos para estimar a quantidade de ARN infeccioso electroporada para dentro das células (painel esquerdo). Além disso, imagens representativas de centros infecciosos são mostradas (painel direito). (B) A expressão de proteína. As células são cultivadas em lâminas de câmara de 4 poços. A expressão de proteína virai em células electroporadas ARN a 20 horas após a transfecção (HPT) é analisada por ensaios de imunofluorescência, utilizando um anti-soro de coelho anti-NS1 e um primário de cabra conjugado com Cy3 secundário anti-IgG de coelho (vermelho). Os núcleos são contrastadas com 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindole (azul). As imagens são sobrepostas em imunofluorescência as suas imagens de contraste de interferência diferencial correspondente. (C) o rendimento virai. As células são cultivadas em 150 pratos mm cultura. A produção de viriões infecciosos acumuladas nos sobrenadantes de cultura de células electroporado RNA em 22 e 40 hpt é examinado por ensaios de placa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui, é apresentado um protocolo para a criação de um cromossomo artificial bacteriano infeccioso contendo um cDNA de comprimento total do RNA genômico de fita positiva do vírus da encefalite japonesa. Este protocolo pode ser usado para construir um cDNA funcional de outros vírus de RNA de fita positiva, tornando-o uma poderosa ferramenta genômica para estudar a biologia do vírus.

Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

O objetivo geral deste procedimento é recuperar partículas virais infecciosas produzidas inteiramente a partir de um cDNA clonado de vírus de RNA de fita positiva, cujos genomas apresentam a mesma polaridade que o mRNA celular, como o vírus da encefalite japonesa. Essa genética reversa baseada em cDNA é um método fundamental que permite a manipulação direta do RNA genômico viral, gerando assim vírus recombinantes para estudos moleculares e genéticos da replicação viral e da patogênese. Essa técnica também fornece uma plataforma valiosa que permite o desenvolvimento de vetores virais de vaccinia geneticamente definidos para a entrega de genes estranhos.Esses métodos são aplicáveis à clonagem de cDNA de comprimento completo para vírus de RNA de fita negativa ou positiva, particularmente aqueles com genomas maiores que 10 kb. Demonstrando o procedimento estarão vários membros do meu laboratório: a assistente de pesquisa Sang-Im Yun, os pesquisadores pós-doutorandos Byung-Hak Song e Jin-Kyoung Kim e o estudante de graduação Jordan Frank.A parte em vídeo desta publicação abrange a preparação do cromossomo artificial bacteriano contendo as sequências de interesse, a síntese de RNA transcrito a partir do plasmídeo original e como medir a infectividade do RNA e o rendimento viral. Todos os procedimentos utilizados antes da geração do plasmídeo BAC são fornecidos no protocolo textual com grande detalhe. Para este procedimento, primeiramente cultive uma única colônia de E. coli DH10B, carregando o plasmídeo BAC, em três mililitros de caldo 2X YT com cloranfenicol. Incube a cultura por 10 horas a 35 graus Celsius com agitação entre 225 e 250 rpm.Após 10 horas, aumente a escala do cultivo. Em seguida, inocule 500 microlitros de crescimento em 500 mililitros de meio e cultive o inóculo por seis horas com agitação vigorosa. Após seis horas, centrifugue o cultivo bacteriano em 2 frascos de 250 mililitros a 3.100 ×g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, re-suspenda cada pellet em 30 mililitros de solução GTE.Adicione 500 microlitros de lisozima e incube as suspensões em gelo por 10 minutos. Enquanto isso, prepare uma solução de lise fresca para o próximo passo. Após 10 minutos, adicione 60 mililitros da solução de lise e misture por inversão até que a solução fique aparentemente clara.Deixe as reações ocorrerem à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, adicione 45 mililitros de solução de neutralização a cada frasco e inverta os frascos até que estejam completamente misturados. Depois, coloque-os sobre gelo por 10 minutos.Colete os lisados neutralizados com centrifugação refrigerada de alta força g. Em seguida, transfira os sobrenadantes para dois novos frascos de 250 mililitros. Adicione 0,6 volumes de isopropanol a 100% a cada um e coloque-os no gelo por 20 minutos.Em seguida, centrifugue os precipitados, descarte os sobrenadantes e dissolva os pellets em cinco mililitros de tampão TE. Combine os dois volumes em um único tubo de 50 mililitros e precipite o RNA adicionando um volume igual de cloreto de lítio 5 M e incubando a mistura em gelo por 10 minutos. Utilize uma centrifugação fria de 20 minutos para coletar o precipitado de RNA.Em seguida, transfira o sobrenatante para um novo tubo de 250 mililitros, adicione dois volumes de isopropanol a 100% e coloque o tubo no gelo para que o precipitado de DNA se forme. Após 20 minutos, centrifugue para sedimentar o precipitado, aspire o sobrenatante, reconstitua o pellet de DNA em 9,5 mililitros de tampão TE e transfira a solução de DNA para um tubo de 50 mililitros.Continue o preparo montando o gradiente de cloreto de césio com brometo de etídio. Carregue a mistura em um tubo de polipropileno vedável usando uma seringa com agulha de 18 fios e feche o tubo. Gire o tubo fechado durante a noite em uma ultracentrífuga para formar um gradiente de cloreto de césio.No dia seguinte, colete uma faixa de DNA do plasmídeo BAC a partir do gradiente de cloreto de césio. Use uma agulha de 18 gauge para criar uma ventilação de ar no topo do gradiente e uma agulha de 20 gauge com seringa para coletar o DNA BAC da lateral do gradiente, e então transfira a coleta para um tubo microfuge de 1,7 mililitro. Realize uma lavagem, adicione 2,5 volumes de butanol saturado com água e misture com vortexagem normal.Em seguida, centrifugue a mistura à temperatura ambiente e transfira a fase aquosa inferior para um novo tubo microcêntrifuga de 1,7 mililitro. Repita essa lavagem um total de seis vezes para remover todo o brometo de etídio. Agora, precipite o DNA BAC. Adicione um décimo do volume de acetato de sódio 3 molar e 2,5 volumes de etanol 100% ao tubo. Incube a mistura em gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue o precipitado à temperatura ambiente e lave o pellet de DNA com um mililitro de etanol 70%. Repita a centrifugação e colete o pellet novamente. Por fim, seque o DNA em pellet ao ar por 10 minutos e elua-o em 200 microlitros de tampão TE.Inicie com uma digestão em larga escala por enzima de restrição do plasmídeo BAC com Xba-one em um volume total de 100 microlitros. Realize esta digestão a 37 graus Celsius por 12 a 15 horas. Em seguida, incube a digestão adicionalmente com mais 25 unidades de nuclease de feijão-mungo a 30 graus Celsius por duas horas.Após a incubação, complete o volume até 300 microlitros com água destilada. Em seguida, realize uma extração com fenol adicionando um volume igual de fenol-clorofórmio, álcool isoamílico à amostra diluída, agitando vigorosamente em vórtex por um minuto, centrifugando o tubo e transferindo a fase aquosa superior para um novo tubo.Em seguida, repita a extração com clorofórmio. Depois, recupere o DNA BAC linearizado por precipitação com etanol. Colete o pellet de DNA por centrifugação, descarte o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de etanol a 70%. Repita a etapa de centrifugação e seque o pellet ao ar. Após 10 minutos de secagem, dissolva o pellet de DNA em 30 microlitros de água destilada. Em seguida, analise um microlitro do BAC recuperado em um gel de agarose a 0,8%.Em seguida, monte uma transcrição de runoff de 25 microlitros do DNA BAC linearizado, incluindo UTP tritiado para quantificação de RNA. Realize a reação a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, analise um ou dois microlitros da reação de transcrição de runoff em um gel de agarose 0,6%.Inicie com células BHK-21 cultivadas por 24 horas em placas de 150 milímetros, semeadas a 3 milhões de células por placa. Lave a monocamada celular com a solução fria A e, em seguida, desprenda-as por tripsinização. Colete as células por centrifugação a 270 ×g durante dois minutos.Em seguida, ressuspender as células em 50 mililitros da solução A fria e centrifugar novamente. Repetir esta lavagem três vezes. Após a última lavagem, ressuspender as células a 20 milhões por mililitro na solução A. Em seguida, misturar uma alíquota de 400 microlitros da suspensão celular com dois microgramas de RNA sintético em uma cubeta de dois milímetros.Eleptroporar imediatamente a mistura em condições ideais e deixar as células em repouso por 10 minutos. Em seguida, transferir as células para um tubo microcêntrifuga contendo 600 microlitros de meio de cultura completo. Preparar agora diluições seriadas de dez vezes das células eletroporadas em volumes de um mililitro. Semear alíquotas de 100 microlitros de cada diluição sobre monocamadas de células BHK21 normais. Após quatro a seis horas de incubação, recobrir as células com agarose a 0,5% em MEM acrescido de FBS e cultivá-las por mais quatro dias.Células BHK21 foram submetidas a eletroporação simulada ou eletroporadas com transcritos de RNA derivados de dois clones independentes do JEV-BAC de comprimento completo. Quatro dias depois, as células foram coradas com violeta cristal para visualizar o RNA infeccioso nas células. Por meio dessa coloração, os centros infecciosos foram quantificados. Em seguida, a expressão de proteínas virais foi examinada em células eletroporadas com RNA 20 horas após a transfeção, utilizando soro anti-NS-um coelho e um anticorpo secundário conjugado com Cy3, visível em vermelho. Os núcleos foram contra-colorados com DAPI, visível em azul. Posteriormente, em 22 e 40 horas após a transfeção, a produção de viriões infecciosos acumulados nos sobrenadantes de cultura das células eletroporadas com RNA foi analisada por ensaios de placa.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como resgatar um vírus infeccioso inteiramente a partir de um cDNA clonado de uma cepa positiva de RNA, como o vírus da encefalite japonesa. Portanto, não se esqueça de que trabalhar com o vírus da encefalite japonesa e outros patógenos humanos pode ser extremamente perigoso. É necessária uma adequada capacitação em biossegurança antes de realizar este procedimento.

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