Automated Modular High Throughput exopolissac�ido Plataforma de Triagem Juntamente com Análise Carboidratos Fingerprint Highly Sensitive

O objetivo geral dessa abordagem é a triagem rápida e confiável para produtores de exopolissacarídeos microbianos e a identificação de sua impressão digital de carboidratos. Este é um passo essencial para utilizar a diversidade inexplorada de exopolissacarídeos. Nosso método pode ajudar a acelerar a pesquisa de polímeros no campo de exopolissacarídeos microbianos.

Ele permite a identificação rápida de novas variantes de polissacarídeos com diferentes propriedades para aplicações específicas. A principal vantagem desta técnica é a combinação de diferentes sistemas de detecção de exopolissacarídeos em um conceito de triagem modular e totalmente automatizado. Isso o torna extremamente rápido e confiável.

Esta técnica também pode ser realizada manualmente em laboratórios onde não existe uma plataforma de automatização disponível, pelo que a sua utilização é muito flexível, podendo ser ajustada a diferentes necessidades de rastreio. Esta plataforma de triagem de exopolissacarídeos, ou EPS, possui uma configuração modular, que permite a separação do protocolo em duas partes principais, triagem automatizada e impressão digital de carboidratos. A primeira tarefa é cultivar as cepas para triagem e remover as células por centrifugação.

As cepas são cultivadas em glicose como fonte de carbono em placas de 96 poços cobertas com filme de vedação respirável em agitador de placa de micro titulação a 30 graus Celsius e 1.000 RPM. No dia da tela, prepare a mesa de trabalho do robô e o carrossel de armazenamento conforme descrito no texto do protocolo. Remova o filme de vedação respirável das placas e aloque as culturas principais nas posições carrossel 1-1 a 1-4.

Inicie o programa robótico automatizado. Para remover as células após o cultivo, transfira as placas de poços profundos da cultura principal do carrossel para a centrífuga e centrifugue a 4.300 x g e 20 graus Celsius por 30 minutos. Para a precipitação antes da filtração, mova as placas de microtitulação, bem como as placas de microtitulação indicadoras de pH, do carrossel para a mesa de trabalho.

Transfira também as placas de filtração, que garantem a remoção completa de todas as células bacterianas, juntamente com as placas coletoras para suas posições na mesa de trabalho. Após a centrifugação, transferir 180 microlitros do sobrenadante da cultura principal para a placa de filtração. Aspire 150 microlitros do sobrenadante da cultura principal e dispense 50 microlitros na placa de microtitulação para precipitação antes da filtração e 100 microlitros na placa indicadora de pH.

A precipitação do sobrenadante com 2-propanol é realizada para avaliar a produção de EPS. Use uma pipeta de várias etapas de 12,5 mililitros para adicionar manualmente 150 microlitros de 2-propanol a cada poço. Depois de agitar as placas de microtitulação em temperatura ambiente por 10 minutos a 900 RPM, observe visualmente as formações de fibras ou flocos que indicam a produção de EPS.

Depois que as placas de cultura principais forem armazenadas de volta no carrossel, examine os caldos de fermentação, que devem mostrar diminuição da sedimentação após a centrifugação. O aumento da viscosidade é outra indicação da produção de EPS. A segunda tarefa é garantir a remoção completa das células do caldo de fermentação viscoso por meio de uma filtragem de 96 poços.

Centrifugue as placas de filtração a 3.000 x g e 20 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, retorne as placas à sua posição inicial em carrossel e execute o equilíbrio da filtração em gel conforme descrito no texto do protocolo. Em seguida, pipete 35 microlitros de filtrado para o centro da placa de filtração de gel equilibrada e 50 microlitros para a placa de microtitulação que é usada para precipitação.

Mova as placas de filtragem de gel para a centrífuga e mova todas as outras placas da mesa de trabalho de volta para as posições iniciais no carrossel. Após o armazenamento de todas as placas de volta no carrossel, observe os sobrenadantes altamente viscosos, conforme indicado pelos resíduos na placa filtrante. A falta de filtrado pode levar a resultados falsos negativos nos seguintes módulos analíticos.

A terceira tarefa na triagem automatizada é a remoção dos açúcares monoméricos restantes do meio de crescimento por meio de uma filtragem de gel de 96 poços. Centrifugue as placas de filtração de gel a 1.000 x g e 20 graus Celsius por dois minutos. Prepare a mesa de trabalho através do manipulador robótico para processar os filtrados de gel.

Para detectar a glicose restante após a filtração do gel, usamos pontas de 50 microlitros para transferir 25 microlitros de água duplamente destilada para uma placa de microtitulação fresca. Aspire 20 microlitros de água bidestilada Pegue pontas de 200 microlitros e aspire 50 microlitros de mistura de reagentes de ensaio de glicose da posição 1-2 da mesa de trabalho para iniciar o primeiro ensaio.

Mova as placas de microtitulação para a incubadora. Após 30 minutos de incubação, mova as placas da incubadora para o leitor de microtitulação e registre a absorbância em 418 e 480 nanômetros. Para determinar o teor total de carboidratos pelo método fenol-ácido sulfúrico, pipete 20 microlitros de gel-filtrado para as placas de microtitulação.

Remova manualmente as placas do carrossel e coloque-as na estação de manuseio de líquidos. Inclua a placa de calibração com 20 microlitros de diferentes concentrações de glicose em triplicatas. Coloque um recipiente de lixo na posição 1, uma caixa de ponta de 300 microlitros na posição 2 e uma calha de 250 mililitros com 110 mililitros de fenol-ácido sulfúrico recém-preparado na posição 3.

Use uma pipeta de 8 canais com pontas de 300 microlitros para transferir 180 microlitros de ácido fenol-sulfúrico para cada fileira de todas as placas. Cubra todas as placas de microtitulação com tampas e misture agitando por cinco minutos a 900 RPM em temperatura ambiente. Incube por 35 minutos a 80 graus Celsius em um forno para a reação de cor.

Depois de resfriar as placas sob uma capela de exaustão, meça a extinção em 480 nanômetros. As cepas da triagem automatizada são designadas como positivas para EPS se atenderem a pelo menos dois dos três critérios a seguir. Controle de viscosidade, detecção de polímero e equivalente de glicose calculado.

O equivalente de glicose é calculado usando esta equação. A impressão digital de carboidratos da plataforma de triagem contém as três últimas tarefas que são executadas manualmente. O filtrado restante dos acertos positivos da tarefa dois fornece a base para o filtrado de gel na tarefa cinco.

A tarefa seis é a micro hidrólise de 96 poços do gel-filtrado. Para conseguir isso, primeiro use uma pipeta de 12 canais de 50 microlitros para transferir 20 microlitros de filtrado de gel para uma nova placa de PCR. Em seguida, use uma pipeta de várias etapas de 1,25 mililitro para adicionar 20 microlitros de ácido trifluoroacético de quatro molares a cada poço.

Cubra a placa de PCR com um tapete de tampa de elastômero termoplástico e coloque a placa de PCR em um dispositivo de fixação especial. Misture as soluções invertendo o dispositivo de fixação 10 vezes. Depois de centrifugar a placa de PCR e prendê-la no dispositivo de fixação, coloque o dispositivo de fixação seguro em um banho de areia pré-aquecido e incube a 121 graus Celsius por 90 minutos.

Usando uma pipeta de 12 canais e 200 microlitros, adicione uma solução de 3,2% de amônia para ajustar o pH para aproximadamente oito. Cubra a placa de PCR com um tapete de tampa de elastômero termoplástico e agite-a manualmente usando o clampdispositivo de fixação. A tarefa final é analisar a impressão digital de carboidratos por meio do método de alto rendimento-1-fenil-3-metil-5-pirazolona, ou HTPMP.

Para iniciar este procedimento, use uma pipeta de 50 microlitros de 12 canais para transferir 25 microlitros do hidrolisado neutralizado para uma nova placa de PCR. Adicione 75 microlitros de mistura de reagente de derivatização e cubra a placa com um tapete de tampa de elastômero termoplástico. Coloque a placa de PCR em um ciclador de PCR a 70 graus Celsius por 100 minutos, seguido de resfriamento a 20 graus Celsius.

Transfira uma alíquota de 20 microlitros para uma nova placa de microtitulação e, em seguida, use uma pipeta de 12 canais de 200 microlitros para adicionar 130 microlitros de ácido acético 19,23 milimolar a cada linha. Misture diretamente por aspiração e dispensação pelo menos seis vezes e transfira todo o líquido para uma placa filtrante de 0,2 micrômetro com uma placa coletora de microtitulação. Centrifugue a placa a 1.000 x g por cinco minutos, remova a placa do filtro e sele a placa coletora de micro titulação com um tapete de tampa de silicone.

Coloque a placa de microtitulação no UHPLC-UV-ESI-MS para a determinação da impressão digital do carboidrato. Esta tabela mostra os resultados de três novas cepas exemplares identificadas com sucesso com esta plataforma de triagem. A parte esquerda da tabela exibe os resultados dos módulos de triagem automatizados relativos à formação de viscosidade, produção de polímeros e o equivalente de glicose da hidrólise total, que foram usados como parâmetros de avaliação para análise detalhada de impressões digitais de carboidratos.

A impressão digital de carboidratos baseada em açúcares calibrados, bem como açúcares, dímeros e substituintes desconhecidos, é fornecida na parte direita da tabela. Com o uso dessas informações, a composição monomérica pode ser calculada e comparada com estruturas poliméricas já conhecidas. Além disso, uma triagem direcionada para composições monoméricas interessantes e carboidratos raros pode ser realizada.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser feita para 386 cepas em apenas cinco horas. Seguindo este procedimento, ensaios adicionais como o piruvato já existente ou outros ensaios para acetatos ou fosfato podem ser incluídos para responder a questões adicionais de declaração de exopolissacarídeos. Após seu desenvolvimento, esta técnica, por sua alta sensibilidade, abriu caminho para nossa pesquisa no campo de produtores de exopolissacarídeos microbianos de engenharia genética para explorar o efeito de vias biossintéticas de exopolissacarídeos alteradas na estrutura química residente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar novos produtores de exopolissacarídeos de uma maneira muito rápida e confiável.