Name: Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Aprenda a isolar e sequenciar vírus de plantas com genomas de DNA de fita dupla usando extração de DNA e RNA de folhas infectadas. Este método purifica variantes virais de componentes celulares, permitindo sequenciamento preciso e classificação taxonômica de novos vírus.

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Pesquisa foi financiada pelo centro de Oklahoma para o avanço da ciência e tecnologia aplicada pesquisa programa fase II AR 132-053-2; e pelo departamento de agricultura especialidade culturas de Oklahoma programa de bolsas de investigação. Agradecemos o Dr. HongJin Hwang e a instalação de núcleo de Bioinformática OSU que foi apoiada por concessões do NSF (EOS-0132534) e NIH (2P20RR016478-04, 1P20RR16478-02 e 5P20RR15564-03).

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Os autores não têm nada para divulgar.

Nos últimos anos uma variedade de métodos têm sido empregadas para o estudo da biodiversidade de vírus de planta em ambientes naturais, que incluem enriquecedor para partículas vírus-like (VLP) ou vírus específico do RNA ou DNA2,3,44, 45,46 . Esses métodos são seguidos por NGS e bioinformatic análise. O objetivo deste estudo foi encontrar o agente causal de uma doença comum em uma planta cultivada. A doença foi relatada para ser o resultado de um vírus desconhecido, que tem partículas não-envelopado bacilliform, e para que apenas um fragmento de bp 565 tem sido clonado47. Esta informação foi suficiente para os investigadores prévios, hipoteticamente, atribuir o vírus para o gênero Badnavirus dentro da família Caulimoviridae. Enquanto relatórios anteriores a hipótese de que a doença de mottle canna em lírios de canna foi o resultado de um único badnavirus, usando a abordagem de metagenômica descrita neste estudo, determinamos que a doença era causada por badnavirus provisório duas espécies24. Assim, a força do uso de uma abordagem metagenome para descobrir o agente causal de uma doença é que agora podemos identificar situações onde pode haver mais de uma causa.
Nossa abordagem combina dados de sequenciamento de DNA e RNA é completa e também demonstra que os resultados usando duas abordagens produziram resultados consistentes e confirmaram a presença de dois vírus relacionados. Nós empregado um procedimento modificado para isolamento de caulimoviruses e produzido uma amostra que foi enriquecido por ácidos nucleicos de vírus associado e que estavam protegidos dentro do capsídeo do vírus. Um laboratório de serviço foi contratado para realizar o sequenciamento de DNA. O conceito essencial para sequenciamento de novo é que a DNA polimerase incorpora o fluorescente etiquetado nucleotides em uma cadeia de DNA modelo durante ciclos sequenciais de síntese de DNA. O contigs montado seguido por NGS foram apresentados em um fluxo de trabalho de bioinformatic produzindo contigs alguns que foram identificadas como contigs de vírus. Mais uma confirmação do vírus dois genomas10,24,,48,49,50 foi obtida através da análise de bioinformatic da RNA-seq dados obtidos de preparações de RNA ribo-esgotada. Um resultado interessante era aprender que as populações de sequências recuperaram por sequenciamento de DNA e RNA fornecidos distribuições similares dos ácidos nucleicos virais e não virais. Para o sequenciamento de DNA e RNA, < 0.5% das sequências foram de origem do vírus. No seio da população de vírus sequências 78-82% pertencia à família Caulimoviridae. Comparando o vírus montado contigs de sequenciamento de DNA e RNA, confirmamos que os dois genomas montados ocorreram em ambos os conjuntos de dados.
Uma preocupação de usar apenas sequenciamento de DNA para identificar os genomas de vírus novo é que o genoma de badnavirus é um DNA circular aberto. Supõe-se que sequências sobrepondo descontinuidades no genoma podem apresentar obstáculos para a montagem do genoma de contigs. Exame inicial dos resultados de sequenciamento de DNA revelou dois genomas similares do vírus. Formulamos a hipótese que estes genomas também representavam a diversidade genética de uma espécie que não tem sido estudada, ou representados duas espécies co infectando a mesma planta24. Portanto, a análise de bioinformatic coletiva de conjuntos de dados obtidos pelo DNA NGS e sequenciação do ARN, habilitado a confirmação da presença de dois genomas completos.
Há um outro relatório que desenvolveu um método alternativo para extrair VIP e ácidos nucleicos de planta homogenates para estudos de metagenomic, com base em procedimentos para recuperar o DNA do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV; um caulimovirus)3. Esta abordagem identificada romance RNA e sequências de DNA vírus em plantas não cultivadas. As etapas derivadas do procedimento de isolamento caulimovirus usado neste estudo para descobrir o agente causal de uma doença de plantas cultivadas são ao contrário as etapas derivadas para extrair VIP de plantas infectadas naturalmente24. O sucesso de ambos os métodos modificados sugere que o procedimento de quadro para caulimovirus isolamento pode ser um valioso ponto de partida para estudos de metagenomic de vírus de plantas em geral.

Doenças emergentes de planta conduzir os investigadores a desenvolver novas ferramentas para identificar o agente causal correta (s). Os relatórios iniciais de viroses novo ou recorrente baseiam-se geralmente ocorrem sintomas como mosaico e malformações da folha, veia de compensação, nanismo, murcha, lesões, necrose, ou outros sintomas. O padrão para um novo vírus de relatórios como o agente causal de uma doença é para separá-lo de outros patógenos contaminantes, propagá-la em um hospedeiro adequado e reproduzir a doença por inoculação em plantas saudáveis da espécie hospedeiro original. A limitação desta abordagem é que muitos géneros de vírus de planta dependem de um inseto ou outros vetores para a transmissão para um hospedeiro adequado ou voltar para as original espécies de hospedeiros. Neste caso, a busca para o vetor apropriado pode ser prolongada, pode haver dificuldades para estabelecer colônias de laboratório do vetor e mais esforços são necessários para elaborar um protocolo para transmissão experimental. Se as condições para estudos de transmissão bem sucedida de laboratório não podem ser alcançadas, então o trabalho fica aquém do padrão para relatar uma nova doença de vírus. Para vírus que ocorrem em seus hospedeiros naturais em títulos muito baixos, pesquisadores devem identificar hospedeiros alternativos de propagação para manter reservas suficientes de infecciosas para realização de pesquisas. Para as espécies de vírus que infectam apenas algumas plantas isso também pode ser um obstáculo para o cultivo de culturas-mãe1.
Nos últimos anos, os cientistas estão mais frequentemente empregando NGS elevado-throughput e abordagens metagenomic para descobrir sequências de vírus que estão presentes no ambiente, que pode existir relacionados com uma doença conhecida, mas pode ser atribuído a gêneros e espécies taxonômicas 2 , 3 , 4. tais abordagens para a descoberta e a categorização de materiais genéticos em um ambiente distinto fornecem uma maneira para descrever a diversidade de vírus na natureza ou sua presença em um determinado ecossistema, mas não necessariamente confirma um enquadramento para a definição agentes causais para uma doença aparente.
O gênero Badnavirus pertence à família Caulimoviridae de pararetroviruses. Estes vírus são bacilliform em forma com genoma de DNA circular de fita dupla de aproximadamente 7 a 9 kb. Todos os pararetroviruses replicar através de um intermediário de RNA. Pararetroviruses existe como episomes e replicar independentes da planta cromossômico DNA5,6. Estudos de populações do vírus de campo indicam que estas populações de vírus são geneticamente complexas. Além disso, as informações obtidas através de uma gama de genomas de plantas por sequenciamento de alto rendimento tem descoberto inúmeros exemplos de fragmentos de genoma badnavirus inseridos por eventos de integração ilegítimo em genomas de planta. Essas sequências de badnavirus endógena não estão necessariamente associadas com infecção7,8,9,10,11. Posteriormente, o uso de NGS para identificar novos badnaviruses como o agente causal da doença é complicado pela diversidade de genomas epissomal subpopulação, bem como a ocorrência de sequências endógenas12,13.
Enquanto há não um pipeline ideal para a descoberta de genomas de romance pararetrovirus, existem duas abordagens comuns para identificar estes vírus como agentes causais de doença. Um método é enriquecer para pequenas sequências de RNA das folhas infectadas e em seguida montar essas sequências para reconstituir o vírus genome(s)14,15,16,17. Outra abordagem é a amplificação de círculo rolante (RCA) para amplificar a vírus de DNA circular genomas18. O sucesso da RCA depende da idade da folha e do título do vírus no tecido selecionado. Os produtos RCA são submetidos a digestão da limitação e clonados em plasmídeos para direct sequenciamento19,20,21.
Vírus mottle amarelo de canna (CaYMV) é um badnavirus e é descrito como a causa etiológica da doença mottle amarelo em canna, embora tenha sido apenas um fragmento de bp 565 do genoma anteriormente isoladas de cannas infectados22. Um estudo contemporâneo identificado CaYMV em Alpinia purpurata (gengibre de floração; CaYMV-Ap)23. O objetivo deste estudo foi recuperar sequências do genoma completo badnavirus de lírios de canna infectados. Descrevemos um protocolo para a purificação de vírus de contaminantes de planta e depois isolar ADN viral, a partir desta preparação e preparar uma biblioteca de DNA para uso em NGS. Essa abordagem elimina a necessidade de etapas de amplificação molecular intermediário. Nós também isolar mRNA de plantas infectadas para RNA-Seq. NGS, que inclui RNA-seq foi realizada usando cada preparação de ácido nucleico. Contigs montados foram encontrados para relacionar o táxon Badnavirus em ambos os conjuntos de dados usando o centro nacional de biotecnologia e Information (NCBI) ferramenta de busca de alinhamento local básico de ácidos nucleicos (dos). Identificamos os genomas de duas badnavirus espécies24.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Tampão de moagem para purificação de vírus</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>Tampão de moagem para purificação de vírus</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Tampão de moagem para purificação</td></tr> de <tr><td>vírus ureia</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Extração de homogeneizado&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Extração de homogeneizado</td> <td>X-100</td></tr><tr><td>Gaze</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Homogeneizado de filtro&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Ressuspensão de pellets e Amortecedores de ressuspensão de DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Tampão de ressuspensão de pellets</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Interrompe reações enzimáticas</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>Tampão de ressuspensão de DNA</td></tr><tr><td>fenol:clorofórmio:isoamilálcool&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Dissolver proteínas de virião</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Degradar DNA celular de extratos</td></tr> de <tr><td>etanol 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Precipitação de DNA de vírus</td></tr><tr><td>Liquidificador de laboratório</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Moer amostras de folhas</td></tr><tr><td>Ultracentrífuga modelo de piso&nbsp; & Rotor Ti70</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>Separação de extratos celulares</td></tr><tr><td>Centrífuga modelo de piso e rotor JA-14</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Separação de extratos celulares</td></tr><tr><td>Placa de agitação magnética</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Mistura de ureia em amostras durante a noite</td></tr><tr><td>Polícia de borracha</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Dissolver pellet de vírus</td></tr><tr><td>&nbsp; 2100 bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>Detecção sensível de qualidade e quantidade de DNA e RNA</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Microfluídica chip usado para mover, corar e medir a qualidade do RNA em um Bioanalisador 2100</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>Microfluídica chip usado para mover, corar e medir a qualidade do DNA em um Bioanalisador 2100</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro Nanodrop</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Análise da qualidade do DNA/RNA em etapas intermediárias de procedimentos</td></tr><tr><td>Kit de isolamento de RNA total da planta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>Isolado de RNA para água livre de RNA-seq</td></tr><tr><td>RNase&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>Ressuspensão de DNA e RNA para NGS</td></tr><tr><td>RNA concentrador spin column</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>Prepare RNA para RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA removal kit</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>Prepare RNA para RNA-seq</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magnet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>Prepare RNA para RNA-seq</td></tr><tr><td>&nbsp; RNA&nbsp; sistema de enriquecimento</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>Preparar RNA para RNA-seq</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Análise em gel da qualidade do DNA / RNA em etapas intermediárias dos procedimentos</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>coloração em gel de agarose</td></tr><tr><td>pGEM-T + JM109 células competentes</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Fragmentos do genoma do clone</td></tr><tr><td>pFU Taq polimerase</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>PCR amplificam o genoma do vírus</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>PCR amplificar o genoma do vírus</td></tr><tr><td>PCR oligonucleotídeos de PCR</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>PCR de ordem personalizada</td><td>amplificar o genoma do vírus</td></tr><tr><td>Miniprep Kit de purificação de DNA</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Purificação de DNA de plasmídeo antes do sequenciamento</td></tr><tr><td>Kit de limpeza de PCR</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>Preparar produtos de PCR para clonagem</td></tr><tr><td>pDRAW32 software</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Análise computacional de DNA circular e motivos</td></tr><tr><td>MEGA6.0 software</td><td>MEGA</td><td></td><td>Análise genética evolutiva molecular</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; RiboGreen&trade; Kit de Ensaio de RNA</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Determinação fluorométrica da quantidade de RNA Sistema de</td></tr><tr><td>pirosequenciamento GS Junior&trade;</td><td>Plataforma de sequenciamento</td><td>de 5526337001</td> da <td>Roche</td></tr><tr><td>GS Junior Kit EmPCR de titânio (Lib-A)</td><td>Reagentes</td><td>5996520001</td> da Roche <td>para PCR em emulsão</td></tr><tr><td>GS Jr Reagentes de recuperação de esferas EmPCR Reagentes</td><td>da Roche 5996490001</td><td>para PCR</td><td></td></tr> <tr><td>em emulsãoReagentes GS Junior EmPCR (Lib-A)</td><td>Reagentes Roche</td><td>5996538001</td><td>para PCR em emulsão</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Oil & Kit de quebra</td><td>Reagentes Roche</td><td>5996511001</td><td>para emulsão PCR</td></tr><tr><td>GS Jr Kit de sequenciamento de titânio</td>*<td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Inclui reagentes de sequenciamento, enzimas, tampões e grânulos de embalagem</td></tr><tr><td>GS Jr. Kit de placa de picotitulador de titânio</td> Placa de sequenciamento <td>Roche</td><td>5996619001</td> com <td>reagentes e juntas associados</td></tr><tr><td>Misturador</td><td></td> IKA Turrax <td>3646000</td><td>Misturador especial usado com Turrax Tubos</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (misturador especializado)</td><td></td><td>20003213</td><td>Tubos de mistura especializados com rotor interno para a criação de emulsões</td></tr><tr><td>Kit de nebulizadores GS</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Fracionador de tamanho de ácido nucleico para uso durante a preparação da biblioteca</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Bead Counter</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Contador de esferas da biblioteca</td></tr><tr><td>GS Junior Dispositivo de deposição de esferas</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Suporte para placa de picotitulação durante a centrifugação</td></tr><tr><td>Contrapeso e Adaptador para os Dispositivos de Deposição de Esferas</td><td>Roche</td><td>05 889 103 001</td><td>Usado para balancear o dispositivo de deposição com centrifugação de placas de picotitulação</td></tr><tr><td>Software GS Junior</td><td>Roche</td><td>05 996 643 001</td><td>Pacote de software para controle do instrumento, coleta e análise de dados</td></tr><tr><td>GS Junior Sequencer Control v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluído no item 05 996 643 001 acima)</td></tr><tr><td>GS Run Processor v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluído no item 05 996 643 001 acima)</td></tr><tr><td>GS De Novo Assembler v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluído no item 05 996 643 001 acima)</td></tr><tr><td>GS Reference Mapper v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluído no item 05 996 643 001 acima)</td></tr><tr><td>GS Amplicon Variant Analyzer v. 3.0</td><td>Roche</td><td></td><td>(Incluído no item 05 996 643 001 acima)</td></tr></tbody></table>

combinando a análise de dna em uma extração do virion bruto com a análise do rna das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Esta abordagem de metagenome é usada para identificar a planta vírus com genoma de DNA circular e seus transcritos. Muitas vezes planta vírus de DNA que ocorrem em baixa concentração de acolhimento ou não poderem ser inoculadas mecanicamente para outro host são difíceis de propagar para alcançar uma maior concentração de material infeccioso. Folhas infectadas são terreno em um buffer suave com pH ideal e a composição iônica, recomendado para a maioria dos retrovírus de pará bacilliform de purificação. A ureia é usada para quebrar os corpos de inclusão que armadilha virions e para dissolver os componentes celulares. Centrifugação diferencial fornece uma separação de virions de contaminantes de planta. Tratamento de proteinase K, em seguida, remove os capsids. Em seguida, o DNA viral é concentrado e usado para sequenciamento de próxima geração (NGS). Os dados NGS são usados para montar contigs que são submetidos à NCBI-BLASTn para identificar um subconjunto de sequências de vírus no dataset gerado. Em um pipeline paralelo, RNA é isolado de folhas contaminadas, usando um método de extração de RNA baseado na coluna padrão. Depleção de ribossoma é realizada para enriquecer para um subconjunto de transcrições de mRNA e vírus. Montadas sequências derivadas de RNA (RNA-seq) de sequenciamento foram submetidas à NCBI-BLASTn para identificar um subconjunto de sequências de vírus neste dataset. Em nosso estudo, identificamos dois genomas relacionados badnavirus completos em dois conjuntos de dados. Este método é preferível à outra abordagem comum que extrai a população agregada de pequenas sequências de ARN para reconstituir a planta vírus sequências genomic. Este último metagenomic gasoduto recupera vírus relacionados com sequências que são elementos retrô-transcrevendo inseridos no genoma da planta. Este é acoplado para ensaios bioquímicos ou moleculares mais discernir os agentes infecciosos ativamente. A abordagem documentada neste estudo, recupera sequências representativas da replicação de vírus que provavelmente indicam infecção pelo vírus ativo.

Este método de purificação de vírus modificados desde um enriquecimento do vírus DNAs útil para identificar duas espécies de vírus por NGS e bioinformática. Depois o homogeneizado foi centrifugado a 40.000 x g durante 2,5 h, havia uma bolinha verde na parte inferior do tubo e uma bolinha branca ao longo do comprimento. A pelota verde foi resuspended em um tubo de microcentrifugadora e o sedimento branco foi resuspended em dois tubos de microcentrifuga. PCR foi realizado utilizando primers de diagnóstico padrão CaYMV PCR, e produtos foram detectados na pelota solubilized branca e não a pelota verde (Figura 1A). Uma amostra da preparação bruta foi examinada por microscopia eletrônica de transmissão e observamos as partículas bacilliform medindo 124-133 nm de comprimento (Figura 1B). Isto está dentro do previsto comprimento modal da maioria dos badnaviruses. DNA foi extraído as bolinhas brancas e verdes e resuspended separadamente. Na Figura 1C, nós carregamos a 5 µ l de DNA extraído de verde e amostra de sedimento branco (1,6 µ g de DNA para a fração verde) e 3,1 µ g de DNA para a fração branca de agarose 0,8% electroforese do gel e analisou o DNA seguindo o brometo de etídio a coloração. A fração verde contido baixo peso molecular, DNA, Considerando que a fração branca produzido duas bandas de maior peso molecular DNA, bem como o baixo peso molecular de DNA (Figura 1C). O gel apresentado na Figura 1C foi executado por 40 min a 100 V e o esfregaço na raia 3 sugere que o gel de tensão deve ser diminuída para produzir bandas mais claras. Estes dados sugerem que o sedimento branco foi enriquecido por virions. A concentração de (0,6 µ g/mL) do DNA extraída da amostra branca foi baixa, mas suficiente para NGS, que exige um mínimo de 10 ng de DNA para prosseguir. DNAs fragmentados foram usados para preparar uma biblioteca para NGS.
Em paralelo, RNA foi extraído das plantas de canna infectada (Figura 1D) para alta produtividade RNA-Seq Realizou-se um fluxo de trabalho padrão para a preparação de biblioteca, NGS, criando contigs e identificando sequências do genoma viral (Figura 1E). Foram comparados os resultados da saída do uso de DNA e RNA como matérias-primas.
Obtivemos o 188.626 crus leituras de DNA por NGS usando DNA isolado de preparação vírus bruto. Leituras foram montadas em 13.269 contigs e BLASTn foi usado para pesquisar o NCBI dataset de sequências nucleotídicas (usando o Viridplantae TaxID: 33090 e vírus CNPJ: 10239 como os organismos limitantes) (Figura 1E). Os resultados do NCBI-BLASTn revelaram que 93% dos contigs de novo reunidos eram sequências celulares, 22% eram desconhecidos e 0,3% eram vírus contigs(Figura 2). A maioria dos contigs categorizados como sequências de celulares foram identificadas como mitocondrial ou do cloroplasto DNA. Dentro do dataset de vírus contigs, 32% de contigs o vírus estavam relacionados com membros do Caulimoviridae (que não eram Badnavirus sequências) e 58% destes estavam relacionados com Badnavirus. Do vírus contigs, 29% eram altamente semelhantes (e < 1 x 10-30) para CaYMV isolar V17 ORF3 gene (EF189148.1), vírus de Sugarcane bacilliform isolar D Batavia, genoma completo (FJ439817.1), e Banana raia CA virus completa do genoma ( KJ013511). Dentro desta população, havia contigs longo que se assemelhasse a dois genomas completos.
Alto rendimento produzido RNA-seq 153.488 sequência individual limpo leituras com uma média de ler comprimento de < 500 BP Contig montagem esta reduziram a 8.243 contigs. Estes foram submetidos à NCBI-BLASTn (usando o Viridplantae TaxID: 33090 e vírus CNPJ: 10239 como os organismos limitantes) e as saídas colocadas 76% do contigs em uma categoria de celulares sequências de planta, 23% eram desconhecidas, e 0,1% foram categorizados como vírus contigs ( Figura 2 B). uma análise mais aprofundada da população da população de 0,1% de vírus contigs determinado que 68% destes foram atribuídos a Caulimoviridae (Figura 2B). Três grandes contigs dentro desta população foram identificados com alta similaridade (e < 1 X 10-30) para CaYMV isolado gene V17 ORF3 (EF189148.1), vírus de Sugarcane bacilliform isolar D Batavia, genoma completo (FJ439817.1) e Banana streak Vírus de CA completa do genoma (KJ013511). Examinando as três contigs, aderimos manualmente dois para produzir um genoma vírus completos.
Comparamos o contigs de comprimento do genoma vírus produzido por sequenciamento de DNA e RNA como um andaime mútuo para confirmar a presença de dois genomas completos de vírus. Um genoma vírus completos de 6.966 bp foi tentativamente denominado vírus mottle amarelo associado de Canna 1 (CaYMAV-1)(Figura 3). O segundo genoma foi 7.385 bp e uma variante do CaYMV infectando Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01)(Figura 3).
Finalmente, iniciadores de PCR que foram projetados para fragmento de bp clone ~ 1.000 de cada vírus, foram usados para detectar diferencialmente os dois genomas em uma população de 227 plantas de canna, representando nove variedades comerciais. Em muitos casos, plantas individuais foram infectadas com ambos os vírus. Nós fornecemos um exemplo de detecção de RT-PCR do CaYMAV-1 e CaYMV-Ap01 em 12 plantas. Três destes foram positivos apenas para CaYMV-Ap01 e nove eram positivos para ambos os vírus (Figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Figura 1 : Preparações de ácido nucleico do vírus e fluxo de trabalho NGS. Eletroforese de fragmentos PCR bp 565 de genomas de CaYMV do gel de Agarose (A) (1,0%). Dois produtos PCR foram detectados em amostras preparadas a partir do sedimento branco (faixas 1, 2), mas não na amostra da pelota verde (faixa 3). Controle positivo (+) representa um produto PCR amplificado da planta infectada DNA que foi isolada usando um método automatizado que envolvem as partículas de celulose paramagnético padrão. Lane L contém a escada de DNA usada como um padrão para medir o tamanho das bandas de DNA lineares em pistas de amostra. (B) exemplo de partícula do vírus visualizado por microscopia eletrônica de transmissão no sedimento branco recuperado pelo fracionamento bruto das folhas de canna infectados. (C) Agarose (0,8%) gel de electroforese de DNA recuperado desde o verde (pista 1) e branco (pista 2) pelotas que testado positivo por PCR em painel A. Os pontos vermelhos e amarelos ao lado da pista 2 identificam duas bandas de DNA de alto peso molecular que ocorrem na fração de branco. Electroforese do RNA total recuperado pela purificação de RNA baseado na coluna de gel de Agarose (D) (1%). Lane L contém a escada de DNA usada como um padrão para medir o tamanho das bandas lineares em pistas de amostra. Pista 1-6 contém RNA isolado de folhas de canna infectados que foram agrupadas para uma única amostra para ribo-esgotamento e RNA-Seq. (E) esquemático pipeline de isolamentos de ácido nucleico, preparação de biblioteca, sequenciamento, contig assembly e genoma do vírus descoberta. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Figura 2 : Gráficos de krona visualizando as categorias taxonômicas de contigs. (A) o gráfico na esquerda mostra a abundância e distribuição taxonômica de contigs montados desde a preparação do vírus bruto. O mesmo gráfico retrata as proporções de contigs vírus associado com a família Caulimoviridae , gênero Badnavirus e três espécies estreitamente relacionadas. (B) o painel da esquerda mostra a abundância de contigs derivado de RNA-seq baseia sua distribuição taxonômica. À direita está o gráfico representando a abundância de contigs dentro da população de contigs vírus associado com a família Caulimoviridae , gênero Badnavirus e três espécies estreitamente relacionadas. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Figura 3 . Caracterização dos genomas CaYMAV-1 e CaYMV-Ap01. (A) representação diagramática de mottle amarelo Canna associar vírus 1 (CaYMAV) e o vírus mottle amarelo de Canna semelhante ao genoma isolado de Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Posições de nucleotídeo 1-10 é identificado como o início do genoma e contém um tRNAconheceu anticodão site típico da maioria dos genomas de badnavirus. As posições de paragem e arranque para tradução do quadro de leitura aberta (ORF) 1 e 2 são adjacentes. Estas proteínas têm desconhecido funções. ORF3 é uma poliproteína contendo dedo de zinco (ZnF), protease (Pro), transcriptase reversa (RT) e domínios de RNAse H. Uma sequência de sinal 3' poli é conservada para ambos os genomas do vírus. (B) análise de RT-PCR foi realizada utilizando RNA isolado de primers que detectam CaYMAV e CaYMV-Ap01 e folhas infectada pelo vírus. Na mesma população de 12 plantas, três foram infectados com CaYMV-Ap01 apenas, enquanto os restantes foram infectados com CaYMAV e CaYMV-Ap01. (+) indica o controle positivo e (-) indica o controle negativo. Esta figura é reproduzida/modificado de Wijayasekara et al . 24 com permissão. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Aqui nós apresentamos uma nova abordagem para identificar a planta vírus com genoma de DNA dobro-costa. Utilizamos métodos padrão para extrair o DNA e RNA de folhas contaminadas e realizar o sequenciamento de próxima geração. Ferramentas de Bioinformatic montam sequências em contigs, identificam contigs representando genomas do vírus e atribuir genomas de grupos taxonômicos.

Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre virologia ambiental, como o surgimento de novas doenças. A principal vantagem deste método é a purificação de variantes livres de componentes celulares e o uso dessas variantes para extrair DNA para sequenciamento. Cheguei a esta ideia inicialmente quando descobrimos que as plantas em nossos viveiros estavam infectadas com um ou mais Badnavírus desconhecidos. Indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades por três razões. Primeiro, a homogeneização é uma etapa crítica para garantir rendimentos de qualidade. Segundo, a centrifugação diferencial pode produzir múltiplos pellets e é necessário saber como identificar e separar esses pellets. Terceiro, o bioanalisador também pode ser difícil de interpretar.Um jaleco de laboratório e luvas devem ser usados em todas as etapas deste procedimento. Comece cortando 80 a 100 gramas de folhas de plantas doentes previamente congeladas a menos 20 graus Celsius. Em seguida, triture as folhas em um liquidificador Waring usando 200 mililitros de tampão de maceração e 0,5% de sulfito de sódio. Transfira o homogeneizado para um béquer de um litro. Ainda utilizando equipamento de proteção individual apropriado, adicione 18 gramas de ureia e 25 mililitros de detergente não iônico a 10% ao homogeneizado e cubra o béquer com papel alumínio. Agite com um agitador magnético durante a noite. No dia seguinte, transfira o homogeneizado para frascos de rotor de centrífuga de 250 mililitros e centrifugue em rotor de ângulo fixo a 4000 ×g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Recupere o sobrenadante e filtre por quatro camadas de pano de musselina. Meça o volume do homogeneizado líquido recuperado e, em seguida, distribua o homogeneizado em tubos de centrífuga de polipropileno de 38,5 mililitros. Centrifugue o homogeneizado a 40.000 ×g a quatro graus Celsius por 2,5 horas. Quando a centrifugação terminar, verifique a presença de um pellet verde no fundo do tubo e de um pellet branco ao longo da parede do tubo. Descarte o sobrenadante, mantendo ambos os pellets, e coloque as amostras no gelo. Separar o pellet branco do verde é uma das etapas mais desafiadoras do procedimento. Exige paciência e habilidade.Trabalhando em uma capela química, utilize um espátula de borracha para separar os pellets. Raspe e transfira os pellets para frascos de rotor diferentes. Coloque os frascos de rotor contendo os pellets brancos sobre gelo. Adicione um mililitro de água a cada frasco e pipete para cima e para baixo. A cada cinco minutos, durante um período de uma a duas horas, pipete a mistura para cima e para baixo para re-suspender o pellet. Após os pellets brancos terem sido re-suspensos, mantenha as suspensões durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, centrifugue a suspensão a 6000 vezes g a quatro graus Celsius durante 10 minutos para remover os detritos remanescentes. Transfira as suspensões concentradas para tubos novos e centrifugue a 136.000 vezes g a quatro graus Celsius por duas horas para sedimentar os viriões. Remova o sobrenadante e re-suspenda o sedimento em um mililitro de tampão.Inicie este procedimento rompendo os vírions. Adicione quarenta microlitros de uma solução de proteinase K a dois microgramas por microlitro às suspensões do pellet e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione um volume de fenol clorofórmio álcool isoamílico a cada amostra e agite manualmente por 20 segundos.Centrifugue à temperatura ambiente a 16.000 × g durante cinco minutos. Remova a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo. Repita esta extração duas ou mais vezes.Concentre o DNA utilizando precipitação com etanol. Use 0,3 molar de acetato de sódio pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 95%. Coloque as amostras a menos 20 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Em seguida, centrifugue a 13.000 ×g por 10 a 20 minutos para formar o pellet de DNA. Trabalhando em uma bancada de laboratório, re-suspenda o pellet de DNA em um mililitro de tampão TE 0,1 milimolar. Filtre a suspensão por meio de uma coluna comercial de filtração em gel mediante centrifugação. Analise as amostras por eletroforese em gel de agarose 1% utilizando coloração com brometo de etídio para observar as preparações de qualidade e avaliar a qualidade do DNA conforme descrito no texto. Quando examinadas por microscopia eletrônica de transmissão, partículas virais estavam presentes no pellet branco recuperado pela fracionamento bruto de folhas de cana infectadas. A eletroforese em gel de agarose do DNA recuperado dos pellets verde e branco identificou duas bandas de DNA de alto peso molecular na fração branca, indicadas pelos pontos vermelho e amarelo.A integridade do RNA isolado de folhas infectadas também foi verificada por eletroforese em gel de agarose. Este gráfico mostra a abundância e distribuição taxonômica de contigs montados a partir da preparação bruta do vírus. E este gráfico mostra as proporções de contigs virais associados à família Caulimoviridae, ao gênero Badnavirus e a contigs associados a três espécies estreitamente relacionadas.Esses dois próximos gráficos mostram a abundância de contigs derivados do sequenciamento de RNA com base em sua distribuição taxonômica. O gráfico à direita retrata a abundância de contigs dentro da população de contigs virais associados à família Caulimoviridae, gênero Badnavirus e três espécies estreitamente relacionadas. A comparação dos contigs do genoma viral obtidos por sequenciamento de DNA e RNA como um arcabouço mútuo confirma a presença de dois genomas virais completos.Por fim, a análise de RT-PCR utilizando RNA isolado de folhas infectadas por vírus detectou ambos os genomas virais.Uma vez dominada, esta técnica pode levar dois dias, enquanto um iniciante pode levar três dias. Ao realizar este procedimento pela primeira vez, é importante manter registros do volume do homogenato em cada um dos sobrenadantes, para que, ao final do procedimento, você possa comparar o rendimento final de DNA com o material inicial de partida.Após sua descoberta, este método abriu caminho no campo da virologia vegetal, permitindo que pesquisadores identifiquem novos vírus de DNA no ambiente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como homogeneizar material vegetal, concentrar variantes e obter um bom rendimento de DNA que possa ser utilizado para sequenciamento de nova geração. Não se esqueça de que trabalhar com ureia e fenol clorofórmico é extremamente perigoso, e precauções, como o uso de óculos, luvas e jaleco, além de máscara, devem ser sempre tomadas ao manipular esses produtos químicos. Para uma ultracentrifugação segura, é importante equilibrar corretamente os tubos; portanto, é necessário pesá-los e posicioná-los em posições opostas no rotor, garantindo que suas massas difiram em no máximo 0,01 entre si.

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Research

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