Reconstituição do Basic mitótico Fusos no esféricas Emulsão Gotas

O objetivo geral deste procedimento é reconstituir estruturas fusiformes mitóticas dentro do confinamento geométrico da água em gotículas de emulsão de óleo. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo de montagem de fusos mitóticos, como como os fusos são posicionados e montados e qual é a contribuição específica de componentes individuais para esses processos? A principal vantagem dessa técnica é que usamos uma abordagem de baixo para cima para reconstituir estruturas fusiformes dentro do confinamento geométrico que imita a forma de uma célula mitótica.

Este método também pode ser usado para estudar outros processos que dependem do confinamento celular. Misture 10 partes de pré-polímero PDMS com uma parte de agente de cura em uma massa total de cerca de 40 gramas. Em seguida, coloque a mistura em uma câmara de vácuo por cerca de 30 minutos para remover as bolhas de ar.

Enquanto isso, enrole papel alumínio ao redor do molde para criar um copo de um centímetro de profundidade com um diâmetro de quatro polegadas. Quando estiver pronto, despeje cerca de 3/4 da mistura PDMS no molde. Em seguida, retorne o PDMS a uma câmara de vácuo por mais 30 minutos.

Após a desgaseificação, cure o PDMS por uma hora a 100 graus Celsius. Enquanto isso, prepare algumas lâminas de vidro para o revestimento giratório, polvilhando-as com ar comprimido. Em seguida, gire a mistura PDMS restante nas lâminas.

Cure essas lâminas por uma hora a 100 graus Celsius para endurecer o PDMS. Em seguida, retire suavemente o PDMS usando uma lâmina de barbear e faça os orifícios necessários das tiras de PDMS para fazer chips microfluídicos. Agora, o corona trata o chip microfluídico e uma lâmina de vidro revestida com PDMS por alguns segundos.

Por fim, coloque um chip microfluídico em cada lâmina de vidro com os canais voltados para baixo e asse os chips durante a noite a 100 graus Celsius. Primeiro, usando copos lavados com clorofórmio, prepare cerca de 250 microgramas de lipídios dissolvidos com clorofórmio. Seque cuidadosamente a mistura lipídica com gás inerte.

E então coloque-o em uma câmara de vácuo por uma hora. Em seguida, dissolva os lipídios em óleo mineral e 2,5% de surfactante a 0,5 miligramas por mililitro, o que equivale a cerca de 500 microlitros. Para dissolver completamente os lipídios, sonicar a mistura por 30 minutos a 40 kilohertz.

Em seguida, gire o PDMS em vidros de cobertura com uma espessura que corresponda à objetiva do microscópio. Em seguida, gire o PDMS de revestimento em lâminas de vidro. Agora, cure os vidros revestidos com PDMS e as lâminas de vidro por uma hora a 100 graus Celsius.

Em seguida, faça as células de fluxo espaçando fatias finas de filme de vedação de laboratório nas lâminas de vidro revestidas com PDMS. Posicione tiras de três milímetros a cerca de dois milímetros de distância. Em seguida, cubra as células de fluxo com uma lamínula revestida com PDMS e sele o conjunto derretendo o filme a 100 graus Celsius por um minuto rápido.

Depois de aquecido, pressione suavemente a lamínula e sele-a com Valap. Em seguida, prepare um copo PDMS para imagens de longo prazo. Faça um furo de quatro milímetros de diâmetro em uma fatia de três milímetros de espessura de PDMS.

Em seguida, trate a fatia de PDMS e uma lamínula revestida com PDMS. Depois de tratados, posicione-os um em cima do outro e asse o conjunto durante a noite a 100 graus Celsius. Monitore a formação de gotículas em um microscópio de campo claro invertido.

Conecte a fase de óleo lipídico ao controlador de pressão e aumente a pressão até que uma gota de óleo saia da tubulação de pico. Conecte a tubulação de pico à entrada dois do chip microfluídico. Em seguida, preencha completamente os chips microfluídicos com a fase de óleo lipídico da entrada dois.

Em seguida, introduza a fase aquosa baseada em MRB-80 a partir da entrada um. Controle o tamanho da gota alterando as pressões da fase lipídica oleosa e da fase aquosa para criar gotículas com um diâmetro de cerca de 15 mícrons. Cerca de 800 milibar para a fase lipídica oleosa e 200 milibar para a fase aquosa é um bom ponto de partida.

Depois de obter o tamanho de gota desejado, preencha completamente a célula de fluxo com gotículas. Essas gotículas são formadas usando pequenos volumes da fase aquosa. Isso significa que a configuração microfluídica precisa ser executada rapidamente para não perder toda a fase aquosa antes que gotículas do tamanho correto sejam formadas.

Uma vez preenchido, feche cuidadosamente as extremidades da célula de fluxo usando Valap. Se as gotículas não pararem de se mover, a vedação não está completa ou bolhas de ar podem ter sido introduzidas. Para imagens de longo prazo, transfira as gotículas para um copo PDMS e cubra com uma camada de mistura lipídica de óleo.

Descongele os centrossomas à temperatura ambiente e coloque-os a 37 graus Celsius por 20 minutos para garantir a nucleação adequada dos microtúbulos. Enquanto espera, prepare a mistura de ensaio no gelo. Isso deve conter tubulina, GTP, um sistema de eliminação de oxigênio, geradores de força molecular, como reticuladores de microtúbulos, ATP e sistema de regeneração de ATP.

Depois de misturado, gire a amostra no rotor Airfuge resfriado a 30 psi por três minutos. Em seguida, adicione os centrossomas pré-aquecidos à mistura. Otimize a quantidade de centrossomas adicionados para obter um ou dois centrossomas por gota.

Em seguida, use essa mistura para produzir gotículas de emulsão conforme descrito anteriormente. Para recrutar dineína para lipídios biotinilados no córtex de gotículas, inclua GFP-dineína TMR e estreptavidina, para a fase aquosa. Em um microscópio confocal de disco giratório, visualize o crescimento dos microtúbulos após 30 minutos a 26 graus Celsius.

Durante a imagem, o crescimento dos microtúbulos pode ser promovido aumentando a temperatura para 28 ou até 30 graus Celsius. Para projeções Z, pegue pilhas com intervalos de um mícron, o que deve exigir cerca de 20 imagens por gota. Vá para o painel principal da câmera, clique em Editar Z e defina Z Step como 1.0.

Clique em Avançar para armazenar as configurações. Em seguida, defina o ganho EM linear máximo clicando na guia Câmera no painel Aquisição e deslizando a barra de ganho EM para 300. Em seguida, defina o tempo de exposição para 200 milissegundos na mesma guia.

Clique em Gravar para armazenar as configurações. Para experimentos de imagem ao vivo, faça projeções Z a cada dois minutos por duas horas, reduzindo os tempos de exposição para cerca de 100 milissegundos e aumentando os intervalos Z para dois mícrons. Para experimentos de imagem ao vivo, use um copo PDMS em vez de uma célula de fluxo regular para imobilização máxima da amostra.

Usando os protocolos descritos, a formação de ásteres foi estudada em gotículas de emulsão de água e óleo contendo centrossomas. Inicialmente, os centrossomas se difundem livremente dentro dos volumes confinados. Após cerca de 20 a 30 minutos, os primeiros microtúbulos tornam-se visíveis e a difusão do centrossomo torna-se restrita à medida que os microtúbulos crescem contra o córtex em todas as direções.

Quando os microtúbulos crescem mais da metade do diâmetro da gota, os centrossomas são empurrados para limites opostos, com microtúbulos crescendo ao longo do córtex da gota. Sem estreptavidina, a dimeína é difusa dentro da gotícula. No entanto, com a estreptavidina, cerca de 10 minutos após a formação das gotículas, a dineína se liga aos lipídios biotinilados.

Ao visualizar a tubulina fluorescente na presença de dineína cortical, fica claro que os centrossomas estão posicionados centralmente. Considerando que, na ausência de dineína, os centrossomas são empurrados para lados opostos da gota. Isso provavelmente se deve a catástrofes de microtúbulos que promovem dineína e forças de tração cortical, o que resulta na centralização dos ásteres.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar tecnologias microfluídicas para criar estruturas semelhantes a fusos em gotículas de emulsão esféricas. Uma vez dominado, a formação de gotículas e a imagem podem ser feitas em duas a três horas quando realizadas corretamente. Usando este procedimento, outros fatores de montagem do fuso podem ser encapsulados para estudar seu efeito na morfologia e posicionamento do fuso.

Precauções como usar luvas devem sempre ser tomadas durante o uso de clorofórmio ou PDMS.