Name: Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Aprenda a triagem de múltiplas enzimas usando um sistema genético de alta capacidade com detecção por fluorescência GFP. Este método identifica lipases, celulases e fosfatases alcalinas em uma única plataforma versátil.

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Esta pesquisa foi apoiada por doações do Intelligent Synthetic Biology Center of Global Frontier Project (2011-0031944), do Next-Generation Biogreen 21 Program (PJ009524), NRF-2015M3D3A1A01064875 e do KRIBB Research Initiative Program.

1. Preparação da biblioteca metagenômica com PNP-GESS <ol><li> Construir uma biblioteca metagenômica em E. coli com um vector fosmid usando um kit de produção fosmid biblioteca de acordo com o protocolo do fabricante 5. </li><li> Alíquota de 100 ul da biblioteca, para armazenamento a -70 ° C, que é uma fonte de células de biblioteca metagenomic. Nota: A densidade óptica de uma amostra medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD 600) deste estoque biblioteca é de aproximadamente 100. </li><li> Descongelar 100 ul da biblioteca metagenômico estoque em gelo e em inocular um balão de 500 ml contendo 50 ml de meio Luria-Bertani (LB) e 12,5 ug / ml de cloranfenicol seguido de 37 ° C de incubação, durante 2 h. </li><li> Colher as células num tubo de 50 ml por centrifugação a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento rapidamente em 50 ml de água destilada gelada (DW) e centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C novamente. </li><li> Resuspend o sedimento em 50 ul DW gelada com 10% (v / v) de glicerol. Utilizar 50 ul desta alíquota de células para electroporação. </li><li> Coloque a mistura de células electrocompetentes de 50 ul e pGESS (E135K) 5 de DNA (100 ng) numa cuvete de electroporação arrefecido em gelo e electroporar (1,8 kV / cm, 25 mF) a mistura. </li><li> adicionar rapidamente 1 ml de super caldo ideal com catabólica repressão médio (SOC) e voltar a suspender as células suavemente. </li><li> Transferir as células para um tubo de 14 ml de fundo redondo, usando uma pipeta e incubar a 37 ° C durante 1 h. </li><li> Espalhe 500 ul das células recuperadas numa LB 20 x 20 cm placa quadrada contendo 12,5 ug / ml de cloranfenicol e 50 jig / ml de ampicilina. Incubar a placa a 30 ° C durante 12 h. </li><li> Raspe as colónias usando um raspador de células e recolher células em um tubo cônico de 50 ml utilizando meios de armazenamento de células gelada. </li><li> Centrifugar a 1.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 10 ml de mídia de armazenamento de células geladaspara chegar a um OD 600 de 100. </li><li> Aliquota de 20 uL de células para armazenamento a -70 ° C. </li></ol> 2. Remoção falsos positivos a partir da biblioteca metagenômica <ol><li> Descongelar as células ações metagenomic biblioteca (do passo 1.13) contendo fosmid DNA metagenômica e pGESS (E135K) em gelo. </li><li> Inocular 10 ml de células em 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol em um tubo de fundo redondo de 14 ml. Incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 4 h. </li><li> Enquanto isso, ligue a máquina de FACS e abra o software FACS padrão. Utilize as seguintes definições: diâmetro da ponta do bico, 70 mm; Adiante Área de Dispersão (-A FSC) sensibilidade, 300 amplificação V-logarítmica; Side Area Scatter (-A SSC) Sensibilidade, 350 amplificação V-logarítmica; Área fluoresceína isotiocianato (FITC-A) sensibilidade, a amplificação de 450 V-logarítmica; parâmetro de patamar, FSC-Um valor 5. Nota: As configurações mais comuns são fornecidaspara o dispositivo de FACS mencionado na tabela de materiais. Ajustar as configurações para outros dispositivos de FACS. </li><li> Dilui-se as células a partir de bibliotecas metagenomic Passo 2.2 pela adição de 5 ul da amostra para um tubo de fundo redondo de 5 ml contendo 1 ml de PBS. </li><li> Colocar a amostra biblioteca diluída para o porto de carga do instrumento FACS e clique no botão de carga no Aquisição Painel do software FACS. </li><li> Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 1.500 eventos / seg clicando e controlar os botões Taxa de fluxo no painel. </li><li> Criar log escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão em uma planilha global, clicando no botão gráfico de pontos na barra de ferramentas. Ajuste o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) usando o botão Polígono Gate na barra de ferramentas. </li><li> Traçar um histograma com a contagem de células vs. log escalado FITC-A na planilha clicando no botão histograma. Em seguida, ajuste a tensão FITC do CytomeTer separador Definições na janela de Controlo Inspector de tal modo que o pico da distribuição em forma de sino é inferior a 10 2 de FITC-A. </li><li> Criar um log escalado FSC-A vs. o log FITC-A trama clicando no botão gráfico de pontos na planilha global. Definir um portão triagem R2 no terreno utilizando o botão de porta polígono na barra de ferramenta, de modo que a porta está localizada entre as células + 5% e -5% do centro da distribuição (10% total de células em torno do pico de a de sino curva em forma). </li><li> Colocar num tubo de recolha contendo 1,2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol na saída do instrumento FACS e classificar 10 6 células que satisfaçam ambos os R1 e R2 portas. </li><li> Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex. </li></ol> 3. metagenômico Enzyme Screening <ol><li> Incubar as células escolhidas (do passo 2.11) a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a DO600 atinge 0,5. </li><li> Adicionar 1 ml copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm. </li><li> Para preparar as células para seleccionar, adicionar 0,5 ml de células em cultura e de um substrato adequado (p-nitrofenil de etilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido, fosfato ou fenilo) para um tubo de 14 ml de fundo redondo numa concentração final de 100 uM. <ol><li> Para uma amostra de controlo, adicionar 0,5 ml de células cultivadas a partir do Passo 3.2 para um tubo de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 3.3. </li></ol></li><li> Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h. </li><li> Ao mesmo tempo, preparar a máquina de FACS com as mesmas configurações que o passo 2.3. </li><li> Adicionar 5 uL de células (para selecção), e células de controlo para dois tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente. </li><li> Colocar o tubo contendo células de controle para tele porto de carregamento dos FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando Taxa de Fluxo botões no painel. </li><li> Log criar escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha global do software e ajustar o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) utilizando o botão Polígono Portão sobre o barra de ferramentas. </li><li> Log criar escalado FSC-A vs. log escalado FITC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha e definir uma classificação portão R2 no terreno utilizando o botão Polígono Portão na barra de ferramentas para que menos de 0,1% de células negativas são detectados dentro do portão R2. </li><li> Substitua o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra de triagem, e ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando os botões Taxa de fluxo no painel. </li><li> Coloque um tubo de coleta contendo 0,5ml LB na saída do instrumento FACS e resolver 10 4 células que satisfaçam ambas as portas R1 e R2. Nota: O critério de ordenação pode variar de topo de 0,1% a 5% de FITC-A na porta R2. Neste protocolo, as células top 1% foram recolhidos como positivos. </li><li> Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex. </li><li> Espalhe as amostras de 0,5 ml recolhidos em duas placas de ágar (90 mm de placas de Petri) contendo LB, 50 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de cloranfenicol e Incubar a placa a 37 ° C durante a noite. </li><li> Se necessário, execute rodadas adicionais de triagem para FITC-A enriquecimento, repetindo as etapas 3.1-3.14. </li></ol> 4. Hit Confirmação Seleção e atividade enzimática <ol><li> Citometria de fluxo Análise <ol><li> A partir da placa incubada na Etapa 3.14, selecione uma colônia mostrando ausência de fluorescência usando um seletor de colônia sob a observação de 488 nm de comprimento de onda de um iluminador LED. </li><li> Inocular a colônia selecionado em um 14 ml ro-und fundo do tubo contendo 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a DO600 atinge 0,5. </li><li> Adicione 2 mL copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm. </li><li> Preparar um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar 1 ml de células em cultura (passo 4.1.3). Adicionar um substrato adequado (acetato de p-nitrofenilo, p -nitrophenyl- β -D-celobiósido, ou fosfato de fenilo) a uma concentração final de 100 uM. <ol><li> Para um controlo, adicionar 1 ml das células de cultura do passo 4.1.3 em um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 4.1.4. </li></ol></li><li> Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h. </li><li> Enquanto isso, prepare a máquina FACS com as mesmas configurações como Passo 2.3. </li><li> Adicionar 5 uL das células de controlo e substrato tratado para tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente. </li><li> Coloque as células controle tubo contendo no porto de carregamento do dispositivo FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel. </li><li> Clique no botão Aquisição para medir FITC-A. </li><li> Substituir o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra substrato tratado. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel. </li><li> Clique no botão Aquisição para medir FITC-A. </li><li> Comparar a fluorescência dos dois grupos de células através da representação gráfica de um histograma de contagem de células vs o log dimensionado FITC-A. </li></ol></li><li> Outros ensaios para confirmar a actividade da enzima <ol><li> Para posterior identificação dos candidatos de enzimas selecionadas, extrair DNA fosmid usando pro extração padrãoprocedimentos dos kits de extração comerciais e analisar a sequência de nucleotídeos, ou testar a atividade enzimática in vitro 6,7. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+screening+methods-biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Novel screening methods-biosensors.</a> Curr. Opin. Biotech. 35, 30-36 (2015).</li>
<li>Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-induced+gene-expression+screening+of+environmental+metagenome+libraries+for+isolation+of+catabolic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes.</a> Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).</li>
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<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+generalized+and+High-throughput+Enzyme+Screening+System+Based+on+Artificial+Genetic+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits.</a> ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).</li>
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<li>Warnecke, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+and+functional+analysis+of+hindgut+microbiota+of+a+wood-feeding+higher+termite%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite.</a> Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).</li>
<li>Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+propagation+of+cosmid+sized+human+DNA+inserts+in+an+F+factor+based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector.</a> Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).</li>
<li>Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocatalysts%3A+application+and+engineering+for+industrial+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Crc.+Cr.+Rev.+Biotechn%22%5BJournal%5D)">Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes.</a> Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).</li>
<li>Lorenz, P., Eck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomics+and+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Metagenomics and industrial applications.</a> Nat. Rev. Microbiol. 3 (6), 510-516 (2005).</li>
<li>Uchiyama, T., Miyazaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Product-induced+gene+expression%2C+a+product+responsive+reporter+assay+used+to+screen+metagenomic+libraries+for+enzyme+encoding+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes.</a> Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).</li>
<li>Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surveying+bio-transformations+with+%C3%A0+la+carte+genetic+traps%3A+translating+dehydrochlorination+of+lindane+%28gamma-hexachlorocyclohexane%29+into+lacZ-based+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes.</a> Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).</li>
<li>Tang, S. Y., Cirino, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+application+of+a+mevalonate-responsive+regulatory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein.</a> Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).</li>
<li>Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+an+Acinetobacter+regulon+for+biosensing+and+high-throughput+enzyme+screening+in+E.+coli+via+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

Aumentar a eficiência da produção de biocatalisadores é uma chave para o sucesso de bio-química indústria baseada 9 e metagenome é considerado um dos melhores fonte de enzima natural. Neste sentido, é essencial para o rastreio de novas enzimas a partir da metagenome onde a maioria dos recursos genéticos não têm sido explorados 10. Vários métodos de rastreio foram desenvolvidos que detectam directamente produtos enzimáticos utilizando activadores de transcrição 11, 12, mas estas técnicas ...

Uma técnica de ensaio de uma única célula de alto rendimento recentemente desenvolvido permite novas enzimas a ser rastreada a partir de uma biblioteca genética em larga escala com base nas suas actividades funcionais 1. No nível de célula única, as proteínas que regulam a transcrição são empregues para provocar a expressão do gene repórter por detecção pequenas moléculas que são produzidos como um resultado de uma actividade da enzima alvo. Uma abordagem precoce envolvido o isolamento de um operão de fenol-degradantes de Ralstonia eutropha E2 utilizando a expressão genética induzida por substrato rastreio método (SIGEX), em que o substrato induz a expressão de uma proteína repórter 2. NHAr de Pseudomonas putida foi usado para seleccionar benzaldeído desidrogenase 3, e de Corynebacterium glutamicum LysG foi utilizado para o rastreio de alto rendimento de uma nova estirpe de L-lisina-produzir diversas bibliotecas de mutantes 4. Anteriormente, uma enzima screeni genéticasistema ng (GESS) foi proposta como uma plataforma de triagem geralmente aplicável 5. Este sistema utiliza o regulador dimetilfenol-reconhecendo fenol, DMPR, de P. putida. DMPR (E135K), e um mutante de DMPR, também pode ser empregue em GESS (PNP-GESS) para a detecção de p-nitrofenol (PNP). Na presença de enzimas alvo a produção de compostos fenólicos, GESS em E. células de E. coli emite um sinal de fluorescência, permitindo o isolamento rápido de células isoladas usando um classificador de células activadas por fluorescência (FACS). Mas a expressão da enzima metagenômico parece ser mais fraca do que a de enzimas recombinantes convencionais; portanto, GESS foi desenhado para detectar compostos fenólicos com o máximo de sensibilidade ao investigar a combinação de local de ligação ribossómica (RBS) e sequências de terminação junto com ótima condição operacional 5. Uma das vantagens fundamentais do GESS é que este método único permite teoricamente o rastreio de OVer de 200 tipos diferentes de enzimas na base de dados BRENDA (Tabela 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) simplesmente empregar substratos diferentes. Foi mostrado que a celulase, lipase e hidrolase metil paration (MPH) pode ser detectada utilizando PNP-GESS com substratos apropriados de p-nitrofenilo butirato, p-nitrofenil-cellotrioside, e metil paration, respectivamente 5. Recentemente, provou-se que uma fosfatase alcalina (AP), que é uma das novas enzimas identificadas utilizando PNP-GESS, é o primeiro AP termolábil encontrados em metagenomes marinhos adaptados ao frio 6. Aqui, os detalhes do processo de triagem é apresentado com PNP-GESS detectar as actividades de três tipos diferentes de lipase enzymes-, celulase, e fosfatase alcalina -e rapidamente identificar novas enzimas candidatas a partir de uma biblioteca metagenômico 5,6. Os processos incluem metagenome pré-processamento com PNP-GESS e operação de uma flow citometria classificador. Enquanto os acertos obtidos terão de ser sequenciado para posterior identificação, este protocolo abrange o procedimento acima para os passos de confirmação de actividade enzimática utilizando citometria de fluxo.

<table><tbody><tr><td>Kit de</td> produção de biblioteca <td>CopyControl Epicentre</td><td>CCFOS110</td><td>Fosmid&nbsp;</td></tr><tr><td>Solução de indução CopyControl</td><td>Epicentro</td><td>CCIS125</td><td>Solução de indução de cópia Fosmid</td></tr><tr><td>EPI300</td><td>Epicentro</td><td>EC300110</td><td>Célula eletrocompetente</td></tr><tr><td>pCC1FOS</td><td>Epicentro</td><td>CCFOS110</td><td>vetor Fosmid</td></tr><tr><td>Gene Pulser Mxcell</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Cubeta de eletroporação e sistema eletroporado</td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Citometria de Fluxo (máquina FACS)</td></tr><tr><td>AZ100M</td><td>Microscópio Nikon</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UltraSlim&nbsp;</td><td>Iluminador LED</td> <td>Maestrogen</td><td></td></tr><tr><td>50-ml tubo cônico</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14-ml tubo de fundo redondo&nbsp;</td><td>Tubo</td> de fundo redondo BD Falcon <td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml</td><td>BD Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p-nitrofenil fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7653</td><td>Substrato</td></tr><tr><td>p-nitrofenil &beta;-D-cellobioside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N5759</td><td>Substrato</td></tr><tr><td>p-nitrofenil butilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9876& nbsp;</td><td>substrato</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB)</td> <td>BD Difco</td><td>244620</td><td>Triptona 10 g / L, Extrato de levedura 5 g / L, Cloreto de sódio 10 g / L</td></tr><tr><td>Caldo super ideal (SOB)</td> <td>BD Difco</td><td>244310</td><td>Triptona 20 g / L, Extrato de levedura 5 g / L, Cloreto de sódio 0,5 g / L, Sulfato de magnésio 2,4 g / L, Cloreto de potássio 186 mg / L</td></tr><tr><td>Caldo super ideal com repressão catabólica (SOC)</td><td></td> <td>SOB, 0,4% glicose</td><td></td></tr><tr><td>2x Extrato de levedura Triptona (2xYT)</td><td>BD Difco</td><td>244020</td><td>Digestão pancreática de caseína 16 g/L, Extrato de levedura 10 g/L, Extrato de levedura 5 g/L</td></tr><tr><td>Meio</td><td></td><td></td> de armazenamento celular <td>2x caldo YT, 15% de glicerol, 2% de glicose</td></tr><tr><td>pGESS(E135K)</td><td></td><td></td><td>Um vetor de DNA contendo dmpR, genes egfp com seus promotores apropriados, RBS e terminador. Veja a referência 5 no manuscrito para Mais detalhes.</td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>Citometria de Fluxo Software Versão 7.0</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td>0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4</td></tr></tbody></table>

multi-enzima triagem usando um de alta capacidade enzyme genética sistema de triagem

Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System

O recente desenvolvimento de uma técnica de ensaio de célula única de alto rendimento permite a triagem de novas enzimas com base em atividades funcionais de uma biblioteca metagenômica em larga escala1. Anteriormente, propusemos um sistema de triagem enzimática genética (GESS) que usa regulador de dimetilfenol ativado por fenol ou p-nitrofenol. Uma vez que uma grande quantidade de reações enzimáticas naturais produz esses compostos fenólicos a partir de substratos derivados de fenol, este único sistema de triagem genética pode ser teoricamente aplicado para rastrear mais de 200 enzimas diferentes no banco de dados BRENDA. Apesar da aplicabilidade geral do GESS, a aplicação do processo de triagem requer um procedimento específico para atingir os sinais máximos de citometria de fluxo. Aqui, detalhamos o processo de triagem desenvolvido, que inclui o pré-processamento do metagenoma com GESS e a operação de um classificador de citometria de fluxo. Três diferentes substratos fenólicos (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato) com GESS foram usados para rastrear e identificar três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina), respectivamente. As atividades enzimáticas metagenômicas selecionadas foram confirmadas apenas com a citometria de fluxo, mas o sequenciamento de DNA e diversas análises in vitro podem ser usados para posterior identificação gênica.

Os três substratos fenólicos foram examinados para identificar novas enzimas metagenomic de uma biblioteca metagenome de sedimentos planas oceano-corrente em Taean, Coreia do Sul, seguindo o protocolo proposto. Para a construção da biblioteca, média 30 - sequências metagenome 40 kb foram inseridos no fosmids, que são baseados na E. coli F fator de replicão e apresentados como uma única cópia de uma célula. Note-se que fosmids têm sido amplamente utilizados para a construção de b...

Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

The recent development of a high-throughput single-cell assay technique enables the screening of novel enzymes based on functional activities from a ...

O objetivo geral desta metodologia é avaliar múltiplas enzimas utilizando um único sistema de triagem de alto rendimento. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave nas áreas de micro-organismos e bioengenharia sobre triagem metagenômica e engenharia de enzimas. Desenvolvemos um sistema genético de triagem de enzimas composto pelo mutante MPL, que responde ao composto fenilenico, e seu repórter GFP downstream.Assim que qualquer gene metagenômico apresentar a atividade enzimática de nosso interesse ao reagir com o substrato fornecido, um composto fenilenico do produto da reação ativa o mutante Dmp e induz a expressão do repórter GFP, que pode ser facilmente detectada por um fluorímetro. A principal vantagem desta técnica é que, ao contrário das técnicas convencionais de triagem, este único método pode ser aplicado para a triagem de múltiplos tipos diferentes de enzimas mediante o uso do substrato apropriado. A demonstração deste procedimento será realizada por Kil Koang Kwon, aluno de pós-graduação em nosso laboratório.Após construir uma biblioteca metagenômica em E. coli com um vetor de fosmídeo utilizando um kit de produção de biblioteca de fosmídeos, transporte o DNA pGE

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este protocolo descreve um ecrã de alta taxa de transferência para a atividade celulolítica de uma biblioteca metagenomic expressa em Escherichia coli. A tela é solução baseada e altamente automatizado, e usa um pot-química em 384 microplacas bem com a leitura final como uma medida de absorbância.

A tela de elevada capacidade para Biomining Atividade da celulase de Bibliotecas metagenomic

Nós descrevemos um baixo custo, o método de alto rendimento para a tela para a atividade endoglucanase fúngicas...

High Throughput Screening da atividade endoglucanase de fungos em Escherichia coli</em

Fonte: Kim, H. et. al., Triagem Multienzimática Usando um Sistema de Triagem Enzimática Genética de Alto Rendimento. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um método de triagem genética para detectar a expressão enzimática usando bibliotecas metagenômicas de fosmid e substratos cromogênicos. A citometria de fluxo identifica e isola células individuais produzindo produtos coloridos, permitindo a seleção de alta produtividade das células ativas que expressam enzimas.

Detecção da expressão de enzimas-alvo em células bacterianas geneticamente modificadas

Neste vídeo, demonstramos um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática ativa em carboidratos usando substratos de hidrogel de polímero cromogênico insolúvel. A enzima degrada esses substratos em um produto colorido solúvel que pode ser quantificado medindo a intensidade da cor do produto.

Ensaio de triagem enzimática à base de hidrogel de polímero cromogênico: um método de alto rendimento para rastrear as enzimas ativas em carboidratos usando substratos sintéticos

Apresentamos um método de triagem rápida e de baixo custo para a identificação de reguladores de transcrição usando de alto rendimento transfections robóticos e um ensaio de luciferase dual-brilho caseiro. Este protocolo gera rapidamente dados funcionais diretos side-by-side para milhares de genes e é facilmente modificável para atingir qualquer gene de interesse.

De alta capacidade de Triagem funcional usando um caseiro Dual-brilho ensaio de luciferase

Aqui descrevemos um ensaio de gene repórter baseado em células como uma ferramenta valiosa para rastrear bibliotecas químicas em busca de compostos que modulam os mecanismos de controle pós-transcricional exercidos por meio de 3' UTR.

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

A fosforilação de proteínas é uma característica central de como as células interpretam e respondem às informações em seu meio extracelular. Aqui, apresentamos um protocolo de triagem de alto rendimento usando quinases purificadas de células de mamíferos para identificar rapidamente quinases que fosforilam um (s) substrato (s) de interesse.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening

Um ensaio de alto rendimento para triagem enzimática é descrito. Este kit de ensaio multiplexado pronto para uso é composto por substratos Chromogênicos Polymer Hydrogel (CPH) pré-escolhidos e substratos complexos de Chromogênico B iomassa (ICB). As enzimas-alvo são endoenzimas e proteases degradadoras de polissacarídeos.

High-throughput screening de enzimas Carboidratos-degradantes Usando Novel Insolúvel substrato cromogénico Kits de Ensaio

Esse protocolo apresenta um fluxo padrão de triagem de alta produtividade para microrganismos industriais. Envolve construir uma biblioteca mutante via mutagênese ARTP, realizar triagem positiva de gotículas com microfluídica automatizada e, posteriormente, verificar os resultados. A confiabilidade do fluxo de trabalho foi validada por meio de triagem de cepas de B. coagulans de alto rendimento.

Triagem de alto rendimento de mutantes Bacillus coagulans , hiperprodutora de ácido l-lático, utilizando uma plataforma microfluídica automatizada de gotículas

Um procedimento para líquidos baseados em cultura e distribuição...

Alto rendimento Triagem e Biossensoriais com Fluorescente C. elegans Cepas

Aprenda a triagem de múltiplas enzimas usando um sistema genético de alta capacidade com detecção por fluorescência GFP. Este método identifica lipases, celulases e fosfatases alcalinas em uma única plataforma versátil.

Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

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