Bacteriana Artificial Chromosomes: Uma Ferramenta genómica funcional para o Estudo da Positivo-fio vírus RNA

O objetivo geral deste procedimento é resgatar partículas de vírus infecciosas feitas inteiramente de um CDNA clonado de fita positiva, vírus de RNA cujos genomas estão na mesma polaridade que os Mr.NA celulares, como o vírus da encefalite japonesa. Esta genética regênica baseada em CNA é um método semial que permite a manipulação direta do RNA genômico viral, gerando vírus recombinantes para estudo molecular e genético na replicação e patogênese viral. Essa técnica também fornece uma plataforma valiosa que permite o desenvolvimento de vacinas geneticamente definidas e vetores virais para a entrega de genes estranhos.

Esses vasos são aplicáveis à clonagem de CDNA de comprimento total para vírus de RNA de comprimento ou cepa positiva, particularmente aqueles com genomas maiores que 10 kb. Demonstrando o procedimento estarão vários membros do meu assistente de pesquisa de laboratório, o professor San Nun, o pós-doutorando UNG e Xing y Kim e os alunos de graduação, Jordan Frank. A parte do vídeo desta publicação cobre a preparação do cromossomo artificial bacteriano contendo as sequências de interesse, a síntese de RNA, transcrita do plasmídeo traseiro, e como medir a infectividade dos RNAs e o rendimento do vírus.

Todos os procedimentos usados antes de gerar o plasmídeo traseiro são fornecidos no protocolo de texto em grande detalhe. Para este procedimento, primeiro cultive uma única colônia de e coli DH 10 B, carregando o plasmídeo traseiro em três mililitros de dois caldos XYT com cloranfenicol. Incube a cultura por 10 horas a 35 graus Celsius com agitação de 225 a 250 RPM.

Após 10 horas, aumente a escala da cultura, inocule 500 microlitros de crescimento em 500 mililitros de meio e cultive o inóculo por seis horas com agitação vigorosa após seis horas. Centrifugue a cultura bacteriana em 2 frascos de 250 mililitros a 3.100 Gs por 15 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, ressuspenda cada pellet em 30 mililitros de solução GTE.

Adicione 500 microlitros de lisozima e incube as suspensões no gelo por 10 minutos. Enquanto isso, prepare uma nova solução de lise para a próxima etapa. Após 10 minutos, adicione 60 mililitros da solução de lise e misture agitando até que a solução pareça límpida.

Deixe as reações irem à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, adicione 45 mililitros de solução de neutralização a cada frasco e inverta os frascos até que estejam bem misturados. Em seguida, coloque-os no gelo por 10 minutos.

Colete os lisados neutralizados com a centrifugação refrigerada de alto G. Em seguida, reúna os sobrenadantes em dois novos frascos de 250 mililitros. Adicione 0,6 volumes de isopropanol a 100% a cada um e coloque-os no gelo por 20 minutos.

Em seguida, gire os precipitados, descarte os sobrenadantes e dissolva os pellets em cinco mililitros de tampão TE. Combine os dois volumes em um único tubo de 50 mililitros e precipite o RNA adicionando um volume igual de cloreto de lítio de cinco molares e incubando a mistura no gelo por 10 minutos. Use uma centrifugação a frio de 20 minutos para coletar o precipitado de RNA.

Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 250 ml. Adicione dois volumes de isopropanol 100% e coloque o tubo no gelo para que o precipitado de DNA se forme. Após 20 minutos, gire o precipitado, aspire o sobrenadante, ressuspenda o pellet de DNA em 9,5 mililitros de tampão TE e transfira a solução de DNA para um tubo de 50 mililitros.

Continuar a preparação estabelecendo o gradiente de cloreto de césio com um brometo de th. Carregue a mistura em um tubo de polipropileno selável usando uma seringa com uma agulha de calibre 18 e feche o tubo. Gire o tubo selado durante a noite em uma ultracentrífuga para formar um gradiente de cloreto de césio.

No dia seguinte, colete uma banda de DNA de plasmídeo posterior do gradiente de cloreto de césio. Use uma agulha de calibre 18 para criar uma saída de ar no topo do gradiente e uma agulha de calibre 20 com seringa para coletar o DNA traseiro do lado do gradiente e, em seguida, transfira a coleção para um tubo de micro fuge de 1,7 mililitro. Faça uma lavagem, adicione 2,5 volumes de butanol saturado de água e misture com vórtice normal.

Em seguida, centrifugue a mistura à temperatura ambiente e transfira a fase aquosa inferior para um novo tubo de microfuga de 1,7 mililitro. Repita esta lavagem um total de seis vezes para remover todo o brometo de etídio. Agora precipite o DNA traseiro.

Adicione um décimo volume de acetato de sódio de três molares e 2,5 volumes de etanol a 100% ao tubo. Incube a mistura no gelo por 10 minutos. Em seguida, centrifugue o precipitado à temperatura ambiente e lave o pellet de DNA com um mililitro de etanol a 70%.

Repita a centrifugação e recolha o pellet novamente. Finalmente, seque o DNA peletizado ao ar por 10 minutos e use-o em 200 microlitros de tampão TE. Comece com uma digestão enzimática de restrição em larga escala do plasmídeo traseiro com xbo.

Um em um volume total de 100 microlitros. Realize esta digestão a 37 graus Celsius por 12 a 15 horas. Em seguida, incube ainda mais a digestão com mais 25 unidades de nuclease de feijão mungo a 30 graus Celsius por duas horas.

Após a incubação, aumente o volume para 300 microlitros com água destilada. Agora execute uma extração de fenol adicionando um volume igual de clorofórmio de fenol, álcool isoamílico à amostra diluída. Vórtice vigorosamente por um minuto, girando pelo tubo e transferindo a fase aquosa superior para um novo tubo.

Em seguida, repita a extração com clorofórmio. Em seguida, recupere o DNA linearizado por precipitação de etanol. Colete o pellet de DNA com centrifugação, descarte o sobrenadante e lave o pellet com um mililitro de etanol a 70%.

Repita a etapa de centrifugação e seque o pellet ao ar. Após 10 minutos de secagem, dissolva o pellet de DNA em 30 microlitros de água destilada. Em seguida, examine um microlitro das costas recuperadas em um gel AROS a 0,8%.

Em seguida, configure uma transcrição de escoamento de 25 microlitros do DNA linear de volta, incluindo UTP tritiado para quantificação de RNA. Realize a reação a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, examine um ou dois microlitros da reação de transcrição de escoamento em um gel AROS a 0,6%.

Comece com células BHK 21 cultivadas por 24 horas em placas de 150 milímetros banhadas a 3 milhões de células por placa. Enxágue a monocamada de células com a solução fria A e retire-as com tripsina. Ização. Coletar as células por centrifugação a 270 GS por dois minutos.

Em seguida, ressuspenda as células em 50 mililitros de solução fria A e gire-as novamente. Repita esta lavagem três vezes após a última lavagem. Ressuspender as células a 20 milhões por mililitro na solução A. Em seguida, misturar uma alíquota de 400 microlitros da suspensão celular com dois microgramas de RNA sintético numa alíquota de dois milímetros.

Imediatamente eletropurar a mistura em condições ideais e deixar as células descansarem por 10 minutos. Em seguida, transfira as células para um tubo de microfuga contendo 600 microlitros de meio de cultura completo. Agora prepare a diluição serial de dez vezes das células eletroporadas em volumes de um mililitro, placa de alíquotas de 100 microlitros de cada diluição em monocamadas de células bhk 21 normais após quatro a seis horas de incubação, sobreponha as células com 0,5% aros em MEM mais FBS e cultive-as por mais quatro dias.

As células Bhk 21 foram eletroporadas simuladas ou eletroporadas com transcritos de RNA derivados de dois clones independentes do JEV de comprimento total Quatro dias depois, as células foram coradas com cristal violeta para visualizar o RNA infeccioso nas células. Usando essa coloração, os centros infecciosos foram quantificados. Em seguida, a expressão da proteína viral foi examinada em células eletroporosas de RNA 20 horas após a transfecção usando anti NS, um soro antis de coelho e um anticorpo secundário conjugado SI três visto em vermelho.

Os núcleos foram contracorados com DAPI visto em azul. Posteriormente, 22 e 40 horas após a transfecção, a produção de varians infecciosas se acumulou na cultura. Os sobrenadantes das células eletroporadas de RNA foram examinados por ensaios de placa.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como resgatar o vírus infeccioso inteiramente de um CNA clonado de cepa positiva, RNA, como o vírus da encefalite japonesa. Portanto, não se esqueça de que trabalhar com um vírus da encefalite japonesa e outros patógenos humanos pode ser extremamente perigoso. É necessário um treinamento adequado de biossegurança antes de realizar este procedimento.