Combinando a análise de DNA em uma extração do Virion bruto com a análise do RNA das folhas infectadas para descobrir novos vírus de genomas
27 de julho de 2018
Aqui nós apresentamos uma nova abordagem para identificar a planta vírus com genoma de DNA dobro-costa. Utilizamos métodos padrão para extrair o DNA e RNA de folhas contaminadas e realizar o sequenciamento de próxima geração. Ferramentas de Bioinformatic montam sequências em contigs, identificam contigs representando genomas do vírus e atribuir genomas de grupos taxonômicos.
Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre virologia ambiental, como o surgimento de novas doenças. A principal vantagem deste método é a purificação de variantes livres de componentes celulares e o uso dessas variantes para extrair DNA para sequenciamento. Cheguei a esta ideia inicialmente quando descobrimos que as plantas em nossos viveiros estavam infectadas com um ou mais Badnavírus desconhecidos. Indivíduos novos neste método enfrentarão dificuldades por três razões. Primeiro, a homogeneização é uma etapa crítica para garantir rendimentos de qualidade. Segundo, a centrifugação diferencial pode produzir múltiplos pellets e é necessário saber como identificar e separar esses pellets. Terceiro, o bioanalisador também pode ser difícil de interpretar.
Um jaleco de laboratório e luvas devem ser usados em todas as etapas deste procedimento. Comece cortando 80 a 100 gramas de folhas de plantas doentes previamente congeladas a menos 20 graus Celsius. Em seguida, triture as folhas em um liquidificador Waring usando 200 mililitros de tampão de maceração e 0,5% de sulfito de sódio. Transfira o homogeneizado para um béquer de um litro.
Ainda utilizando equipamento de proteção individual apropriado, adicione 18 gramas de ureia e 25 mililitros de detergente não iônico a 10% ao homogeneizado e cubra o béquer com papel alumínio. Agite com um agitador magnético durante a noite. No dia seguinte, transfira o homogeneizado para frascos de rotor de centrífuga de 250 mililitros e centrifugue em rotor de ângulo fixo a 4000 ×g a quatro graus Celsius por 10 minutos. Recupere o sobrenadante e filtre por quatro camadas de pano de musselina. Meça o volume do homogeneizado líquido recuperado e, em seguida, distribua o homogeneizado em tubos de centrífuga de polipropileno de 38,5 mililitros. Centrifugue o homogeneizado a 40.000 ×g a quatro graus Celsius por 2,5 horas. Quando a centrifugação terminar, verifique a presença de um pellet verde no fundo do tubo e de um pellet branco ao longo da parede do tubo. Descarte o sobrenadante, mantendo ambos os pellets, e coloque as amostras no gelo.
Separar o pellet branco do verde é uma das etapas mais desafiadoras do procedimento. Exige paciência e habilidade.
Trabalhando em uma capela química, utilize um espátula de borracha para separar os pellets. Raspe e transfira os pellets para frascos de rotor diferentes. Coloque os frascos de rotor contendo os pellets brancos sobre gelo. Adicione um mililitro de água a cada frasco e pipete para cima e para baixo. A cada cinco minutos, durante um período de uma a duas horas, pipete a mistura para cima e para baixo para re-suspender o pellet. Após os pellets brancos terem sido re-suspensos, mantenha as suspensões durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, centrifugue a suspensão a 6000 vezes g a quatro graus Celsius durante 10 minutos para remover os detritos remanescentes. Transfira as suspensões concentradas para tubos novos e centrifugue a 136.000 vezes g a quatro graus Celsius por duas horas para sedimentar os viriões. Remova o sobrenadante e re-suspenda o sedimento em um mililitro de tampão.
Inicie este procedimento rompendo os vírions. Adicione quarenta microlitros de uma solução de proteinase K a dois microgramas por microlitro às suspensões do pellet e incube a 37 graus Celsius por 15 minutos. Adicione um volume de fenol clorofórmio álcool isoamílico a cada amostra e agite manualmente por 20 segundos.
Centrifugue à temperatura ambiente a 16.000 × g durante cinco minutos. Remova a fase aquosa superior e transfira para um novo tubo. Repita esta extração duas ou mais vezes.
Concentre o DNA utilizando precipitação com etanol. Use 0,3 molar de acetato de sódio pH 5,2 e 2,5 volumes de etanol a 95%. Coloque as amostras a menos 20 graus Celsius por 30 a 60 minutos. Em seguida, centrifugue a 13.000 ×g por 10 a 20 minutos para formar o pellet de DNA.
Trabalhando em uma bancada de laboratório, re-suspenda o pellet de DNA em um mililitro de tampão TE 0,1 milimolar. Filtre a suspensão por meio de uma coluna comercial de filtração em gel mediante centrifugação. Analise as amostras por eletroforese em gel de agarose 1% utilizando coloração com brometo de etídio para observar as preparações de qualidade e avaliar a qualidade do DNA conforme descrito no texto.
Quando examinadas por microscopia eletrônica de transmissão, partículas virais estavam presentes no pellet branco recuperado pela fracionamento bruto de folhas de cana infectadas. A eletroforese em gel de agarose do DNA recuperado dos pellets verde e branco identificou duas bandas de DNA de alto peso molecular na fração branca, indicadas pelos pontos vermelho e amarelo.
A integridade do RNA isolado de folhas infectadas também foi verificada por eletroforese em gel de agarose. Este gráfico mostra a abundância e distribuição taxonômica de contigs montados a partir da preparação bruta do vírus. E este gráfico mostra as proporções de contigs virais associados à família Caulimoviridae, ao gênero Badnavirus e a contigs associados a três espécies estreitamente relacionadas.
Esses dois próximos gráficos mostram a abundância de contigs derivados do sequenciamento de RNA com base em sua distribuição taxonômica. O gráfico à direita retrata a abundância de contigs dentro da população de contigs virais associados à família Caulimoviridae, gênero Badnavirus e três espécies estreitamente relacionadas. A comparação dos contigs do genoma viral obtidos por sequenciamento de DNA e RNA como um arcabouço mútuo confirma a presença de dois genomas virais completos.
Por fim, a análise de RT-PCR utilizando RNA isolado de folhas infectadas por vírus detectou ambos os genomas virais.
Uma vez dominada, esta técnica pode levar dois dias, enquanto um iniciante pode levar três dias. Ao realizar este procedimento pela primeira vez, é importante manter registros do volume do homogenato em cada um dos sobrenadantes, para que, ao final do procedimento, você possa comparar o rendimento final de DNA com o material inicial de partida.
Após sua descoberta, este método abriu caminho no campo da virologia vegetal, permitindo que pesquisadores identifiquem novos vírus de DNA no ambiente. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como homogeneizar material vegetal, concentrar variantes e obter um bom rendimento de DNA que possa ser utilizado para sequenciamento de nova geração. Não se esqueça de que trabalhar com ureia e fenol clorofórmico é extremamente perigoso, e precauções, como o uso de óculos, luvas e jaleco, além de máscara, devem ser sempre tomadas ao manipular esses produtos químicos. Para uma ultracentrifugação segura, é importante equilibrar corretamente os tubos; portanto, é necessário pesá-los e posicioná-los em posições opostas no rotor, garantindo que suas massas difiram em no máximo 0,01 entre si.
Visão Geral
Este artigo apresenta um método inovador para identificar vírus de plantas com genomas de DNA de dupla fita por meio da extração de DNA e RNA de folhas infectadas e sequenciamento de nova geração. A abordagem enfatiza a purificação de variantes virais de componentes celulares, permitindo o sequenciamento preciso e a classificação taxonômica.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Virologia de Plantas
- Virologia Ambiental
- Sequenciamento Genômico
Antecedentes
- A identificação de vírus de plantas é essencial para compreender doenças emergentes.
- Os métodos anteriores enfrentaram dificuldades na separação dos componentes virais do material vegetal.
- Este estudo apresenta uma técnica aperfeiçoada para aumentar o rendimento e a qualidade do DNA viral.
- O conhecimento da distribuição taxonômica de vírus pode auxiliar em estudos ecológicos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método confiável para o isolamento e sequenciamento de vírus de plantas.
- Aprimorar a compreensão da diversidade e distribuição viral no ambiente.
- Facilitar a identificação de novos vírus de DNA que afetam plantas.
Métodos Utilizados
- Homogeneização de folhas de plantas infectadas seguida por centrifugação diferencial.
- Separacão dos pellets virais e purificação utilizando extração com fenol-clorofórmio.
- Concentração do DNA por precipitação com etanol.
- Análise da qualidade do DNA por eletroforese em gel de agarose e microscopia eletrônica de transmissão.
Resultados Principais
- Isolamento bem-sucedido de DNA de alto peso molecular de folhas infectadas por vírus.
- Identificação de dois genomas virais completos por meio de sequenciamento.
- Gráficos que mostram a distribuição taxonômica dos contigs montados.
- A PCR com transcriptase reversa confirmou a presença dos genomas virais identificados.
Conclusões
- Este método aumenta significativamente a capacidade de identificar novos vírus de plantas.
- Ele fornece uma estrutura para pesquisas futuras em virologia ambiental.
- O domínio desta técnica pode agilizar o processo de identificação viral.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este método permite que equipes de P&D biofarmacêuticas identifiquem genomas virais de plantas inéditos ao integrar sequenciamento de DNA e RNA a partir de extratos brutos de viriões, apoiando a validação precoce de alvos na descoberta de antivirais. Ao recuperar sequências indicativas de replicação viral ativa, o método fornece confiança preditiva para campanhas downstream de desvio mecanicista e identificação de compostos líderes. A abordagem aborda um ponto crítico de descoberta: a diferenciação entre vírus em replicação e retroelementos endógenos, melhorando assim o triagem de portfólios para alvos terapêuticos ou diagnósticos baseados em plantas.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Investiga hipóteses terapêuticas ao confirmar infecção viral ativa por meio da montagem concordante de genomas de DNA e RNA.
- Valor Operacional: Reduz falsos positivos provenientes de elementos virais integrados, aumentando a confiança no alvo durante triagens iniciais.
- Valor Preditivo: Reforça a confiança preditiva ao distinguir vírus em replicação de ruídos transcricionais.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão para Ensaios: Produz ácidos nucleicos virais purificados adequados para qPCR, sequenciamento ou desenvolvimento de ensaios baseados em hibridização.
- Reprodutibilidade: Etapas padronizadas de separação do pellet e concentração de DNA permitem um material de entrada consistente para campanhas de triagem.
- Escalabilidade: Utiliza equipamentos de laboratório comuns (batedeira, centrífuga, fenol-clorofórmio), facilitando a adaptação em diferentes sistemas modelo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância para a Doença: Recupera genomas de badnavírus em infecção ativa, apoiando o alinhamento de biomarcadores translacionais em modelos de doenças de plantas.
- Continuidade Pré-clínica: Permite a transição da descoberta para a validação pré-clínica ao fornecer genomas virais autênticos para estudos de desafio.
- Avanço com Base no Risco: Confirma a presença viral por meio de RT-PCR, apoiando decisões de seguir/não seguir na otimização de fármacos antivirais.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método insere-se na fase inicial da descoberta, conectando a testagem de hipóteses em virologia ambiental à identificação de candidatos promissores por meio da recuperação validada de genomas virais.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante o isolamento de viriões de matrizes vegetais complexas e a confirmação do estado de infecção por meio de análise dupla de ácidos nucleicos.
- Triagem: Fornece extratos padronizados de DNA e RNA com redução de contaminantes, permitindo desempenho confiável em ensaios subsequentes.
- Análises: Gera resultados quantificáveis (comprimento de contig, distribuição taxonômica, positividade em RT-PCR) para análise comparativa entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta a descoberta ao trabalho pré-clínico ao fornecer genomas virais autênticos para validação funcional em sistemas relevantes para a doença.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma capacidade reutilizável para prospecção viral em diversos hospedeiros vegetais e amostras ambientais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Redução de riscos mecanicistas por meio da confirmação de genomas virais em replicação, diminuindo a ambiguidade na validação de alvos.
- Valor Operacional: Padronização por meio de etapas definidas de centrifugação, extração com fenol-clorofórmio e precipitação com etanol.
- Valor Estratégico: Orienta decisões mais precisas de prosseguir ou não ao distinguir patógenos ativos de fósseis genômicos, reduzindo riscos biológicos em estágios avançados.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos antivirais com base na presença confirmada do vírus e na integridade do genoma.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em purificação de virions, separação de pellets e manipulação de ácidos nucleicos.
- Depende do acesso a ultracentrífugas, fenol-clorofórmio e instrumentos bioanalisadores.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de homogeneização e centrifugação.
- A adaptação entre sistemas modelo pode exigir a otimização da composição do tampão e das velocidades de centrifugação.
- As limitações práticas incluem a manipulação de produtos químicos perigosos (ureia, fenol-clorofórmio) e a dificuldade técnica na separação dos pellets branco e verde.
