Name: Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Aprenda a triagem automatizada de exopolissacarídeos microbianos com identificação de impressões digitais de carboidratos. Este método modular acelera a pesquisa de polímeros e permite descobrir novas variantes com propriedades específicas.

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Agradecemos sinceramente a Thomas Howe e Jörg Carsten pela programação e suporte técnico com os sistemas de manuseio de líquidos.

<ol><li>Milani, J., Maleki, G. Ch. 2, Hydrocolloids in Food Industry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilani%2C+J+%22Food+Industrial+Processes+-+Methods+and+Equipment%22">Food Industrial Processes - Methods and Equipment</a>. Valdez, B. 2, InTech. (2012).</li>
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<li>Masuko, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+analysis+by+a+phenol-sulfuric+acid+method+in+microplate+format%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate analysis by a phenol-sulfuric acid method in microplate format.</a> Anal Biochem. 339 (1), 69-72 (2005).</li>
<li>Geater, C. W., Fehr, W. R., Wilson, L. A., Robyt, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+rapid+method+of+total+sugar+analysis+for+soybean+seed%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Sci%22%5BJournal%5D)">A more rapid method of total sugar analysis for soybean seed.</a> Crop Sci. 41 (1), 250-252 (2001).</li>
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<li>Rühmann, B., Schmid, J., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+carbohydrate+analysis+via+liquid+chromatography+coupled+with+ultra+violet+and+electrospray+ionization+ion+trap+detection+in+96-well+format%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Fast carbohydrate analysis via liquid chromatography coupled with ultra violet and electrospray ionization ion trap detection in 96-well format.</a> J. Chromatogr. A. 1350, 44-50 (2014).</li>
</ol>

Não temos nada a divulgar.

Detecção de polissacárido com o método do fenol-ácido sulfúrico-ácido: Diferentes monossacáridos mostram diferentes máximos de absorção e coeficientes de extinção molar por utilização deste método 9. Isto resulta em diferentes máximos de absorção de polímeros, que contêm vários açúcares em quantidades diferentes. Os diferentes comprimentos de onda de absorção máxima para 16 polímeros disponíveis comercialmente diferentes são dadas na Tabela 5. Os polímeros foram dissolvidos (1 g / L) em ddH2O, agitada (150 rpm) durante a noite e medida com o-ácido-método do fenol-ácido sulfúrico . gum Diutan apresentou o menor absorção máxima a 470 nm ácido e escleroglucano e hialurônico a mais alta em 484 nm. Com base nestes resultados 480 nm foi escolhido para esta plataforma de triagem. A absorvância relativa dos polímeros foi calculado com base na absorvância obtida com 1 g / L de glucose (estabelecida como 100%). Os menores resultados foram obtidos com escleroglucano e succinoglicano, ambos com 92%. Este foi expected escleroglucano porque contém apenas glicose e succinoglicano contém glucose e de galactose numa razão de 7: 1. Ambos os polímeros comerciais têm diferentes perdas de secagem e diferentes teores de cinzas, esta é a razão pela qual o valor teórico de ~ 110% não foi atingida. Xylan apresentou a maior absorvância relativa com 311%. A razão para isto é o coeficiente de extinção molar elevada conseguida a partir de xilose, devido à forma de furanose mais dominante. A um nível de 0,1 g / L de glucose ao limite de quantificação foi alcançada, bem como o limite de detecção, a uma concentração &lt;0,05 g / L. No entanto, o limite de detecção para as estirpes positivas no rastreio é maior do que 0,7 g / L e, por conseguinte, o ensaio mostrou um bom desempenho. A fim de obter resultados fiáveis, os restantes de glicose após filtração em gel foi determinada com um ensaio de glucose-e este valor foi subtraído o valor do método do fenol-ácido sulfúrico-ácido. diluição glucose-ensaio automatizado: O desempenhoda determinação da glucose depois de cultivo (diluição 1: 100) foi investigada. Por isso, 10 ul de sobrenadante foram transferidos para 990 jil de ddH2O numa placa de poços profundos e misturados através de dez vezes de distribuição de aspiração e 180 ul para fora desta diluição. O segundo passo crítico foi a pipetagem correcta de apenas 5 ul alíquota para a diluição de 1:10 da glicose-ensaio depois de filtração em gel. A fim de gerar a diluição de 25 uL de ddH2O, foram transferidos com uma ponta 50 ul-início, depois 20 uL de ddH2O e 5 ul de gel filtrado foram aspirados em conjunto. Isto garante uma melhor remoção da alíquota de 5 ul para fora da ponta. Ambos os passos de diluição foram verificados com várias normas de glicose por meio de um ensaio de glucose-. Os resultados para duas concentrações exemplares são dadas na Tabela 6, O. 1: 100 de diluição para a determinação do teor de glucose após cultivo mostraram alta precisão para ambos os padrões, com um CV &amp; #60; 1,2%. Ao mesmo tempo, a precisão para o padrão mais elevado era até 11,6 (erro%). No entanto, esta é insignificante como a determinação da glicose representa apenas o teor de glucose remanescente após o cultivo e, portanto, não é importante para a detecção de polímero. A diluição de 1:10 para o restante da glicose após filtração em gel mostrou resultados muito confiáveis ​​com um CV &lt;1,4% e uma precisão &lt;2,1% de erro. Consideração da evaporação: O rastreio requer 3,5 horas a partir do primeiro passo para o primeiro glicose-ensaio. A fim de descobrir se este período de tempo tem uma influência sobre o armazenamento MTP uncapped, 50 ul de padrões de calibração de glicose-ensaio foram armazenadas com e sem cobertura para 3,5 horas no carrossel robô. Na gama de calibração (45 a 4,5 mg / L) a concentração da amostra não aumentou. Um aumento - causado por evaporação - estava abaixo de 2,1% e apenas para as duas concentrações mais baixas (1,8 e 0,9 mg / L) chegou-se a 12,4% ( <strong&gt; Tabela 7). Filtração em gel: Quantidades elevadas de glicose metabolizada não perturbar a detecção quantitativa de glicose a partir do polímero hidrolisado. Portanto, um passo de filtração em gel foi necessário para remover o remanescente de glucose após o cultivo. Além disso, o gel-filtração purifica o polímero contendo sobrenadante a partir de sais de hidratos de carbono e compostos monoméricos, outros do que a glicose, para minimizar o fundo na análise analítica monómero. No passo de filtração em gel de 35 ul de filtrado foram colocados no centro do poço. Para a validação da robustez de filtração em gel no sistema automatizado, oito padrões de calibração a partir de 0,045 até 9 g / L de glucose foram filtrados (n = 8). A glicose de cada concentração foi sempre reduzida em mais de 95% do valor inicial (Tabela 8). Ao fazê-lo, a filtração em gel, mostrou resultados muito bons para várias concentrações de glucose. Além disso, o restante da glicose após gel-filtration também foi determinada com um ensaio de glucose-e subtraída a partir da determinação de fenol-ácido sulfúrico-ácido para receber a quantidade correcta de equivalente de glucose para o polímero hidrolisado. Piruvato-ensaio: Em primeiro lugar, investigou-se se o neutralizada e diluída (1:10) de TFA-matriz a partir do passo de hidrólise interfere com a reacção enzimática. Portanto, o ensaio completo foi realizado duas vezes, uma vez com e uma vez sem matriz e mostrou resultados fiáveis. Finalmente, o teor de piruvato de 16 polímeros disponíveis comercialmente foi medida com sucesso e está representado na Figura 3. É do conhecimento geral que a partir desses polímeros única succinoglicano 16 e xantano contêm naturalmente piruvato. Com o nosso ensaio de piruvato-ambos estes polímeros foram correctamente identificadas. Em escleroglucano, goma welan e piruvato xilano também foi detectada em quantidades significativas. Em geral, a capacidade de a abordagem foi validado e a piruvato-ensaio showed um alto desempenho. Está provado ser capaz de detectar o piruvato em polímeros diferentes após hidrólise. impressão digital de carboidratos: Após a realização de todos os módulos analíticos na triagem automatizada, foram selecionados produtores de EPS potenciais para a análise de carboidratos impressão digital. Para isso, foram aplicados diversos critérios: 1) a observação positiva da viscosidade após a centrifugação e / ou após a filtração. 2) precipitação antes e depois da filtração. fibras observadas e flocos foram avaliados como positivos. 3) valor de equivalente de glucose a partir do método do fenol-ácido sulfúrico-ácido. Valores de&gt; 700 mg / L foram classificados como positivo e valores entre 300 e 700 mg / L foram classificados como produtores de EPS putativos. Quando dois ou três critérios foram avaliados como positivos, foram selecionadas as linhagens para posterior análise de impressões digitais de carboidratos. Os critérios pode ser personalizado para o efeito individual do EPS (por exemplo, rastreio EPS baixa viscosidade). A nossa abordagem com vista a encontrar efficient EPS produtores. Ao procurar por cepas que produzem apenas pequenas quantidades de EPS o limite de avaliação da glicose equivalente deve ser reduzida. benefício técnico e aplicações futuras: Uma característica interessante deste protocolo é o caráter modular das etapas e os diferentes módulos analíticos. Eles podem ser combinados de maneiras diferentes, ajustado aos requisitos individuais e novos módulos pode ser facilmente implementado. Além disso, os módulos de análise pode ser usado separadamente, por exemplo, o módulo de hidrólise em combinação com o módulo de HT-PMP-derivatização é capaz de realizar uma análise de composição monomérica a partir de soluções de polímeros diferentes (1 g / l) em formato de 96 poços. Para laboratórios sem ter acesso a um sistema de manipulação de líquidos ao rastreio completo possa ser manipulado manualmente, sem qualquer alteração no esquema de pipetagem. No entanto, usando um sistema de manuseamento de líquidos aumenta a taxa de transferência de até 768 estirpes (em vez de 192 estirpes se screened manualmente) por dia. O protocolo que é descrito aqui é capaz de uma triagem para géneros diferentes e, portanto, para a triagem de grandes coleções de tensão para identificar produtores novas EPS e analisar a sua impressão digital de carboidratos em uma abordagem (Figura 4). Além disso, um rastreio alvo de polissacarídeos contendo açúcares raros como fucose, ácidos urónicos ou mesmo açúcares desconhecidos pode ser realizada através da análise de monossacarídeos detalhado. Além disso, diferentes combinações de açúcar em proporções definidas podem ser detectados. Isso permite que a simples identificação de variantes estruturalmente relacionados de EPS já conhecidos ou novos EPS.

exopolissacáridos microbiana (EPS) são um grupo estruturalmente diverso de polímeros altamente que desempenham várias funções biológicas. Eles são construídos geralmente de unidades de repetição complexos, que são distinguidas pelos diferentes tipos de monómeros (açúcar, derivados de açúcar e ácidos de açúcar), as ligações entre estes monómeros e as suas substituições. A diversidade estrutural dos polissacarídeos microbianos confere características bastante diferentes para os membros desta classe molécula, o que permite sua aplicação em diferentes áreas, como alimentos 1, cosméticos 2,3, construção química 4 ou 5 tratamento de água. Para ampliar ainda mais o campo de aplicação destas de base biológica e tais polímeros sustentáveis ​​a identificação de novos polissacarídeos microbianos naturais, bem como a engenharia de variantes estruturais representa abordagens promissoras. De qualquer maneira, um método de triagem rápido é necessário para digitalizar rapidamente um grande número de estirpes microbianas para their formação de polissacarídeo, e analisar seus produtos. Por isso, nós desenvolvemos recentemente um de 96 poços plataforma HT-rastreio para a análise da produção de polissacarídeo microbiano a partir de isolados naturais ou variantes da estirpe por engenharia, que inclui a identificação da composição monomérica 6. Aplicando esta plataforma para uma primeira ronda de rastreio ~ 500 isolados naturais permitiu-nos identificar apenas cerca de 10 a 20% das estirpes isoladas como sendo capaz de produzir EPS (dados não mostrados). Isto significa que 80-90% das amostras analisadas não produziu EPS nas condições aplicadas, e, portanto, uma nova análise da impressão digital carboidratos detalhada não era necessário. Uma vez que esta identificação altamente sofisticada da composição monomérica é um processo demorado, especialmente para a análise de dados, um método de pré-rastreio rápido para identificar as estirpes positivas na produção de EPS, iria aumentar drasticamente a eficiência. Além disso, os reagentes,consumíveis e tempo de medição no UHPLC-UV-ESI-MS seria reduzido. Além disso, os diferentes módulos de análise, enquanto por um lado, tornar o método altamente fiáveis, são por outro lado, o que complica a movimentação manual de mais do que duas placas de 96 poços em paralelo, e, como tal restringem o pleno potencial do método. Por estas razões, decidimos desenvolver uma plataforma de triagem automatizada. Por isso, combinaram o formato modular da técnica de impressão digital de hidrato de carbono existente com um método de detecção rápida totalmente automatizada do seu conteúdo de açúcar total, com base em medições de absorvância. O método do fenol-ácido sulfúrico-ácido ainda representa o método de escolha para a determinação rápida do teor total de hidratos de carbono de plantas e bacterianas polissacáridos 7,8. Este método foi descrito pela primeira vez por Dubois et al. 9 e adaptado para diferentes aplicações e tamanhos de amostra, mesmo para pequena escala em placas de 96 poços 10,11. o phemétodo nol-ácido sulfúrico-ácido mede o teor total de hidratos de carbono por um valor, somatória todos monoméricos, oligoméricos e poliméricos os hidratos de carbono das amostras. Tendo em conta estes aspectos, a escolha de um meio de cultura apropriado é essencial para a aplicação deste método. meios complexos contendo compostos de hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos, como extracto de levedura pode levar a um teor de polímero alterada e, por conseguinte, deve ser estritamente evitado. Além disso, quantidades elevadas de açúcares são utilizados como fonte de C para o cultivo das estirpes. Altos níveis de hidratos de carbono restantes do processo de cultivo pode interferir negativamente com a medição do teor de EPS. Portanto, o uso de açúcares definidos e puros é aconselhada. Nas nossas experiências utilizou-se glucose para a cultura das células. O restante da glicose após cultivo foi reduzida por meio de uma filtração em gel e determinada através de um ensaio de glucose-. Por último, o equivalente de glucoses dos polissacáridos foram calculados subtraindo-se o restante da glicose após a filtração em gel, a partir do teor total de hidratos de carbono que tinha sido detectadas com o método do fenol-ácido sulfúrico-ácido. Filtração em gel e ensaio de glucose-em combinação com o método do fenol-ácido sulfúrico-ácido garantir resultados fiáveis ​​e são capazes de ser nosso primeiro sistema de detecção, completamente automatizado. Dois novos módulos de análise foram incluídos na plataforma de rastreio automatizado para aumentar a quantidade de informação a partir do sistema de detecção de EPS: a precipitação e a observação de um aumento da viscosidade. Muitos EPS diferentes - por exemplo succinoglicano, xantana e cólon ácido 12 - são relatados para ser modificado com um cetal piruvato não-carboidratos em posições de açúcar C4 e C6. Esses cetais piruvato (assim como ésteres de succinil meia e ácidos urônicos) contribuem para a natureza polyanionic e, portanto, ao prope físicarties do polímero por interagir através de pontes 13 de catiões divalentes. A fim de identificar os polímeros particulares a determinação de piruvato foi estabelecido como um outro módulo de análise adicional. Isto aumenta a informação sobre os substituintes de polissacáridos e suas propriedades macroscópicas potenciais. A combinação de todos os módulos permite a identificação de diferentes EPS, bem como uma determinação rápida e eficiente dos produtores de EPS. Por que a abordagem da plataforma de rastreio pode ser dividido em duas partes principais (Figura 1). Dentro da triagem automatizada (parte I) o fluxo de trabalho ocorre totalmente automatizado (Tabela 1) para pré-selecionar rapidamente os EPS cepas produtoras. A análise de hidratos de carbono da impressão digital (parte II) determina quantitativamente a composição de monómero do EPS produzidos pelas estirpes pré-seleccionados. Deste modo, a análise dos dados foi minimizado de modo a optimizar o rastreio de grandes colecções de deformação. esteoferece a possibilidade de analisar 384 cepas em uma única corrida de triagem automatizada e com duas corridas que são possíveis por dia de 768 cepas por dia. Além disso, a análise de carboidratos impressão digital dá uma visão ainda mais detalhada de todos os EPS identificados. Isto permite a análise e identificação de dirigido EPS variantes que diferem apenas ligeiramente ou completamente novos em comparação com as estruturas químicas já descritas de EPS.

<table><tbody><tr><td>Placa de 96 poços profundos 2,0 ml (DWP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780271</td><td>Cultura principal (CP 1-1 a 1-4), placas de equilíbrio para filtração em gel (CP 1-6, 1-7, 2-6 e 2-7), diluição 1:100 para o ensaio de glicose (CP 4-1 a 4-4) contendo 990&nbsp; &micro; l de ddH2O</td></tr><tr><td>Filme de vedação respirável</td><td>Axygen</td><td>BF-400-S</td><td>Filme de incubação para pré e cultura principal DWP</td></tr><tr><td>Filme de vedação de alumínio</td><td>Axygen</td><td>PCR-AS-200-80</td> <td>&deg; C filme de armazenamento para placas de estoque de glicerol</td></tr><tr><td>MCA96 Pontas Descartáveis Aninhadas 200 &micro; l</td><td>TECAN</td><td>30038619</td><td>Posição da mesa de trabalho (WTP 2-1 a 2-4)</td></tr> <tr><td>Placa de filtro de vidro A / B 1&nbsp; &micro; m</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8031</td><td>Armazenado em placa coletora (CP 2-1 a 2-4)</td></tr><tr><td>Placa de microtitulação de 96 poços Greiner de fundo em V</td><td>Bio-One</td><td>651201</td><td>Placa coletora para placa de filtração (CP 2-1 a 2-4)</td></tr><tr><td>Coluna giratória de 96 poços G-25</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-5612</td><td>Armazenado na lavagem DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 e 2-7)</td></tr><tr><td>Placa de microtitulação de 96 poços V-Bottom</td><td>Nunc</td><td>249944</td><td>Placa coletora para placa de filtração de gel (CP 3-1 a 3-4)</td></tr><tr><td>Pontas descartáveis aninhadas SBS 50 &micro; l pontas</td><td>TECAN</td><td>30038609</td><td>Posição do carrossel (CP 4-6, 4-7 e 5-1 a 5-6)</td></tr><tr><td>Calha 250 ml</td><td>Axygen</td><td>Res-SW96-HP</td><td>Water WTP 1-1, Mistura de reagente de ensaio de glicose WPT 1-2, tampão de acetato de amônio pH 5,6 (CP 5-7)</td></tr><tr><td>Placa de microtitulação de 96 poços F-Bottom (MTP)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655101</td><td>precipitação 1 (CP 6-1 a 6-4), valor de pH (CP 7-1 a 7-4), precipitação 2 (CP 8-1 a 8-4), método de ácido fenol-sulfúrico (CP 8-5 a 8-8), ensaio de glicose (CP 9-1 a 9-9), placas fictícias (WTP 3-1, 3-2)</td></tr><tr><td>Tapete de tampa de silicone de 96 poços;</td><td>Whatmann</td><td>7704-0105</td><td>Tapete de cobertura para MTP</td></tr><tr><td>200 &micro; l ponteiras de pipeta</td><td>Sarstedt</td><td>70.760.002</td><td>Para manuseio manual</td></tr><tr><td>de 1.000 &micro; l ponteiras de pipeta</td><td>Sarstedt</td><td>70.762</td><td>Para manuseio manual</td></tr><tr><td>de placa de micro titulação PCR de 96 poços</td><td>Marca</td><td>781350</td><td>Hidrólise, derivatização PMP TPE</td></tr><tr><td>(elastômero termoplástico) cap mat&nbsp;</td><td>Marca</td><td>781405</td><td>Hidrólise, derivatização PMP</td></tr><tr><td>Placa de filtro 0.2&nbsp; &micro; m Supor</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8019</td><td>Filtração de amostras para análise UHPLC-ESI-MS com uma placa coletora MTP</td></tr><tr><td>Pontas de pipeta LHS 5-300&nbsp; &micro; l</td><td>Marca</td><td>732150</td><td>Marca LHS sistema</td></tr><tr><td>Glicose oxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2133</td><td>Ensaio de glicose</td></tr><tr><td>Rábano peroxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Ensaio de glicose, ensaio de piruvata</td></tr><tr><td>DA-64 (N-(Carboximetilaminocarbonil)-4.4'-bis(dimetilamino)-difenilamina sal de sódio)</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>043-22351</td><td>Ensaio de piruvato</td></tr><tr><td>oxidase&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4591</td><td>Ensaio de piruvat</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Carl-Roth</td><td>P749.3</td><td>Ensaio de piruvata e glicose</td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>Carl-Roth</td><td>3904.3</td><td>Ensaio de piruvat e glicose</td></tr><tr><td>Pirofosfato de tiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754</td><td>Ensaio de piruvat</td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio hexahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31413</td><td>Ensaio de piruvat</td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>VWR</td><td>20922.466</td><td>Precipitação</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>VWR</td><td>20599.231</td><td>Método de ácido fenol-sulfúrico</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Carl-Roth</td><td>4623.4</td><td>Método de ácido fenol-sulfúrico</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td>Hidrólise</td></tr><tr><td>Solução de amônio</td><td>Carl-Roth</td><td>P093.1</td><td>Hidrólise, derivatização de PMP</td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>Hidrólise, derivatização de PMP</td></tr><tr><td>Vermelho de fenol;</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21710</td><td>Hidrólise, derivatização de PMP</td></tr><tr><td>1-fenil-3-metil-5-pirazolona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M70800</td><td>Derivatização de PMP</td></tr><tr><td>Metanol LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.320</td><td>Derivatização de PMP</td></tr><tr><td>Acetonitril LC-MS</td><td>VWR</td><td>83040.320</td><td>Derivatização de PMP</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>338826</td><td>derivatização de PMP</td></tr><tr><td>Etanol absolut</td><td>VWR</td><td>20821.321</td><td>Derivatização PMP Vermelho</td></tr><tr><td>de metila</td><td>Alfa Aesar</td><td>36667</td><td>valor de pH</td></tr><tr><td>Sistema robótico de manuseio de líquidos&nbsp;</td>Configuração da mesa de trabalho <td>Tecan</td><td>Freedom EVO</td><td>em Figure 2</td></tr><tr><td>Liquid handling station LHS</td><td>Brand</td><td>709400</td><td>Configuração da mesa de trabalho em Figure 2</strong</td></tr><tr><td>>Tip-Adapter</td><td>Brand</td><td>709434</td><td>Configuração da mesa de trabalho em Figure 2</td></tr><tr><td>Liquid Ends MC 20-300&nbsp; &micro; l</td> Configuração <td>da mesa de</td><td>trabalho 709416 da marca em Figura 2</td><td></td></tr><tr><td>Adapter 60 mm</td> Configuração da mesa de trabalho <td>da marca</td><td>709430</td><td>em Figura 2</td></tr></tbody></table>

automated modular high throughput exopolissacï¿½ido plataforma de triagem juntamente com análise carboidratos fingerprint highly sensitive

Automated Modular High Throughput Exopolysaccharide Screening Platform Coupled with Highly Sensitive Carbohydrate Fingerprint Analysis

Muitos microorganismos são capazes de produzir e secretar exopolissacarídeos (EPS), que têm implicações importantes nos campos da medicina, aplicações em alimentos ou na substituição de produtos químicos baseados em petro. Descrevemos uma plataforma de análise a ser automatizado em um sistema de manuseamento de líquido que permite a análise rápida e fiável sobre o tipo e a quantidade de EPS produzidos por microorganismos. Ele permite ao utilizador identificar novos produtores naturais exopolissacarídeo microbianas e para analisar a impressão digital de hidratos de carbono dos polímeros correspondentes no prazo de um dia de alto rendimento (HT). Usando esta plataforma, colecções de deformação, assim como bibliotecas de variantes de tensão que pode ser obtida em abordagens de engenharia podem ser rastreados. A plataforma tem uma configuração modular, o que permite uma separação do protocolo em duas partes principais. Em primeiro lugar, existe um sistema de rastreio automatizado, que combina diferentes módulos de detecção polissacarídeo: uma análise semi-quantitativa da viscositY formação por meio de um passo de centrifugação, uma análise da formação de polímeros por meio de precipitação com álcool e a determinação do teor total de hidratos de carbono através de uma transformação de fenol-ácido sulfúrico-ácido. Aqui, é possível rastrear até 384 cepas por corrida. A segunda parte apresenta uma análise monosaccharide detalhada para todos os produtores de EPS selecionados identificados na primeira parte pela combinação de dois módulos essenciais: a análise da composição de monómeros completa através de cromatografia líquida de ultra-alta performance juntamente com ultra-violeta e detecção ion trap ionização electrospray ( UHPLC-UV-ESI-MS) e a determinação de piruvato como um substituinte polímero (presença de cetal de piruvato) por oxidação enzimática, que é acoplado a uma formação de cor. Todos os módulos de análise desta plataforma de triagem podem ser combinados de maneiras diferentes e ajustada às necessidades individuais. Além disso, todos eles podem ser feitos manualmente ou realizada com um sistema de manuseamento de líquidos. Desse modo, a pla triagemTForm permite uma enorme flexibilidade, a fim de identificar vários EPS.

Apresentamos um método modular automatizado de alto rendimento para a identificação e caracterização de exopolissacarídeos microbianos em pequena escala. Este método combina uma pré-seleção rápida para analisar a quantidade total de polissacarídeos secretados com uma impressão digital detalhada de carboidratos para permitir a triagem rápida de cepas bacterianas recém-isoladas ou coleções inteiras de cepas.

Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive

Many microorganisms are capable of producing and secreting exopolysaccharides (EPS), which have important implications in medical fields, food ...

O objetivo geral dessa abordagem é a triagem rápida e confiável para produtores de exopolissacarídeos microbianos e a identificação de sua impressão digital de carboidratos. Este é um passo essencial para utilizar a diversidade inexplorada de exopolissacarídeos. Nosso método pode ajudar a acelerar a pesquisa de polímeros no campo de exopolissacarídeos microbianos.Ele permite a identificação rápida de novas variantes de polissacarídeos com diferentes propriedades para aplicações específicas. A principal vantagem desta técnica é a combinação de diferentes sistemas de detecção de exopolissacarídeos em um conceito de triagem modular e totalmente automatizado. Isso o torna extremamente rápido e confiável.Esta técnica também pode ser realizada manualmente em laboratórios onde não existe uma plataforma de automatização disponível, pelo que a sua utilização é muito flexível, podendo ser ajustada a diferentes necessidades de rastreio. Esta plataforma de triagem de exopolissacarídeos, ou EPS, possui uma configuração modular, que permite a separação do protocolo em duas partes principais, triagem automatizada e impressão digital de carboidratos. A primeira tarefa é cultivar as cepas para triagem e remover as células por centrifugação.As cepas são cultivadas em glicose como fonte de carbono em placas de 96 poços cobertas com filme de vedação respirável em agitador de placa de micro titulação a 30 graus Celsius e 1.000 RPM. No dia da tela, prepare a mesa de trabalho do robô e o carrossel de armazenamento conforme descrito no texto do protocolo. Remova o filme de vedação respirável das placas e aloque as culturas principais nas posições carrossel 1-1 a 1-4.Inicie o programa robótico automatizado. Para remover as células após o cultivo, transfira as placas de poços profundos da cultura principal do carrossel para a centrífuga e centrifugue a 4.300 x g e 20 graus Celsius por 30 minutos. Para a precipitação antes da filtração, mova as placas de microtitulação, bem como as placas de microtitulação indicadoras de pH, do carrossel para a mesa de trabalho.Transfira também as placas de filtração, que garantem a remoção completa de todas as células bacterianas, juntamente com as placas coletoras para suas posições na mesa de trabalho. Após a centrifugação, transferir 180 microlitros do sobrenadante da cultura principal para a placa de filtração. Aspire 150 microlitros do sobrenadante da cultura principal e dispense 50 microlitros na placa de microtitulação para precipitação antes da filtração e 100 microlitros na placa indicadora de pH.A precipitação do sobrenadante com 2-propanol é realizada para avaliar a produção de EPS. Use uma pipeta de várias etapas de 12,5 mililitros para adicionar manualmente 150 microlitros de 2-propanol a cada poço. Depois de agitar as placas de microtitulação em temperatura ambiente por 10 minutos a 900 RPM, observe visualmente as formações de fibras ou flocos que indicam a produção de EPS.Depois que as placas de cultura principais forem armazenadas de volta no carrossel, examine os caldos de fermentação, que devem mostrar diminuição da sedimentação após a centrifugação. O aumento da viscosidade é outra indicação da produção de EPS. A segunda tarefa é garantir a remoção completa das células do caldo de fermentação viscoso por meio de uma filtragem de 96 poços.Centrifugue as placas de filtração a 3.000 x g e 20 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, retorne as placas à sua posição inicial em carrossel e execute o equilíbrio da filtração em gel conforme descrito no texto do protocolo. Em seguida, pipete 35 microlitros de filtrado para o centro da placa de filtração de gel equilibrada e 50 microlitros para a placa de microtitulação que é usada para precipitação.Mova as placas de filtragem de gel para a centrífuga e mova todas as outras placas da mesa de trabalho de volta para as posições iniciais no carrossel. Após o armazenamento de todas as placas de volta no carrossel, observe os sobrenadantes altamente viscosos, conforme indicado pelos resíduos na placa filtrante. A falta de filtrado pode levar a resultados falsos negativos nos seguintes módulos analíticos.A terceira tarefa na triagem automatizada é a remoção dos açúcares monoméricos restantes do meio de crescimento por meio de uma filtragem de gel de 96 poços. Centrifugue as placas de filtração de gel a 1.000 x g e 20 graus Celsius por dois minutos. Prepare a mesa de trabalho através do manipulador robótico para processar os filtrados de gel.Para detectar a glicose restante após a filtração do gel, usamos pontas de 50 microlitros para transferir 25 microlitros de água duplamente destilada para uma placa de microtitulação fresca. Aspire 20 microlitros de água bidestilada Pegue pontas de 200 microlitros e aspire 50 microlitros de mistura de reagentes de ensaio de glicose da posição 1-2 da mesa de trabalho para iniciar o primeiro ensaio.Mova as placas de microtitulação para a incubadora. Após 30 minutos de incubação, mova as placas da incubadora para o leitor de microtitulação e registre a absorbância em 418 e 480 nanômetros. Para determinar o teor total de carboidratos pelo método fenol-ácido sulfúrico, pipete 20 microlitros de gel-filtrado para as placas de microtitulação.Remova manualmente as placas do carrossel e coloque-as na estação de manuseio de líquidos. Inclua a placa de calibração com 20 microlitros de diferentes concentrações de glicose em triplicatas. Coloque um recipiente de lixo na posição 1, uma caixa de ponta de 300 microlitros na posição 2 e uma calha de 250 mililitros com 110 mililitros de fenol-ácido sulfúrico recém-preparado na posição 3.Use uma pipeta de 8 canais com pontas de 300 microlitros para transferir 180 microlitros de ácido fenol-sulfúrico para cada fileira de todas as placas. Cubra todas as placas de microtitulação com tampas e misture agitando por cinco minutos a 900 RPM em temperatura ambiente. Incube por 35 minutos a 80 graus Celsius em um forno para a reação de cor.Depois de resfriar as placas sob uma capela de exaustão, meça a extinção em 480 nanômetros. As cepas da triagem automatizada são designadas como positivas para EPS se atenderem a pelo menos dois dos três critérios a seguir. Controle de viscosidade, detecção de polímero e equivalente de glicose calculado.O equivalente de glicose é calculado usando esta equação. A impressão digital de carboidratos da plataforma de triagem contém as três últimas tarefas que são executadas manualmente. O filtrado restante dos acertos positivos da tarefa dois fornece a base para o filtrado de gel na tarefa cinco.A tarefa seis é a micro hidrólise de 96 poços do gel-filtrado. Para conseguir isso, primeiro use uma pipeta de 12 canais de 50 microlitros para transferir 20 microlitros de filtrado de gel para uma nova placa de PCR. Em seguida, use uma pipeta de várias etapas de 1,25 mililitro para adicionar 20 microlitros de ácido trifluoroacético de quatro molares a cada poço.Cubra a placa de PCR com um tapete de tampa de elastômero termoplástico e coloque a placa de PCR em um dispositivo de fixação especial. Misture as soluções invertendo o dispositivo de fixação 10 vezes. Depois de centrifugar a placa de PCR e prendê-la no dispositivo de fixação, coloque o dispositivo de fixação seguro em um banho de areia pré-aquecido e incube a 121 graus Celsius por 90 minutos.Usando uma pipeta de 12 canais e 200 microlitros, adicione uma solução de 3,2% de amônia para ajustar o pH para aproximadamente oito. Cubra a placa de PCR com um tapete de tampa de elastômero termoplástico e agite-a manualmente usando o clampdispositivo de fixação. A tarefa final é analisar a impressão digital de carboidratos por meio do método de alto rendimento-1-fenil-3-metil-5-pirazolona, ou HTPMP.Para iniciar este procedimento, use uma pipeta de 50 microlitros de 12 canais para transferir 25 microlitros do hidrolisado neutralizado para uma nova placa de PCR. Adicione 75 microlitros de mistura de reagente de derivatização e cubra a placa com um tapete de tampa de elastômero termoplástico. Coloque a placa de PCR em um ciclador de PCR a 70 graus Celsius por 100 minutos, seguido de resfriamento a 20 graus Celsius.Transfira uma alíquota de 20 microlitros para uma nova placa de microtitulação e, em seguida, use uma pipeta de 12 canais de 200 microlitros para adicionar 130 microlitros de ácido acético 19,23 milimolar a cada linha. Misture diretamente por aspiração e dispensação pelo menos seis vezes e transfira todo o líquido para uma placa filtrante de 0,2 micrômetro com uma placa coletora de microtitulação. Centrifugue a placa a 1.000 x g por cinco minutos, remova a placa do filtro e sele a placa coletora de micro titulação com um tapete de tampa de silicone.Coloque a placa de microtitulação no UHPLC-UV-ESI-MS para a determinação da impressão digital do carboidrato. Esta tabela mostra os resultados de três novas cepas exemplares identificadas com sucesso com esta plataforma de triagem. A parte esquerda da tabela exibe os resultados dos módulos de triagem automatizados relativos à formação de viscosidade, produção de polímeros e o equivalente de glicose da hidrólise total, que foram usados como parâmetros de avaliação para análise detalhada de impressões digitais de carboidratos.A impressão digital de carboidratos baseada em açúcares calibrados, bem como açúcares, dímeros e substituintes desconhecidos, é fornecida na parte direita da tabela. Com o uso dessas informações, a composição monomérica pode ser calculada e comparada com estruturas poliméricas já conhecidas. Além disso, uma triagem direcionada para composições monoméricas interessantes e carboidratos raros pode ser realizada.Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita para 386 cepas em apenas cinco horas. Seguindo este procedimento, ensaios adicionais como o piruvato já existente ou outros ensaios para acetatos ou fosfato podem ser incluídos para responder a questões adicionais de declaração de exopolissacarídeos. Após seu desenvolvimento, esta técnica, por sua alta sensibilidade, abriu caminho para nossa pesquisa no campo de produtores de exopolissacarídeos microbianos de engenharia genética para explorar o efeito de vias biossintéticas de exopolissacarídeos alteradas na estrutura química residente.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar novos produtores de exopolissacarídeos de uma maneira muito rápida e confiável.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Uma maneira rápida é descrito para obter insights sobre a estrutura de polissacarídeos em uma matriz extracelular. O método aproveita a especificidade do glycosylhydrolases ea sensibilidade da espectrometria de massa permitindo que pequenas quantidades de materiais a serem analisados. Esta técnica é adaptável para ser usada diretamente sobre o tecido em si.

Oligo Profiling Massa (OLIMP) de polissacarídeos extracelulares

Um método simples e rápido para determinar o potencial de sacarificação de um grande número de amostras de biomassa vegetal é descrito. A plataforma automatizada para esta análise envolve a preparação da biomassa de plantas para análise em 96 placas bem e do desempenho posterior de hidrólise pré-tratamento e quantificação dos açúcares liberados.

Alto rendimento Assay Sacarificação para materiais lignocelulósicos

Profiling glicana de Polímeros da planta da parede celular usando Microarrays

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática ativa em carboidratos usando substratos de hidrogel de polímero cromogênico insolúvel. A enzima degrada esses substratos em um produto colorido solúvel que pode ser quantificado medindo a intensidade da cor do produto.

Ensaio de triagem enzimática à base de hidrogel de polímero cromogênico: um método de alto rendimento para rastrear as enzimas ativas em carboidratos usando substratos sintéticos

A estrutura da parede celular vegetal e as características químicas são avaliadas para identificar matérias-primas ideais para biocombustíveis e biomateriais. Os métodos padrão têm limitações quando aplicados a grandes conjuntos de dados. Esses métodos de pré-tratamento de alto rendimento, sacarificação enzimática e espectrometria de massa de feixe molecular de pirólise comparam um grande número de amostras de biomassa com tempo e custo experimentais reduzidos.

Rastreio de alto rendimento de Variações recalcitrância da biomassa lignocelulósica em: Total lignina, a lignina monómeros, e enzimática Sugar lançamento

Um protocolo de alto rendimento foi desenvolvido para purificação combinada de proteômica e glicômica e quantificação de LC-MS/MS no plasma. A análise de desamidação de motivos de glicosilação ligados a N foi específica para locais desglicosilados. A quantificação precisa de N-glicanos foi alcançada acoplando a separação de N-glicanos auxiliada por filtro à normalização da individualidade ao marcar com a estratégia de marcadores de hidrazida de glicano.

A Quantitative Glycomics e Proteomics Combinada estratégia de purificação

Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Descrevemos aqui a elevado-throughput detecção e quantificação de oligossacarídeos de leite humano de fucosilado (HMOs) usando um biossensor de células inteiras. Também demonstramos aqui, a adaptação desta plataforma para análise de cepas de produção de HMO, com foco na melhoria da relação sinal / ruído.

Análise de fucosilado humanos leite trissacarídeos biotecnológicas contexto usando geneticamente codificado biosensores

Microarray polymer profiling (MAPP) é uma técnica de alto rendimento para análise composicional de glicanos em amostras biológicas.

Perfil de polímero de microarray (MAPP) para análise de glicanos de alto rendimento

Um sistema para a análise automatizada e rápida de glicanos em proteínas foi desenvolvido anteriormente. Este artigo apresenta o protocolo para "análise glicoqualitativa", otimizado para um amplo espectro de usuários, como aqueles envolvidos na análise de estruturas de glicanos em biofármacos e outros materiais glicoconjugados.

Avaliação rápida glicoqualitativa de proteínas recombinantes usando um sistema totalmente automatizado

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Aprenda a triagem automatizada de exopolissacarídeos microbianos com identificação de impressões digitais de carboidratos. Este método modular acelera a pesquisa de polímeros e permite descobrir novas variantes com propriedades específicas.

Automated Modular High Throughput exopolissacï¿½ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive (Vídeo) | JoVE Journal

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