Ressonância magnética funcional optogenética

O objetivo geral deste procedimento de imagem é combinar F-MRI com estimulação optogenética para mapeamento específico do tipo de célula de circuitos neurais funcionais e sua dinâmica em todo o cérebro vivo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência, como determinar o papel de elementos específicos do circuito cerebral na condução da atividade cerebral global. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a estimulação específica do tipo de célula e a leitura de resolução espacial relativamente alta da atividade cerebral global.

Demonstrando este procedimento estarão Jia Liu e Zhongnan Fang, estudantes de pós-graduação em meu laboratório. Após anestesiar o animal conforme descrito no protocolo de texto, raspar a cabeça com um barbeador elétrico e realizar uma esfoliação cirúrgica tripla na pele com Betadine e um enxágue com etanol a 70%. Em seguida, imobilize o crânio do animal em um aparelho estereotáxico.

Use um bisturi para fazer uma incisão no couro cabeludo na linha média de 15 a 20 milímetros. Retraia o couro cabeludo usando hemostáticos cirúrgicos fixados ao periósteo. Identifique os locais de Lambda e Bregma no crânio e, em seguida, posicione a broca sobre a região de interesse, ou ROI.

Faça uma pequena craniotomia sobre a ROI com uma broca dentária, tomando cuidado para não perfurar o cérebro. Insira lentamente uma agulha presa à seringa de microlitro através da craniotomia na ROI no cérebro. Em seguida, use um controlador de bomba de microsseringa para injetar dois microlitros da solução vetorial no ROI.

Após a conclusão da injeção, aguarde 10 minutos e, em seguida, remova lentamente a seringa a uma taxa de 0,5 milímetros por minuto. Após a injeção, seque a superfície do crânio. Confirme as coordenadas para o ROI e insira o implante de ponteira na profundidade desejada a uma taxa de 0,5 milímetros por minuto.

Por fim, monte o implante de ponteira no crânio usando cimento dentário. Depois que o cimento dentário solidificar, sele a incisão com suturas ao redor da tampa do cimento dentário. Comece conectando o patch cable de fibra óptica a uma fonte de luz laser e meça a saída na ponta do cilindro do patch cable com um medidor de energia.

Ajuste o nível de potência apropriado para produzir a saída desejada na ponta do cabo de fibra óptica, que é implantado dentro do cérebro. Evite vazamento de luz do implante cobrindo os olhos do animal. Em seguida, coloque a bobina sobre a cabeça do animal.

Use uma luva de ponteira para segurar o cabo de fibra óptica no implante da ponteira. Insira o suporte com o animal no orifício do scanner. Monitore a frequência respiratória e o CO2 corrente e a temperatura corporal durante todo o experimento, ajustando o ventilador artificial para manter os valores fisiológicos dentro dos limites adequados.

Conecte os cabos BNC da porta de disparo do scanner de ressonância magnética ao gerador de funções. Selecione uma sequência de posicionamento e clique em digitalizar'na janela de operação. Clique em continuar'para visualizar a localização da cabeça do animal.

Se o cérebro não estiver no isocentro, ajuste a localização da cabeça do animal e repita a varredura de posicionamento até que o cérebro esteja no isocentro. Adquira uma imagem anatômica de alta resolução para verificar a integridade geral do cérebro e confirmar a localização do implante de fibra óptica. Em seguida, selecione uma sequência ponderada T2.

Ajuste o número de fatias e clique em digitalizar para adquirir as imagens anatômicas coronais ponderadas em T2 de alta resolução. Por fim, selecione um gradiente de várias fatias recuperado sequência de eco e clique em continuar'para adquirir a imagem funcional. Este protocolo usa F-MRI optogenética para estimular o córtex motor em um modelo animal.

Este mapa de ativação mostra voxels ativados no córtex motor e no tálamo, indicando conexões sinápticas de longo alcance entre essas regiões. Aqui, o sinal em negrito é mostrado para voxels ativos no córtex motor e no tálamo durante a estimulação optogenética do córtex motor. A função de resposta hemodinâmica talâmica mostra uma resposta tardia em relação à resposta no córtex motor após a estimulação.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar cirurgias de implantação e ressonância magnética funcional optogenética. Uma vez dominado, este procedimento de imagem pode ser concluído em duas horas. Ao tentar este procedimento, é muito importante monitorar o animal e manter sua fisiologia dentro dos limites normais.

Após esse procedimento, métodos complementares podem ser usados, como eletrofisiologia para investigar a dinâmica temporal da neuroatividade ou imuno-histoquímica para validar a expressão e especificidade da opsina. O desenvolvimento dessa técnica abriu caminho para os neurocientistas investigarem a conectividade funcional em um cérebro vivo e intacto. Não se esqueça de que trabalhar com um scanner de ressonância magnética pode ser extremamente perigoso.

Precauções como manter o equipamento magnético suficientemente longe do scanner devem sempre ser tomadas ao seguir este procedimento.