Duplo Emulsion Geração de utilizar um dispositivo de polidimetilsiloxano (PDMS) Co-Axial Flow Foco

O objetivo geral deste procedimento é construir e testar um dispositivo microfluídico todo em poli dimetil suboxano que utiliza foco de fluxo coaxial para gerar emulsões duplas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em química e biologia que requerem triagem de rendimento ultra-alto, como a evolução direcionada de enzimas e a identificação de fenótipos raros. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a produção rápida de geradores de emulsão dupla usando fabricação de litografia macia sem tratamentos de superfície especializados.

Para começar, projete as estruturas microfluídicas para fabricação de duas camadas. Usando o software AutoCAD, imprima os projetos em filme de placa de circuito com resolução de 10 mícrons, conforme descrito na referência mostrada aqui. Aplique um a dois mililitros de SU 8 30 35 no centro de um wafer de silício pré-limpo de três polegadas de diâmetro, coloque em um codificador de rotação e fixe-o no mandril.

Gire por 20 segundos a 500 RPMs, seguido de 30 segundos a 2000 RPMs. Remova o wafer e asse em uma chapa quente a 135 graus Celsius por 30 minutos. Deixe o wafer esfriar até a temperatura ambiente antes de passar para a próxima etapa.

Agora exponha o wafer revestido à máscara para a primeira camada sob uma luz LED agrupada por 90 segundos. Após a exposição, coloque o wafer de volta na placa de aquecimento a 135 graus Celsius por um minuto. Depois de resfriado, aplique de um a dois mililitros de SUH 2050 no centro do wafer.

Coloque o wafer de volta no codificador de rotação e gire por 20 segundos a 500 RPMs. Em seguida, gire por 30 segundos a 1.375 RPMs. Quando o codificador de centrifugação parar de girar, remova o wafer e coloque-o de volta na placa de aquecimento de 135 graus Celsius por 30 minutos.

Em seguida, resfrie o wafer de volta à temperatura ambiente antes de passar para a próxima etapa. Alinhe a máscara da segunda camada na geometria que foi padronizada nas etapas anteriores e exponha o wafer revestido à luz UV mais uma vez por três minutos após a exposição, coloque o wafer na placa quente de 135 graus Celsius por um minuto. Uma vez resfriadas, desenvolveu as máscaras imergindo o wafer em um banho agitado de propilenoglicol, acetato de éter monometílico.

Após 30 minutos no banho, retire o wafer e lave-o com isopropanol. Em seguida, asse o wafer na placa quente de 135 graus Celsius por um minuto. Resfrie o wafer e coloque o mestre desenvolvido em uma placa de Petri de 100 milímetros.

Prepare um lote de PDMS combinando 50 gramas de base de silicone com cinco gramas de agente de cura em um copo plástico. Use uma ferramenta rotativa equipada com uma vara de agitação para misturar os componentes e, em seguida, desgaseifique a mistura dentro de um dessecador por cerca de 30 minutos ou até que todas as bolhas de ar sejam removidas. Em seguida, despeje o PDMS sobre o mestre com uma espessura de três milímetros.

Em seguida, coloque a placa de Petri no dessecador para posterior desgaseificação. Depois que todas as bolhas forem removidas, asse o dispositivo a 60 graus Celsius por duas horas. Corte o dispositivo PDMS do molde usando um bisturi e coloque-o em uma superfície limpa com o lado do padrão voltado para cima.

Em seguida, corte o PDMS ao meio com uma lâmina de barbear para separar os dois lados do dispositivo na peça que contém a geometria de manuseio de fluido de 50 micrômetros impressa pelo mestre. Perfure as entradas e saídas fluídicas com um punção de biópsia de 0,75 milímetros. Em seguida, coloque as peças do PDMS com seus lados padronizados para cima em um plasma de câmara de plasma.

Trate o dispositivo com plasma de oxigênio a um milibar por 60 segundos em um limpador de plasma de 300 watts. Em seguida, remova as amostras e molhe a superfície da peça não extinta do PDMS com uma gota de água DI para servir como lubrificante temporário enquanto visualiza o dispositivo através de um microscópio estéreo. Coloque as superfícies tratadas com plasma juntas e deslize as superfícies até obter um bloqueio mecânico.

Quando as armações embutidas e as armações salientes se encaixarem, uma vez montadas, coloque o dispositivo em um forno a 60 graus Celsius e asse por dois dias para evaporar a água e completar a colagem. Em seguida, fixe o dispositivo montado em uma lâmina de vidro usando várias gotas de PDMS não curado, asse a construção em um forno a 60 graus Celsius por uma hora. Para curar o PDMS coloca, o chip microfluídico no palco de um microscópio invertido acoplado a uma câmera digital capaz de velocidades do obturador de pelo menos 100 microssegundos.

Em seguida, monte três seringas de 10 mililitros em bombas de seringa e prenda agulhas de calibre 27 em cada uma delas. Prenda cerca de 30 centímetros de dois tubos de PE a cada uma das agulhas e insira as pontas soltas dos tubos nos orifícios apropriados no dispositivo. Em seguida, insira um comprimento de 10 centímetros de PE dois na porta de saída do dispositivo e coloque a outra extremidade em um recipiente de coleta de lixo.

Uma vez configurado, prepare o dispositivo operando as bombas de seringa em altas taxas de velocidade. Pare as bombas. Assim que o fluido nos segmentos da tubulação atingir as portas de entrada do dispositivo, concentre o microscópio na região do chip que contém um orifício de 50 por 50 micrômetros e ajuste a estrutura para incluir o canal de saída a jusante.

Defina as bombas de seringa para fornecer o fluido ao gerador de emulsão dupla a uma taxa de fluxo de 250 microlitros por hora para a fase interna, 100 microlitros por hora para a fase intermediária e 700 microlitros por hora. Para a fase contínua. Aguarde 10 minutos para que o sistema se equilibre.

Em seguida, aumente a vazão da fase externa para 1050 microlitros por hora. Aguarde mais três a cinco minutos para que a geração de emulsões duplas se estabilize sob esse conjunto de condições de fluxo. Uma vez estabilizado, adquira cinco segundos de imagens de vídeo a 30 hertz.

Salve os vídeos para processamento offline por meio da análise manual de imagens. Repita este processo enquanto varia a taxa de fluxo da fase externa usando os valores encontrados na tabela um do protocolo de texto que acompanha. Mantenha as taxas das fases interna e intermediária.

Durante este processo, o dispositivo de emulsão dupla foi testado em uma variedade de condições de fluxo. Para demonstrar a formação de emulsões duplas monodispersas de tamanhos variados, a proporção da fase contínua para a soma da fase interna e intermediária é mostrada acima de cada imagem. Histogramas de diâmetros de gotículas para taxas de fluxo selecionadas mostram a relativa uniformidade no tamanho das gotículas geradas.

As emulsões duplas resultantes produzem uma variação média do coeficiente de diâmetro de 5,2% O dispositivo demonstra uma capacidade de formar emulsões duplas significativamente menores que a largura do orifício e mostra uma clara tendência decrescente com o aumento das taxas de fluxo. No fluxo de fase portadora mais alto testado, emulsões duplas de 14 micrômetros foram formadas usando o orifício de 50 por 50 micrômetros após seu desenvolvimento. Essa técnica abre caminho para que investigadores químicos e biológicos realizem experimentos microfluídicos de gotículas compatíveis com as plataformas padrão de detecção de citometria de fluxo.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar e testar geradores microfluídicos de emulsão dupla que usam técnicas simples de construção PDMS.