Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

O objetivo geral desta metodologia é avaliar várias enzimas usando um único sistema de triagem de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de microrganismos e bioengenharia sobre triagem metagenômica e engenharia enzimática. Desenvolvemos um sistema de triagem de enzimas genéticas que consiste no composto de fenileno que responde ao mutante MPL e seu repórter GFP a jusante.

Uma vez que qualquer gene metagenômico mostra a atividade enzimática de nosso interesse, reagindo com o substrato fornecido, um composto de fenileno do produto da reação ativa o mutante Dmp e desencadeia a expressão do repórter GFP que pode ser facilmente capturado por um medidor de fluorescência. A principal vantagem desta técnica é que, ao contrário das técnicas convencionais de triagem, este método único é aplicável para a triagem de vários tipos de enzimas diferentes usando o substrato apropriado. Demonstrando este procedimento estará Kil Koang Kwon, um estudante de pós-graduação em nosso laboratório.

Depois de construir uma biblioteca metagenômica em E.Coli com um vetor fosmídeo usando um kit de produção de biblioteca fosmídea, transporte o DNA pGESS (E135K) para as células da biblioteca metagenômica. Em seguida, armazene as células da biblioteca transformadas a menos 70 graus Celsius e alíquotas de 20 microlitros. Para remover os falsos positivos, primeiro descongele uma alíquota de célula de biblioteca metagenômica no gelo.

Em seguida, inocular dez microlitros das células descongeladas em dois mililitros de caldo de lisogenato contendo ampicilina e cloranfenicol em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros a 37 graus Celsius e 200 RPM por quatro horas. Enquanto isso, defina os parâmetros apropriados na máquina FACS para ler as células da biblioteca metagenômica no software FACS padrão. No final da incubação, transfira cinco microlitros de células para um mililitro de PBS em um tubo de fundo redondo de cinco mililitros.

Em seguida, carregue o exemplo de biblioteca diluído e ajuste a taxa de eventos para 1000 a 1500 eventos por segundo. Para gerar uma área de dispersão direta em escala logarítmica versus um gráfico de dispersão de área dispersa lateral em escala logarítmica em uma planilha global, crie um gráfico de pontos e desenhe uma porta poligonal ao redor dos eventos singleto que contêm a população bacteriana. Para traçar uma contagem de células versus histograma de área FITC em escala logarítmica, abra um histograma e ajuste a tensão FITC de modo que o pico da distribuição em forma de sino seja menor que dez para os dois da área FITC.

Em seguida, abra outro gráfico de pontos para criar uma área de dispersão direta em escala logarítmica versus um gráfico de área FITC logarítmica e defina uma porta de classificação R2 entre mais cinco e menos cinco por cento das células do centro da distribuição. Quando todos os portões estiverem definidos, coloque um tubo de coleta contendo 1,2 mililitros de caldo de lisogenato suplementado com antibiótico na saída do instrumento FACS e separe uma vez dez elevado à sexta das células fechadas no caldo. No final da classificação, tampe o tubo de coleta e subtraia suavemente as células.

Para rastrear as enzimas metagenômicas de interesse, incube as células classificadas a 37 graus Celsius e 200 RPM até que o OD600 atinja 0,5 e, em seguida, adicione um microlitro de solução de indução de cópia para amplificar o número de cópias de fosmídeos intracelulares. Após três horas a 37 graus Celsius e 250 RPM, combine 0,5 mililitros das células com o substrato apropriado em um tubo de fundo redondo de 14 mililitros até uma concentração final de 100 micromolares. Em seguida, incubar as amostras de controle e experimentais a 37 graus Celsius e 200 RPM por mais três horas.

Enquanto as amostras estão tremendo, defina os parâmetros da máquina FACS como acabamos de demonstrar. Em seguida, adicione cinco microlitros de células de cada amostra em tubos individuais de fundo redondo de cinco mililitros contendo um mililitro de PBS. Em seguida, carregue as células de amostra e defina a taxa de eventos para 1000 a 3000 eventos por segundo.

Crie uma área de dispersão direta em escala logarítmica versus um gráfico de dispersão da área de dispersão lateral em escala logarítmica e ajuste a porta de dispersão R1 para abranger as células bacterianas do evento singlete. Em seguida, crie um gráfico de dispersão de área FITC em escala logarítmica versus plotagem de área FITC em escala logarítmica e defina uma porta de classificação R2 para que menos de 0,1% das células negativas sejam detectadas. Agora, carregue o tubo de amostra e reajuste a taxa de eventos para 1000 a 3000 eventos por segundo, conforme necessário.

Em seguida, coloque um tubo de coleta contendo 0,5 mililitros de caldo de lisogenato na saída do instrumento FACS e colete uma vez dez elevado ao quarto das células dentro das portas R1 e R2. Quando todas as células tiverem sido isoladas, tampe o tubo de coleta e subtraia suavemente as células. Em seguida, espalhe 0,5 mililitros das amostras coletadas em duas placas de ágar de 90 milímetros contendo caldo de lisogenato suplementado com antibióticos e, em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.

Nesta figura, o protocolo de triagem demonstrado é ilustrado, incluindo a remoção dos falsos positivos por classificação negativa e a seleção de acertos positivos usando as portas de classificação R1 e R2. Os acertos podem então ser avaliados comparando a florescência da amostra com e sem o substrato. Nesta triagem mediada por acetato de p-nitrofina representativa, a florescência das células tratadas com substrato foi maior do que a das células controle, confirmando cinco candidatos a lipase neste experimento.

Apesar das amplas distribuições desses três candidatos à celulose, são observadas diferenças claras na intensidade média de FITC das populações. Esses quatro candidatos a fosfatase também demonstram altos níveis de florescência em comparação com as células de controle. Além disso, a atividade da fosfatase alcalina dos vetores inseridos por orf pode ser confirmada por citometria de fluxo com um sinal de florescência mais forte observado para o acerto enzimático do que para as células que carregam o plasmídeo vazio.

É importante lembrar que essa técnica pode ser aplicada à triagem de uma ampla gama de enzimas, escolhendo um substrato adequado e uma concentração de ração. Após este procedimento, outros métodos, como o sequenciamento de próxima geração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre a identificação e caracterização do candidato a enzima de maneira de alto rendimento. Após seu desenvolvimento, essa técnica de triagem enzimática de alto rendimento abriu caminho para pesquisadores no campo da engenharia enzimática explorarem várias enzimas metagenômicas sem a necessidade de uma especificidade enzimática.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o sistema de triagem de alto rendimento baseado em circuito metogênico com uma ampla gama de alvos enzimáticos.