Name: Reconstituição do Basic mitótico Fusos no esféricas Emulsão Gotas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprenda a reconstituir fusos mitóticos em gotículas de emulsão água-óleo usando microfluídica e microscopia confocal. Este método bottom-up permite estudar a dinâmica de microtúbulos e o posicionamento de centríolos em confinamento geométrico.

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Gostaríamos de agradecer aos membros do laboratório Dogterom pelas valiosas discussões. Agradecemos a Stefan Diez e Marcel Janson pelos reagentes e a Samara Reck-Peterson pela ajuda na purificação da dineína. Este trabalho foi apoiado por financiamento do Conselho Europeu de Investigação (bolsa ERC Synergy: MODEL-CELL).

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Os métodos descritos aqui presentes os recentes esforços para reconstituir eixos básicos mitóticas em água-em-óleo gotículas de emulsão. Estudar montagem do fuso dentro de limites geométricos oferece inúmeras vantagens. Existem mecanismos importantes de feedback entre os microtúbulos do fuso mitótico e as restrições geométricas em que são montadas. Os microtúbulos pode gerar forças que empurra quando crescem em limites geométricos, o que pode resultar num deslocamento do fuso mitótico. Além disso, crescendo em uma barreira física pode induzir catástrofes microtúbulos. Além disso, a montagem do eixo dentro de uma geometria confinada pode levar a uma redução gradual dos componentes individuais, tais como a tubulina, que por sua vez afecta directamente a taxa de crescimento dos microtúbulos 36. Estes são todos determinantes essenciais do porta-veios, que podem ser estudados utilizando os ensaios descritos aqui. Os ensaios descritos são muito sensíveis à pequena concentração diferenc ias de os componentes das gotículas. Este é o caso para a tubulina, em que as diferenças de concentração pequenas podem resultar em crescimento de microtúbulos, quer muito lenta ou muito rápida. Neste caso, as taxas de crescimento de microtúbulos pode muitas vezes ainda ser corrigido ajustando a temperatura durante o primeiro ~ 30 min da experiência. montagem do fuso mitótico e posicionamento é também muito sensível a variações na concentração dos geradores (cortical) de força. É provável que isto depende da concentração, a pureza e a actividade dos componentes purificados e precisa de ser cuidadosamente titulada para cada nova proteína purificada. Além disso, certas soluções de compromisso tem que ser feita em configurações de imagem, dependendo da natureza do ensaio. Inicialmente, altos níveis de dímeros de tubulina fluorescentes solúveis dificultar a imagem microtúbulos individuais. Como microtúbulos tubulina e crescer mais lentamente solúvel é esgotado, a relação sinal-ruído gradualmente torna-se maior e permite a imagiologia de INDIVIDUmicrotúbulos al. Em contraste com as configurações com sistemas abertos, o confinamento geométrica impede a troca de moléculas fluorescentes e componentes do sistema eliminador de oxigénio dentro de um reservatório a granel, resultando em branqueamento significativo. Especialmente para monitorizar a montagem do fuso e o posicionamento ao longo do tempo, que é necessário para a imagem com baixas intensidades de luz, mesmo na presença de um sistema eliminador de oxigénio potente. Estes métodos permitem a reconstituição de baixo para cima de estruturas fusiformes simplificados in vitro. Em adição aos componentes aqui apresentados, muitos outros factores têm sido descritas para influenciar a formação do fuso bipolar, posicionamento, orientação, moldagem, etc 3. Este sistema também pode ser expandido para estudar os efeitos individuais e combinados de geradores de força adicional. importantes contribuintes para a formação do fuso que estão atualmente ausente deste sistema são os cromossomos mitóticos. cromatina mitótica foi mostrado paraformação do fuso directo, por (1) chromokinesins que podem gerar os chamados &quot;forças polar-ejecção &#39;3, (2) a formação de um gradiente RanGTP pela ligada à cromatina RanGEF RCC1 38, (3) cinetócoros que pode interagir com (despolimerização microtúbulos) 39 e (4) do próprio cromatina, o que pode funcionar como uma mola mecânica entre-microtúbulos opostas 40. Finalmente, o sistema descrito atualmente fornece controle espacial e temporal limitado sobre a atividade e localização de força-geradores introduzidas. Nas células, muitos fatores de montagem do fuso localizam compartimentos específicos ou estão ativos dentro de uma janela de tempo restrito. Um exemplo notável é a actividade de dineína, que é especificamente enriquecida no lado posterior da C. elegans fase de embrião de uma célula para promover o posicionamento do eixo assimétrico e divisão celular. Neste sistema, estamos a explorar a possibilidade de imitar tais tmétodos emporal e assimétricas atividade usando emprestado de técnicas opto-genéticos. Além disso, como é o caso para o C. elegans embrião e as células com uma parede celular rígida, muitas células não completam na mitose. A forma do confinamento geométrica terá um impacto fundamental sobre as forças que atuam sobre o eixo 41. Assim, será importante para reconstituir montagem do fuso e posicionamento em gotículas não esféricas, bem como, potencialmente usando sistemas microfluídicos mais complexos que permitem que moldam e armazenamento de emulsão de gotas 42,43. Finalmente, em tecidos, célula-célula e sinalização-substrato celular e apego fornecer pistas externas que podem ser traduzidos em orientação do fuso dirigido, como é muitas vezes observada em células epiteliais e células-tronco. Todos estes aspectos especializados não foram tidos em conta neste estudo atual e pode fornecer futuros desafios para construir no sentido mais in vivo -como reconstituições de assemb fuso mitóticoly e posicionamento.

Durante a mitose, os cromossomos do genoma replicado são organizados no equador célula para assegurar a igualdade de distribuição de cromatídeos irmãos sobre as células filhas recém-formados. posicionamento cromossomo e segregação é mediada pela sua adesão aos microtúbulos do fuso originários de dois centrossomas opostas. Além de garantir a distribuição cromossoma fiel, a orientação do fuso mitótico também determina do plano de divisão celular 1. Orientação coordenada de divisão celular é essencial durante muitos estágios de desenvolvimento e para a homeostase do tecido 2. Especificamente, regulado o posicionamento do fuso mitótico pode resultar numa distribuição assimétrica dos conteúdos celulares ou mesmo produzir células filhas de diferentes tamanhos 2. Montagem de fuso mitótico e orientação começa na prófase e é orquestrado por uma complexa interação entre cooperação e antagonizar força-geradores 3,4. As forças geradas consistem em bpuxar e empurrar as forças OTH. Estas forças são originários a partir de ambos os contactos de fuso com o córtex celular, bem como a partir de dentro do fuso, e pode ser gerado por dinâmica dos microtúbulos, bem como por motores moleculares e agentes de reticulação (Figura 1). forças que empurram pode ser gerado quando microtúbulos crescer contra estruturas rígidas, tais como o córtex célula. Dependendo da força de resistência total gerada dentro do sistema, isso pode resultar em reposicionamento do fuso mitótico (forças inferiores) ou desencadear encurvadura microtúbulos ou catástrofe (forças elevadas) 5-8. A quantidade de força que pode ser gerada por empurrando depende do comprimento do microtúbulo, uma vez que o comprimento é um determinante forte do microtúbulo-flambagem 9. Além disso, os microtúbulos que se originam a partir de um centrossoma podem empurrar contra a outra centrossoma, um mecanismo que tem sido sugerido para conduzir a separação do centrossoma no início de profase 3,10. Em anúnciocondição para empurrar as forças geradas por microtúbulos crescimento, microtúbulos termina contactar o córtex celular também pode mediar puxando forças 11. Estudos de vários laboratórios tem mostrado que a actividade controlada de geradores de força corticais é necessário para o posicionamento assimétrico de fusos mitóticos in vivo 1. Essencial para essas forças que puxam é dineína localizada-cortex citoplasmática (doravante referida como &quot;dineína &#39;), um sinal de menos-end microtúbulos dirigido proteína motora 8,12,13. Por exemplo, na levedura de brotamento, interacções laterais de dineína cortical com o resultado da estrutura de microtúbulos em microtúbulos dependente do motor de deslizamento ao longo do córtex 14. No entanto, as forças de tracção corticais também pode ser gerado pela capacidade de dineína para formar ligações de extremidade-para despolimerizar os microtúbulos 8. A energia gerada pelo encolhimento dos microtúbulos podem conduzir a forças que são, geralmente, uma ordem de magnitude maior (~ 50 pN (Referência 15 </s-se&gt;)) do que as forças geradas pelo motor proteínas individuais (~ 7-8 pN (ref. 16)). Apego End-on de dineína cortical aos microtúbulos despolimerização promove o posicionamento do fuso em brotamento levedura 17 e C. elegans 13. Se corticais forças de tracção impulsionado deslizante dependentes de motor e microtúbulos despolimerização podem cooperar ou são mutuamente exclusivas in vivo é actualmente desconhecido. Além das forças que empurram microtúbulos e forças de tracção corticais mediada por dineína, centrossoma posicionamento é controlado a partir de dentro do fuso mitótico por numerosas outras proteínas. Cinesina-5 motores, por exemplo, existir como tetrâmeros que podem reticular os microtúbulos interpolares antiparalelas, resultando na geração de forças para o exterior de deslizamento 18-20. Os membros da família motora cinesina-5 são necessárias para a separação do centrossoma e montagem do fuso bipolar em todos os eucariotas estudados, com a excepção de C. elegans<html> (revisto em referência 21). Além disso, difusíveis reticulantes da família / PRC1 Ase1 também são conhecidos para localizar regiões de sobreposição dos microtúbulos de microtúbulos interpolares in vivo e in vitro 22-27. As forças geradas pela expansão Ase1-driven do microtubule-região de sobreposição são grandes o suficiente para contrabalançar kinesin-14 forças de correr mediadas in vitro 28,29. Em células, Ase1 / PRC1 é necessário para a formação estável de sobreposição de regiões de microtúbulos no fuso midzone 25-27,30, sugerindo que as forças geradas pela reticuladores difusíveis pode contribuir significativamente para a organização do fuso. Finalmente, as forças da cromatina mitótico e cinetócoros influenciar a formação do fuso mitótico e posicionamento através de várias vias 3. Uma vez que estes componentes não fazem parte dos ensaios de reconstituição descritos aqui, eles não serão discutidos em detalhe. jove_content &quot;&gt; Existem diferentes teorias sobre como os diferentes componentes moleculares e as forças descritas acima cooperar na montagem do fuso e posicionamento, mas ainda estamos muito longe de um entendimento quantitativo. Além de experimentos em células vivas, in vitro experimentos com componentes purificados fornecer uma poderosa rota para ajudar a atingir este objectivo. Aqui é apresentado um guia visual para uma versão adaptada e estendida dos métodos publicados recentemente (Roth et al., 31), em que fusos básicos são reconstituídos em água-em-óleo de gotículas de emulsão, começando com um número mínimo de componentes. Utilizando técnicas de microfluidos, gotas esféricas são gerados com tamanhos que são comparáveis ​​aos das células mitóticas. dentro destas gotículas, centrossomas purificadas e tubulina podem ser combinados a fim de estudar a dinâmica do áster de microtúbulos, forçar as interacções de geração e áster-áster. por introduzindo corticais (tais como dineína) e inter-polares (tais como cinesina-5 / Ase1) força-geradores, nósreconstituir estruturas fusiformes cada vez mais complexos que começam a assemelhar-se a situação in vivo.

<table><tbody><tr><td><forte>1. Preparação de chips microfluídicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Photomask on film substrate)</td><td>Selba S.A. Suíça</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer (4 polegadas silicon wafer p/Boron < 1-0-0>10-20 &Omega;-cm, 500-550 &mu; m, SSP, com 2 planos)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Revestidor de spin:</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS pré-polímero RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Corona treater</td><td>Produtos eletrotécnicos</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Configuração microfluídica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-( biotinil))</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td><td></td>de vidro</tr><tr><td>Tubos de</td><td></td><td></td><td></td>vidro</tr><tr><td>Bomba de vácuo</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de vácuo</td><td>Kartell</td><td>Polipropileno Dessecador</td><td></td>a vácuo</tr><tr><td>Óleo mineral</td><td>Surfactante Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>(Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, espessura 1.5</td></tr><tr><td>Lâminas</td><td></td><td></td> de vidro <td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Perfurador</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Vedação de laboratório filme</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (Vaselina, lanolina, cera de parafina derretida em concentrações iguais)</td><td></td><td></td> <td>Microscópio</td></tr><tr><td>de Campo Claro</td> caseiro <td>Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>Qualquer campo claro invertido seria suficiente</td></tr><tr><td>Regulador de pressão</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, França</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frascos de microfluídica (Tubos Micrew 0,5 ml e 1 ml)</td><td>VWR, Países Baixos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Reconstituição da formação e posicionamento do fuso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10.000 MW, aniônico, corrigível)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Albumina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose (D-(+)-Glucose)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucose-oxidase (Glicose oxidase de Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-ditioletolitol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalase (Catalase forma fígado bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina (Tubulina do cérebro bovino)</td><td>Citoesqueleto Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulina-488/561 (tubulina marcada com HiLyte-488 / Rodamina do cérebro suíno)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosina-'5-trifosfato, hidrato de sal de sódio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa;-caseína (&kappa;-caseína de leite de soro bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (ultracentrífuga acionada a ar)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><tr><td><forte>4. Apresentando os fatores de montagem do fuso</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr> <tr><td>Neutravidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina-'5-trifosfato, hidrato de sal dissódico)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Ácido fosfo(enol)pirúvico monossódico hidratado de sal &ge; 97% (enzimático))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(enzimas piruvato quinase/desidrogenase láctica do músculo do coelho)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

reconstituição do basic mitótico fusos no esféricas emulsão gotas

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

A montagem, posicionamento e orientação do fuso mitótico dependem das forças combinadas geradas pela dinâmica dos microtúbulos, proteínas motoras dos microtúbulos e reticulantes. Os microtúbulos em crescimento podem gerar forças de empurrão, enquanto os microtúbulos despolimerizados podem converter a energia do encolhimento dos microtúbulos em forças de tração, quando ligados, por exemplo, à dineína cortical ou aos cromossomos. Além disso, proteínas motoras e reticuladores difusíveis dentro do fuso contribuem para a arquitetura do fuso conectando e deslizando microtúbulos antiparalelos. In vivo, tem se mostrado difícil desvendar a contribuição relativa de jogadores individuais para o equilíbrio geral de forças. Aqui apresentamos os métodos que desenvolvemos recentemente em nossos esforços para reconstituir fusos mitóticos básicos de baixo para cima in vitro. Usando técnicas microfluídicas, os centrossomas e a tubulina são encapsulados em gotículas de emulsão de água em óleo, levando à formação de ásteres de microtúbulos geometricamente confinados (duplos). Ao introduzir adicionalmente dineína ancorada corticalmente, motores de microtúbulos direcionados de ponta a ponta e reticuladores difusíveis, este sistema é usado para reconstituir estruturas semelhantes a fusos. Os métodos aqui apresentados fornecem um ponto de partida para a reconstituição de fusos mitóticos mais completos, permitindo um estudo detalhado da contribuição de cada componente individual e para obter uma visão quantitativa integrada do equilíbrio de força dentro do fuso mitótico.

Os métodos apresentados nas secções precedentes a permitir a reconstituição de estruturas fusiformes com o aumento da complexidade geométrica usando o confinamento de água-em-óleo de gotículas de emulsão. Esta seção descreve os resultados representativos que qualitativamente demonstrar a capacidade destes ensaios. Durante a mitose, quando o fuso bipolar é montado, as células completam para formar esferas com um diâmetro de cerca de 15 uM, tal como medido para as células humanas. Esta forma da célula mitótica característica fornece um limite geométrico que ambos restringe e dirige o tamanho e a orientação do eixo 35,36. Técnicas microfluídicos, fornecer um nível de confinamento geométrica que se assemelha com precisão a situação observada em células vivas e, portanto, permite a reconstrução de baixo para cima de fusos mitóticos in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; asters microtúbulos são por si só já capaz de comportamento complexo quando o crescimento dos microtúbulos é restrito por limites geométricos. Como microtúbulos crescem, empurrando as forças geradas pela incorporação de novos dímeros de tubulina conduzir os dois centrossomas para os lados das gotículas de emulsão opostas. Em primeiro lugar, centrossomas difundem-se livremente dentro do volume confinado (Figura 4A, painel da esquerda). Após cerca de 20-30 minutos, os primeiros microtúbulos se tornar difusão visível e centrossoma se torna restrito como microtúbulos crescem contra o córtex em todas as direções. Ásteres com microtúbulos de comprimento intermédio (cerca de 50% do diâmetro das gotículas) pode (estericamente) repelem outro, com microtúbulos empurrar um contra o outro, os outros centrossomas e o córtex. Isso resulta em um arranjo fusiforme &#39;bipolar&#39; típico com os dois centrossomas opostos uns aos outros (Figura 4A, painel do meio). Quando microtúbulos crescer mais do que ~ 50% da gotícula-diâmmedidor, os centrossomas são empurrados ainda mais para os limites opostos da gota, com os microtúbulos que crescem ao longo do córtex gota (Figura 4a, painel da direita). É importante notar que as taxas de crescimento dos microtúbulos nestes ensaios são muito sensíveis à temperatura e concentrações afim da tubulina. Esses parâmetros, portanto, afetar fortemente o momento em que a nucleação é observada pela primeira vez e quando as posições do áster de estado estacionário são atingidos. Em células, forças de tracção corticais são geradas através da formação de ligações de suporte de carga entre o microtúbulo e as extremidades plus-dineína associada-córtex. Nas células animais, a associação do complexo depende Gαi / LGN / NUMA, que é orientada para a membrana plasmática através de miristoilação de terminal-N de uma Gαi. Nestes ensaios de reconstituição, o requisito de o complexo Gαi / LGN / NuMA é ignorada por acoplamento directo dineína a lípidos através do biotiniladosformação de complexos de biotina-estreptavidina-biotina. Estas ligações são relativamente estáveis ​​(K D ~ 10 -14 M) 37 e formar rapidamente (geralmente dentro de 10 minutos após a formação das gotas da emulsão, antes de microtúbulos nucleação torna-se aparente) (Figura 4b). Na presença de dineína cortical, centrossomas tipicamente reter uma posição mais central, enquanto que, na ausência de dineína, centrossomas são empurrados para os lados opostos do córtex gota (Figura 4c). Nós razão que este é o resultado de dois efeitos, o que evitar e combater as forças de microtúbulos empurrando. (1) Dineína promove diretamente catástrofes microtúbulos, restringindo assim o comprimento dos microtúbulos e prevenir flambagem microtúbulos excessiva, e (2) as forças que puxam corticais levam a forças de centralização líquidos sobre os ásteres individuais 8, que neutralizam as forças de repulsão aster-aster. O agente de reticulação difusível Ase1 induz forces que tendem a aumentar a região de sobreposição de microtúbulos anti-paralelos 29. Consistente com este, na presença de Ase1 (e ausência de dineína) centrossomas são encontradas perto em conjunto com a localização de Ase1 empacotado microtúbulos interpolares (Figura 4D). Os membros da família da cinesina-5 conduzir a separação do centrossoma, fornecendo forças que empurram a partir de dentro do fuso (ver introdução). Na presença de Cut7 (S. pombe cinesina-5 ortólogo), centrossomas são empurrados para os lados opostos das gotículas de emulsão, mesmo na presença de Ase1 (Figura 4E). Através da combinação de geradores de força corticais e inter-polares, o nível de complexidade pode ser aumentada nestas experiências, o que levou a uma compreensão abrangente da montagem do fuso mitótico bipolar. Uma descrição detalhada quantitativa destes resultados estarão disponíveis no futuro (Roth et ai., Manuscrito em preparação). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Além de observar a posição dos centrossomas em momentos fixos no tempo, e o seu comportamento relativo aos comprimentos observados dos microtúbulos, informações valiosas pode ser obtida seguindo o processo de posicionamento sobre Tempo. Ao reduzir o tempo de exposição e as intensidades de laser, é agora possível seguir posicionamento áster em intervalos de 2 min durante pelo menos 1 hora com apenas ~ 30% de branqueamento. Isso permite o monitoramento de reunião aster e posicionamento de centrossomas que difundem livremente (0 min.) Via centralizada (12 min.) Para asters descentralizadas (36 min e mais) (Figura 5C). Isto facilita o estudo de comportamento tanto no estado estacionário e cinética de montagem do fuso. Através da combinação de gotículas com diferentes teores na mesma amostra, é, por exemplo, possível comparar directamente posicionamento e montagem do fuso cinética centrossoma em gotículas com e sem geradores de força cortical (Figura 5b). Figura 1: As forças que actuam sobre o fuso mitótico Várias moléculas geradoras de força agir sobre os microtúbulos do fuso mitótico para promover a formação do fuso e posicionamento.. Os microtúbulos que se transformam em células do córtex gerar uma força de propulsão no centrossoma. dineína cortical (roxo) captura microtúbulos despolimerização e gera uma força puxando os centrossomas. Dentro do fuso, cinesina-5 proteínas do motor / Cut7 fornecer uma força externa que desliza no microtúbulos anti-paralelas, enquanto agentes de reticulação da família PRC1 / Ase1 gerar uma oposição externa força de deslizamento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Figura 2:. Microfluidic Chip Design (A) Projeto de photomask 4 polegadas contendo 4 chips microfluídicos. (B) uma representação detalhada de um único chip. Batatas fritas contêm um canal de saída e três canais de entrada de ar seguido por um filtro de poeira. Uma entrada do canal contém a fase aquosa, o canal 2 / óleo de fase lipídica e o canal 3 pode ser utilizado para diluir as gotas formadas com / óleo de fase lípido adicional. (C) Representação detalhada da junção onde o / óleo de fase lipídica (proveniente da parte superior e inferior) encontra-se com a fase aquosa (vindo da esquerda). Na junção, as gotas irão formar e fluir em direcção ao canal de saída do lado direito. (D) a representação detalhada de um dust-filtro com 2 mm canais. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Figura 3:. Metodologia para a formação de água-em-óleo das gotas da emulsão (A) e tubos de chip microfluídico microfluidos em um microscópio de campo brilhante. Ambos os tubos de água e /-óleo de fase lipídica está ligado às entradas de chip 1 e 2, respectivamente. (B) Restrição no chip de microfluídica, onde a água e lipídios / óleo-fases se encontram. Ao mudar as pressões, as gotas de tamanho pode ser controlada. (C) Projeto de células de fluxo de PDMS-revestidos. Depois de colocar as gotas para a célula de fluxo, as extremidades abertas são fechadas com valap adicional. (D) Esquema de formação de gotículas. Gotas são usados ​​para encapsular centrossomas, tubulina e componentes adicionais necessários para a formação do fuso mitótico. (E) esquemático de segmentação cortical-dineína. Biotinilada (Bio) dineína é direcionado para lipídios biotinilados através de estreptavidina (Strp). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Figura 4:. Os resultados representativos do eixo-Reconstituições com a complexidade crescente (A) as projeções de intensidade máxima de gotículas contendo dois centrossomas que mostram exemplos de microtúbulos curtas, médias e longas. Centrossomas e microtúbulos são visualizadas através da adição de 10% HiLyte-488 marcado tubulina. Barras de escala = 10 uM. (B) Localização de GFP-biotina-dineína-TMR na ausência (-, esquerda) e na presença (+, direita) de estreptavidina (Strp). Posicionamento (C) Microtubule áster na ausência (-, esquerda) ou na presença (+, direita) da cortical GFP-biotina-dineína-TMR. (D) aster microtúbulos (painel esquerdo, green) posicionamento na presença de Ase1 (painel do meio, vermelho). (E) microtúbulos aster (painel esquerdo, verde) posicionamento na presença de Ase1 e Cut7 (kinesin-5) (painel do meio, vermelho). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Figura 5: geração de imagens Aster de posicionamento Dynamics in vitro (A) Projeto de um copo PDMS que permite imagens gota por até várias horas.. (B) Geração, armazenamento e tratamento de imagens de gotas (transmitida) contendo diferentes teores, ilustrados por ausência (à esquerda) inclusão (direita) de dextrano fluorescente (Alexa 647). (C) imagens planas individuais de um 60 min de lapso de tempo (intervalos de 2 min), tomada a partir de um z-stack (2 mm distâncias) de anúncioroplet contendo um único centrossoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

A montagem e o posicionamento do fuso mitótico dependem das forças combinadas geradas pela dinâmica dos microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes. Aqui apresentamos nossos métodos recentemente desenvolvidos nos quais o confinamento geométrico de gotículas de emulsão esférica é usado para a reconstituição de baixo para cima de fusos mitóticos básicos.

Reconstituição do Basic mitótico Fusos no esféricas Emulsão Gotas

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

O objetivo geral deste procedimento é reconstruir estruturas semelhantes ao fuso mitótico dentro do confinamento geométrico de gotículas de emulsão de água em óleo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da montagem do fuso mitótico, como como os fusos são posicionados e montados, e qual é a contribuição específica de componentes individuais para esses processos? A principal vantagem desta técnica é que utilizamos uma abordagem ascendente para reconstruir estruturas semelhantes ao fuso dentro de um confinamento geométrico que imita a forma de uma célula mitótica.Este método também pode ser utilizado para estudar outros processos que dependem do confinamento celular. Misture 10 partes de pré-polímero de PDMS com uma parte de agente de cura em uma massa total de cerca de 40 gramas. Em seguida, coloque a mistura em uma câmara de vácuo por cerca de 30 minutos para remover bolhas de ar.Enquanto isso, envolva o molde com papel alumínio para criar uma cavidade com um centímetro de profundidade e quatro polegadas de diâmetro. Quando pronto, despeje cerca de 3/4 da mistura de PDMS no molde. Em seguida, retorne o PDMS para uma câmara de vácuo por mais 30 minutos.Após a desgaseificação, cure o PDMS por uma hora a 100 graus Celsius. Enquanto isso, prepare algumas lâminas de vidro para revestimento por centrifugação removendo a poeira com ar comprimido. Em seguida, aplique o PDMS restante nas lâminas por meio de revestimento por centrifugação.Cure essas lâminas por uma hora a 100 graus Celsius para endurecer o PDMS. Em seguida, retire cuidadosamente o PDMS usando uma lâmina de barbear e perfure os orifícios necessários nas tiras de PDMS para fabricar os chips microfluídicos. Agora, trate por corona o chip microfluídico e uma lâmina de vidro revestida com PDMS por alguns segundos.Por fim, coloque um chip microfluídico sobre cada lâmina de vidro com os canais voltados para baixo e aqueça os chips durante a noite a 100 graus Celsius. Primeiro, utilizando vidraria lavada com clorofórmio, prepare cerca de 250 microgramas de lipídios dissolvidos em clorofórmio. Seque cuidadosamente a mistura de lipídios com gás inerte.Em seguida, coloque-o em uma câmara de vácuo por uma hora. Depois, dissolva os lipídios em óleo mineral e 2,5% surfactante até 0,5 miligramas por mililitro, o que equivale a cerca de 500 microlitros. Para dissolver completamente os lipídios, sonique a mistura por 30 minutos a 40 quilohertz.Em seguida, aplique PDMS por centrifugação sobre lamínulas com uma espessura que corresponda à do objetivo do microscópio. Depois, aplique PDMS por centrifugação sobre lâminas de vidro. Agora, cure as lamínulas e lâminas de vidro recobertas com PDMS por uma hora a 100 graus Celsius.Em seguida, prepare as câmaras de fluxo espaçando adequadamente fatias finas de filme selante laboratorial sobre lâminas de vidro revestidas com PDMS. Posicione tiras de três milímetros a cerca de dois milímetros de distância uma da outra. Depois, cubra as câmaras de fluxo com uma lamínula revestida com PDMS e selle o conjunto aquecendo o filme a 100 graus Celsius por cerca de um minuto.Uma vez aquecido, pressione suavemente a lamínula para baixo e feche-a com Valap. Em seguida, prepare um copo de PDMS para imagens de longo prazo. Faça um orifício com diâmetro de quatro milímetros em uma fatia de PDMS com três milímetros de espessura.Em seguida, aplique tratamento por corona na fatia de PDMS e em um cubo de vidro revestido com PDMS. Após o tratamento, posicione-os um sobre o outro e aqueça o conjunto durante a noite a 100 graus Celsius. Monitore a formação de gotículas em um microscópio invertido de campo claro.Conecte a fase oleosa de lipídio ao controlador de pressão e aumente a pressão até que uma gota de óleo saia do tubo capilar. Conecte o tubo capilar à entrada dois do chip de microfluídica. Em seguida, preencha completamente os chips microfluídicos com a fase oleosa de lipídio pela entrada dois.Em seguida, introduza a fase aquosa com base em MRB-80 pela entrada um. Controle o tamanho das gotas ajustando as pressões da fase oleosa lipídica e da fase aquosa, de modo a gerar gotas com diâmetro de aproximadamente 15 mícrons. Uma pressão de cerca de 800 milibares para a fase oleosa lipídica e 200 milibares para a fase aquosa é um bom ponto de partida.Após obter o tamanho desejado das gotículas, preencha completamente a célula de fluxo com gotículas. Essas gotículas são formadas usando pequenos volumes da fase aquosa. Isso significa que o sistema microfluídico precisa funcionar rapidamente para não perder toda a fase aquosa antes que gotículas do tamanho correto sejam formadas.Uma vez preenchida, feche cuidadosamente as extremidades da câmara de fluxo usando Valap. Se as gotículas não pararem de se mover, então o selo não está completo ou podem ter sido introduzidas bolhas de ar. Para imagens de longo prazo, transfira as gotículas para um recipiente de PDMS e cubra com uma camada de mistura de óleo e lipídios.Descongele os centríolos à temperatura ambiente e coloque-os a 37 graus Celsius por 20 minutos para garantir a nucleação adequada de microtúbulos. Enquanto isso, prepare a mistura do ensaio no gelo. Esta deve conter tubulina, GTP, um sistema eliminador de oxigênio, geradores de força molecular como ligantes cruzados de microtúbulos, ATP e sistema regenerador de ATP.Uma vez misturado, centrifugue a amostra no rotor Airfuge resfriado a 30 psi por três minutos. Em seguida, adicione os centríolos pré-aquecidos à mistura. Otimize a quantidade de centríolos adicionada para obter um ou dois centríolos por gotícula.Em seguida, utilize esta mistura para produzir gotículas emulsionadas conforme descrito anteriormente. Para recrutar dineína para lipídios biotinilados no córtex da gotícula, inclua GFP-dineína TMR e estreptavidina na fase aquosa. Em um microscópio confocal de disco giratório, visualize o crescimento de microtúbulos após 30 minutos a 26 graus Celsius.Durante a aquisição de imagens, o crescimento de microtúbulos pode ser promovido aumentando a temperatura para 28 ou mesmo 30 graus Celsius. Para projeções em Z, adquira pilhas de imagens com intervalos de um mícron, o que deve exigir cerca de 20 imagens por gota. Vá ao painel principal da câmera, clique em Editar Z e defina o passo Z como 1,0.Clique em Avançar para armazenar as configurações. Em seguida, defina o ganho linear máximo EM clicando na guia Câmera no painel de Aquisição e movendo a barra de Ganho EM para 300. Depois, defina o Tempo de Exposição para 200 milissegundos na mesma guia.Clique em Gravar para armazenar as configurações. Para experimentos de imagem em tempo real, faça projeções em Z a cada dois minutos durante duas horas, reduzindo os tempos de exposição para cerca de 100 milissegundos e aumentando os intervalos em Z para dois mícrons. Para experimentos de imagem em tempo real, utilize um copo de PDMS em vez de uma cela de fluxo comum para imobilização máxima da amostra.Utilizando os protocolos descritos, a formação de astros foi estudada em gotículas de emulsão água-óleo contendo centríolos. Inicialmente, os centríolos difundem-se livremente dentro dos volumes confinados. Após cerca de 20 a 30 minutos, os primeiros microtúbulos tornam-se visíveis, e a difusão dos centríolos passa a ser restrita à medida que os microtúbulos crescem contra a cortex em todas as direções.Quando os microtúbulos crescem mais do que metade do diâmetro da gota, os centríolos são empurrados para bordas opostas, com os microtúbulos crescendo ao longo da córtex da gota. Na ausência de estreptavidina, a dineína está difusa dentro da gota. No entanto, na presença de estreptavidina, cerca de 10 minutos após a formação da gota, a dineína liga-se aos lipídios biotinilados.Ao observar a tubulina fluorescente na presença de dineína cortical, é evidente que os centríolos estão posicionados no centro. Enquanto na ausência de dineína, os centríolos são empurrados para lados opostos da gota. Isso provavelmente ocorre porque a dineína promove catástrofes de microtúbulos e forças corticais de tração, o que resulta no posicionamento central dos asteres.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar tecnologias microfluídicas para criar estruturas semelhantes a fusos em gotículas esféricas de emulsão. Uma vez dominados, a formação de gotículas e a aquisição de imagens podem ser realizadas em duas a três horas, quando executadas corretamente. Utilizando este procedimento, outros fatores de montagem do fuso podem ser encapsulados para estudar seu efeito na morfologia e posicionamento do fuso.Precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao manipular clorofórmio ou PDMS.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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