Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre virologia ambiental, como o surgimento de novas doenças. A principal vantagem desse método é purificar variantes de componentes celulares e usar essas variantes para extrair DNA para sequenciamento. Cheguei a essa ideia pela primeira vez quando descobrimos que as plantas em nossas estufas estavam infectadas com um ou mais Badnavírus desconhecidos.

Indivíduos novos neste método terão dificuldades por três razões. Primeiro, a homogeneização é uma etapa crítica para garantir rendimentos de qualidade. Em segundo lugar, a centrifugação diferencial pode produzir vários pellets e você precisa saber como identificar e separar esses pellets.

Terceiro, o bioanalisador também pode ser difícil de interpretar. Um jaleco e luvas de laboratório devem ser usados para todas as etapas deste procedimento. Comece cortando de 80 a 100 gramas de folhas de plantas doentes previamente congeladas a menos 20 graus Celsius.

Em seguida, triture as folhas em um liquidificador Waring usando 200 mililitros de tampão de moagem e 0,5% de sulfito de sódio. Transferir o homogeneizado para um copo de um litro. Enquanto ainda estiver usando equipamento de proteção individual adequado, adicione 18 gramas de ureia e 25 mililitros de detergente não iônico a 10% ao homogeneizado e cubra o copo com papel alumínio.

Mexa com um agitador magnético durante a noite. No dia seguinte, transferir o homogeneizado para garrafas de rotor de centrifugação de 250 mililitros e centrifugar num rotor de ângulo fixo a 4000 vezes g a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Recupere o sobrenadante e filtre através de quatro camadas de pano de queijo.

Meça o volume do homogeneizado líquido recuperado e, em seguida, divida o homogeneizado entre tubos de centrífuga de polipropileno de 38,5 mililitros. Centrifugue o homogeneizado a 40.000 vezes g a quatro graus Celsius por 2,5 horas. Quando a centrífuga estiver pronta, verifique a presença de um pellet verde no fundo do tubo e um pellet branco ao longo do comprimento do tubo.

Despeje o sobrenadante, retendo os dois pellets, e coloque as amostras no gelo. Separar o pellet branco e o verde é uma das etapas mais desafiadoras do procedimento. Requer paciência e habilidade.

Trabalhando em um capuz químico, use um policial de borracha para separar os pellets. Raspe e transfira os pellets para diferentes garrafas de rotor. Coloque as garrafas do rotor contendo os pellets brancos no gelo.

Adicione um mililitro de água a cada garrafa e pipete para cima e para baixo. A cada cinco minutos, ao longo de uma a duas horas, pipete a mistura para cima e para baixo para ressuspender o pellet. Depois que os pellets brancos forem ressuspensos, mantenha as suspensões durante a noite a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, centrifugue a suspensão a 6000 vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos para remover os detritos restantes. Transferir as suspensões concentradas para novos tubos e centrifugar a 136 000 vezes g a quatro graus Celsius durante duas horas para granular os vírions. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento num mililitro de tampão.

Comece este procedimento interrompendo os vírions. Adicione quatro microlitros de uma solução de proteinase K de dois microgramas por microlitro às suspensões de pellets e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicionar um volume de álcool fenolólico clorofórmio isoamílico a cada amostra e agitar manualmente durante 20 segundos.

Centrifugar à temperatura ambiente a 16 000 vezes g durante cinco minutos. Remova a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo. Repita essa extração duas ou mais vezes.

Concentrar o ADN utilizando a precipitação de etanol. Use 0,3 molar de acetato de sódio pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 95%. Coloque as amostras a menos 20 graus Celsius por 30 a 60 minutos.

Em seguida, centrifugue a 13.000 vezes g por 10 a 20 minutos para granular o DNA. Trabalhando em uma bancada de laboratório, ressuspenda o pellet de DNA em um mililitro de tampão TE 0,1 milimolar. Filtrar a suspensão através de uma coluna comercial de filtração de gel por centrifugação.

Analise as amostras por eletroforese em gel de agarose a 1% usando coloração de brometo de etídio para visualizar as preparações de qualidade e avaliar a qualidade do DNA conforme descrito no texto. Quando examinadas por microscopia eletrônica de transmissão, partículas de vírus estavam presentes no pellet branco recuperado por fracionamento bruto de folhas de canna infectadas. A eletroforese em gel de agarose do DNA recuperado dos pellets verde e branco identificou duas bandas de DNA de alto peso molecular na fração branca indicada pelos pontos vermelho e amarelo.

A integridade do RNA isolado das folhas infectadas também foi verificada por eletroforese em gel de agarose. Este gráfico mostra a abundância e a distribuição taxonômica dos contigs montados a partir da preparação bruta do vírus. E este gráfico mostra as proporções de contigs de vírus associados à família Caulimoviridae, gênero Badnavirus e contigs associados a três espécies intimamente relacionadas.

Os próximos dois gráficos mostram a abundância de contigs derivados do sequenciamento de RNA com base em sua distribuição taxonômica. O gráfico à direita mostra a abundância de contigs dentro da população de contigs de vírus associados ao gênero Badnavirus da família Caulimoviridae e três espécies intimamente relacionadas. A comparação dos contigs de comprimento do genoma do vírus produzidos pelo sequenciamento de DNA e RNA como um andaime mútuo confirma a presença de dois genomas de vírus de comprimento total.

Finalmente, a análise de RT PCR usando RNA isolado de folhas infectadas pelo vírus detectou ambos os genomas do vírus. Uma vez dominada, essa técnica pode levar dois dias, enquanto um iniciante pode levar três dias. Ao realizar este procedimento pela primeira vez, é importante manter registros do volume de homogeneizado em cada um dos sobrenadantes para que, no final do procedimento, você possa comparar o rendimento final do DNA com o material de partida inicial.

Após sua descoberta, esse método abriu caminho no campo da virologia vegetal para os pesquisadores identificarem novos vírus de DNA no ambiente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como homogeneizar material vegetal, concentrar variantes e obter um bom rendimento de DNA que pode ser usado para sequenciamento de próxima geração. Não se esqueça de que trabalhar com a uréia e o fenol clorofórmio é extremamente perigoso e uma precaução como usar óculos de proteção, blusa e jaleco e máscara deve ser sempre tomada quando estiver trabalhando com esses produtos químicos.

Para uma ultracentrifugação segura, é importante equilibrar adequadamente os tubos, por isso é necessário pesá-los e colocá-los opostos um ao outro no balancim, assim como o peso deve estar entre 0,01 um do outro.