Ressonância magnética funcional optogenética
19 de abril de 2016
Este protocolo descreve as etapas e a análise de dados necessárias para realizar com sucesso a ressonância magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI é uma nova técnica que combina leitura de fMRI de alto campo com estimulação optogenética, permitindo o mapeamento específico do tipo de célula de circuitos neurais funcionais e sua dinâmica em todo o cérebro vivo.
O objetivo geral deste procedimento de imagem é combinar a RNMf com estimulação optogenética para mapear, de forma específica por tipo celular, circuitos neurais funcionais e suas dinâmicas em todo o cérebro vivo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da neurociência, como determinar o papel de elementos específicos de circuitos cerebrais no controle da atividade cerebral global. A principal vantagem desta técnica é que ela permite estimulação específica por tipo celular e uma leitura com resolução espacial relativamente alta da atividade cerebral global.
Demonstrarão este procedimento Jia Liu e Zhongnan Fang, estudantes de pós-graduação no meu laboratório. Após anestesiar o animal conforme descrito no protocolo textual, realize a depilação da cabeça com uma máquina elétrica e execute uma limpeza cirúrgica tripla na pele utilizando Betadine e uma lavagem com etanol 70%. Em seguida, imobilize o crânio do animal em um aparelho estereotáxico.
Use um bisturi para fazer uma incisão mediana no couro cabeludo de 15 a 20 milímetros. Retraia o couro cabeludo utilizando hemostatos cirúrgicos fixados ao periósteo. Identifique as localizações de Lambda e Bregma no crânio, em seguida posicione a broca sobre a região de interesse, ou ROI.
Faça uma pequena craniotomia sobre a região de interesse (ROI) com uma broca dentária, tomando cuidado para não perfurar o cérebro. Insira lentamente uma agulha acoplada à seringa de microlitros através da craniotomia até a região de interesse no cérebro. Em seguida, utilize um controlador de bomba de microsiringa para injetar dois microlitros da solução do vetor na região de interesse.
Após a conclusão da injeção, aguarde 10 minutos e, em seguida, remova lentamente a seringa a uma taxa de 0,5 milímetros por minuto. Após a injeção, seque a superfície do crânio. Confirme as coordenadas para a região de interesse e insira o implante de ferrule até a profundidade alvo a uma taxa de 0,5 milímetros por minuto.
Finalmente, fixe o implante do ferrule ao crânio usando cimento dental. Após o cimento dental ter solidificado, feche a incisão com pontos ao redor da tampa de cimento dental. Comece conectando o cabo de fibra óptica a uma fonte de luz a laser e meça a saída na ponta do barril do cabo de conexão com um medidor de potência.
Ajuste o nível de potência apropriado para produzir a saída desejada na ponta do cabo de fibra óptica, que está implantado dentro do cérebro. Evite vazamento de luz do implante cobrindo os olhos do animal. Em seguida, posicione a bobina sobre a cabeça do animal.
Use uma luva de ferrule para fixar o cabo de fibra óptica ao implante de ferrule. Insira o suporte com o animal na abertura do scanner. Monitore a frequência respiratória, o CO2 tidal e a temperatura corporal durante todo o experimento, ajustando o ventilador artificial para manter os valores fisiológicos dentro dos limites adequados.
Conecte cabos BNC da porta de gatilho do escâner de RM ao gerador de funções. Selecione uma sequência de posicionamento e clique em escanear na janela de operação. Clique em continuar para obter a imagem da localização da cabeça do animal.
Se o cérebro não estiver no isocentro, ajuste a posição da cabeça do animal e repita a varredura de posicionamento até que o cérebro esteja no isocentro. Adquira uma imagem anatômica de alta resolução para verificar a integridade geral do cérebro e confirmar a localização do implante da fibra óptica. Em seguida, selecione uma sequência ponderada em T2.
Ajuste o número de cortes e, em seguida, clique em "scan" para adquirir as imagens anatômicas coronais de alta resolução ponderadas em T2. Por fim, selecione uma sequência de eco de gradiente multicanal e clique em "continue" para adquirir a imagem funcional. Este protocolo utiliza fMRI optogenético para estimular o córtex motor em um modelo animal.
Este mapa de ativação mostra vóxeis ativados no córtex motor e no tálamo, indicando conexões sinápticas de longo alcance entre essas regiões. Aqui, o sinal robusto é mostrado para vóxeis ativos no córtex motor e no tálamo durante a estimulação optogenética do córtex motor. A função de resposta hemodinâmica talamica mostra uma resposta retardada em relação à resposta no córtex motor após a estimulação.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar cirurgias de implante e imagens funcionais por ressonância magnética com optogenética. Uma vez dominado, este procedimento de imagem pode ser concluído em duas horas. Ao realizar este procedimento, é muito importante monitorar o animal e manter sua fisiologia dentro dos limites normais.
Após este procedimento, métodos complementares podem ser utilizados, como eletrofisiologia para investigar a dinâmica temporal da neuroatividade, ou imunohistoquímica para validar a expressão e especificidade da opsinina. O desenvolvimento desta técnica abriu caminho para que neurocientistas investigassem a conectividade funcional em um cérebro intacto e vivo. Não se esqueça de que trabalhar com um scanner de ressonância magnética pode ser extremamente perigoso.
Precauções, como manter equipamentos magnéticos suficientemente afastados do scanner, devem sempre ser tomadas ao seguir este procedimento.
Visão Geral
Este protocolo descreve o procedimento e a análise de dados para a realização de imagens funcionais por ressonância magnética optogenética (ofMRI), uma técnica que integra fMRI de alto campo com estimulação optogenética. Este método permite aos pesquisadores mapear circuitos neurais funcionais e suas dinâmicas em cérebros vivos com especificidade de tipo celular.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Técnicas de Imagem
- Optogenética
Antecedentes
- A ofMRI combina a fMRI com estimulação optogenética.
- Essa técnica permite o mapeamento preciso de circuitos neurais.
- Ela aborda questões fundamentais sobre as funções dos circuitos cerebrais.
- Uma resolução espacial elevada é uma vantagem significativa desse método.
Objetivo do Estudo
- Demonstrar o uso da ofMRI para estudar circuitos neurais.
- Fornecer um protocolo detalhado para pesquisadores.
- Destacar a importância do monitoramento dos parâmetros fisiológicos durante o procedimento.
Métodos Utilizados
- Preparação do animal e anestesia.
- Craniotomia e injeção da solução vetorial no cérebro.
- Implante do cabo fibra-óptico e conexão a uma fonte de luz a laser.
- Uso do scanner de RM para aquisição de imagens e dados.
Resultados Principais
- Os mapas de ativação mostram conexões entre o córtex motor e o tálamo.
- Demonstrou resposta hemodinâmica tardia no tálamo.
- Implementação bem-sucedida da estimulação optogenética durante a aquisição de imagens.
- O procedimento pode ser concluído em aproximadamente duas horas.
Conclusões
- A ofMRI é uma ferramenta valiosa para estudar a conectividade funcional no cérebro.
- Manter a fisiologia do animal é crucial durante o procedimento.
- Métodos complementares podem aprimorar a compreensão da dinâmica da neuroatividade.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A ressonância magnética funcional optogenética (ofMRI) permite a investigação específica por tipo celular de circuitos neurais com resolução espacial de todo o cérebro, apoiando a validação de alvos na descoberta de fármacos neuropsiquiátricos. Ao associar a manipulação precisa de circuitos a leituras da atividade cerebral global, o método aumenta a redução de riscos mecanicistas e a confiança preditiva em hipóteses iniciais de alvos. Essa capacidade auxilia na triagem de portfólios ao esclarecer a conectividade funcional relevante para modelos de doenças e mecanismos terapêuticos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de elementos específicos dos circuitos cerebrais na geração de atividade global, apoiando testes de hipóteses terapêuticas.
- Valor Operacional: Oferece estimulação específica por tipo celular com leitura de alta resolução espacial da dinâmica cerebral.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera mapas de ativação que mostram conexões sinápticas de longa distância, como entre o córtex motor e o tálamo, para o planejamento de ensaios baseados em circuitos.
- Valor Operacional: Fornece medições quantitativas do sinal BOLD, permitindo a comparação entre condições de estimulação e respostas da rede.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Apoia a modelagem de sistemas relevantes para doenças por meio do mapeamento da conectividade funcional em cérebros vivos intactos nos estados saudável e doente.
- Valor Operacional: Facilita a continuidade desde a descoberta até a validação pré-clínica por meio de imagem não invasiva e repetível da atividade neuronal.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra à biologia descoberta ao permitir testes de hipóteses sobre a função do circuito, à triagem por meio de saídas quantitativas prontas para ensaios e à pesquisa translacional por meio da mapeamento conectômico relevante para doenças.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses, a clarificação de vias e a redução de riscos biológicos de alvos neurais.
- Triagem: Oferece padronização de ensaios, reprodutibilidade e leituras quantitativas de BOLD para avaliação de compostos.
- Análises: Fornece dados da função de resposta hemodinâmica e mapas de ativação para comparar o engajamento de circuitos entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica por meio do monitoramento de todo o cérebro em modelos de doenças.
- Reutilização Corporativa: Representa uma plataforma reutilizável para validação de alvos baseados em circuitos em diversos programas de descoberta em neurociência.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva, validação de alvos e redução da ambiguidade mecanicista em hipóteses baseadas em circuitos.
- Valor Operacional: Padronização, reprodutibilidade e escalabilidade do mapeamento de ativação cerebral específico por circuito.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais eficazes de prosseguir/não prosseguir, eficiência no uso de capital e redução de riscos biológicos em estágios avançados em programas neuropsiquiátricos.
- Impacto no Portfólio: Priorização e decisões de avanço ajustadas ao risco com base no engajamento do alvo em nível de circuito.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em neurociência, optogenética e física de ressonância magnética para implantação cirúrgica e aquisição de imagens.
- Exige um escâner de ressonância magnética de alto campo, fonte de luz a laser, implantes de fibra óptica e sistemas de monitoramento fisiológico.
- Exige padronização entre equipes para protocolos cirúrgicos, parâmetros de entrega de luz e sequências de imagem.
- Envolve considerações de adaptação entre espécies, regiões cerebrais e sistemas de expressão de opsina.
- Inclui limitações práticas, como invasividade cirúrgica, espalhamento da luz no tecido e complexidade na interpretação do sinal hemodinâmico.
