Reconstituição do Basic mitótico Fusos no esféricas Emulsão Gotas
13 de agosto de 2016
A montagem e o posicionamento do fuso mitótico dependem das forças combinadas geradas pela dinâmica dos microtúbulos, proteínas motoras e reticulantes. Aqui apresentamos nossos métodos recentemente desenvolvidos nos quais o confinamento geométrico de gotículas de emulsão esférica é usado para a reconstituição de baixo para cima de fusos mitóticos básicos.
O objetivo geral deste procedimento é reconstruir estruturas semelhantes ao fuso mitótico dentro do confinamento geométrico de gotículas de emulsão de água em óleo. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da montagem do fuso mitótico, como como os fusos são posicionados e montados, e qual é a contribuição específica de componentes individuais para esses processos? A principal vantagem desta técnica é que utilizamos uma abordagem ascendente para reconstruir estruturas semelhantes ao fuso dentro de um confinamento geométrico que imita a forma de uma célula mitótica.
Este método também pode ser utilizado para estudar outros processos que dependem do confinamento celular. Misture 10 partes de pré-polímero de PDMS com uma parte de agente de cura em uma massa total de cerca de 40 gramas. Em seguida, coloque a mistura em uma câmara de vácuo por cerca de 30 minutos para remover bolhas de ar.
Enquanto isso, envolva o molde com papel alumínio para criar uma cavidade com um centímetro de profundidade e quatro polegadas de diâmetro. Quando pronto, despeje cerca de 3/4 da mistura de PDMS no molde. Em seguida, retorne o PDMS para uma câmara de vácuo por mais 30 minutos.
Após a desgaseificação, cure o PDMS por uma hora a 100 graus Celsius. Enquanto isso, prepare algumas lâminas de vidro para revestimento por centrifugação removendo a poeira com ar comprimido. Em seguida, aplique o PDMS restante nas lâminas por meio de revestimento por centrifugação.
Cure essas lâminas por uma hora a 100 graus Celsius para endurecer o PDMS. Em seguida, retire cuidadosamente o PDMS usando uma lâmina de barbear e perfure os orifícios necessários nas tiras de PDMS para fabricar os chips microfluídicos. Agora, trate por corona o chip microfluídico e uma lâmina de vidro revestida com PDMS por alguns segundos.
Por fim, coloque um chip microfluídico sobre cada lâmina de vidro com os canais voltados para baixo e aqueça os chips durante a noite a 100 graus Celsius. Primeiro, utilizando vidraria lavada com clorofórmio, prepare cerca de 250 microgramas de lipídios dissolvidos em clorofórmio. Seque cuidadosamente a mistura de lipídios com gás inerte.
Em seguida, coloque-o em uma câmara de vácuo por uma hora. Depois, dissolva os lipídios em óleo mineral e 2,5% surfactante até 0,5 miligramas por mililitro, o que equivale a cerca de 500 microlitros. Para dissolver completamente os lipídios, sonique a mistura por 30 minutos a 40 quilohertz.
Em seguida, aplique PDMS por centrifugação sobre lamínulas com uma espessura que corresponda à do objetivo do microscópio. Depois, aplique PDMS por centrifugação sobre lâminas de vidro. Agora, cure as lamínulas e lâminas de vidro recobertas com PDMS por uma hora a 100 graus Celsius.
Em seguida, prepare as câmaras de fluxo espaçando adequadamente fatias finas de filme selante laboratorial sobre lâminas de vidro revestidas com PDMS. Posicione tiras de três milímetros a cerca de dois milímetros de distância uma da outra. Depois, cubra as câmaras de fluxo com uma lamínula revestida com PDMS e selle o conjunto aquecendo o filme a 100 graus Celsius por cerca de um minuto.
Uma vez aquecido, pressione suavemente a lamínula para baixo e feche-a com Valap. Em seguida, prepare um copo de PDMS para imagens de longo prazo. Faça um orifício com diâmetro de quatro milímetros em uma fatia de PDMS com três milímetros de espessura.
Em seguida, aplique tratamento por corona na fatia de PDMS e em um cubo de vidro revestido com PDMS. Após o tratamento, posicione-os um sobre o outro e aqueça o conjunto durante a noite a 100 graus Celsius. Monitore a formação de gotículas em um microscópio invertido de campo claro.
Conecte a fase oleosa de lipídio ao controlador de pressão e aumente a pressão até que uma gota de óleo saia do tubo capilar. Conecte o tubo capilar à entrada dois do chip de microfluídica. Em seguida, preencha completamente os chips microfluídicos com a fase oleosa de lipídio pela entrada dois.
Em seguida, introduza a fase aquosa com base em MRB-80 pela entrada um. Controle o tamanho das gotas ajustando as pressões da fase oleosa lipídica e da fase aquosa, de modo a gerar gotas com diâmetro de aproximadamente 15 mícrons. Uma pressão de cerca de 800 milibares para a fase oleosa lipídica e 200 milibares para a fase aquosa é um bom ponto de partida.
Após obter o tamanho desejado das gotículas, preencha completamente a célula de fluxo com gotículas. Essas gotículas são formadas usando pequenos volumes da fase aquosa. Isso significa que o sistema microfluídico precisa funcionar rapidamente para não perder toda a fase aquosa antes que gotículas do tamanho correto sejam formadas.
Uma vez preenchida, feche cuidadosamente as extremidades da câmara de fluxo usando Valap. Se as gotículas não pararem de se mover, então o selo não está completo ou podem ter sido introduzidas bolhas de ar. Para imagens de longo prazo, transfira as gotículas para um recipiente de PDMS e cubra com uma camada de mistura de óleo e lipídios.
Descongele os centríolos à temperatura ambiente e coloque-os a 37 graus Celsius por 20 minutos para garantir a nucleação adequada de microtúbulos. Enquanto isso, prepare a mistura do ensaio no gelo. Esta deve conter tubulina, GTP, um sistema eliminador de oxigênio, geradores de força molecular como ligantes cruzados de microtúbulos, ATP e sistema regenerador de ATP.
Uma vez misturado, centrifugue a amostra no rotor Airfuge resfriado a 30 psi por três minutos. Em seguida, adicione os centríolos pré-aquecidos à mistura. Otimize a quantidade de centríolos adicionada para obter um ou dois centríolos por gotícula.
Em seguida, utilize esta mistura para produzir gotículas emulsionadas conforme descrito anteriormente. Para recrutar dineína para lipídios biotinilados no córtex da gotícula, inclua GFP-dineína TMR e estreptavidina na fase aquosa. Em um microscópio confocal de disco giratório, visualize o crescimento de microtúbulos após 30 minutos a 26 graus Celsius.
Durante a aquisição de imagens, o crescimento de microtúbulos pode ser promovido aumentando a temperatura para 28 ou mesmo 30 graus Celsius. Para projeções em Z, adquira pilhas de imagens com intervalos de um mícron, o que deve exigir cerca de 20 imagens por gota. Vá ao painel principal da câmera, clique em Editar Z e defina o passo Z como 1,0.
Clique em Avançar para armazenar as configurações. Em seguida, defina o ganho linear máximo EM clicando na guia Câmera no painel de Aquisição e movendo a barra de Ganho EM para 300. Depois, defina o Tempo de Exposição para 200 milissegundos na mesma guia.
Clique em Gravar para armazenar as configurações. Para experimentos de imagem em tempo real, faça projeções em Z a cada dois minutos durante duas horas, reduzindo os tempos de exposição para cerca de 100 milissegundos e aumentando os intervalos em Z para dois mícrons. Para experimentos de imagem em tempo real, utilize um copo de PDMS em vez de uma cela de fluxo comum para imobilização máxima da amostra.
Utilizando os protocolos descritos, a formação de astros foi estudada em gotículas de emulsão água-óleo contendo centríolos. Inicialmente, os centríolos difundem-se livremente dentro dos volumes confinados. Após cerca de 20 a 30 minutos, os primeiros microtúbulos tornam-se visíveis, e a difusão dos centríolos passa a ser restrita à medida que os microtúbulos crescem contra a cortex em todas as direções.
Quando os microtúbulos crescem mais do que metade do diâmetro da gota, os centríolos são empurrados para bordas opostas, com os microtúbulos crescendo ao longo da córtex da gota. Na ausência de estreptavidina, a dineína está difusa dentro da gota. No entanto, na presença de estreptavidina, cerca de 10 minutos após a formação da gota, a dineína liga-se aos lipídios biotinilados.
Ao observar a tubulina fluorescente na presença de dineína cortical, é evidente que os centríolos estão posicionados no centro. Enquanto na ausência de dineína, os centríolos são empurrados para lados opostos da gota. Isso provavelmente ocorre porque a dineína promove catástrofes de microtúbulos e forças corticais de tração, o que resulta no posicionamento central dos asteres.
Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como utilizar tecnologias microfluídicas para criar estruturas semelhantes a fusos em gotículas esféricas de emulsão. Uma vez dominados, a formação de gotículas e a aquisição de imagens podem ser realizadas em duas a três horas, quando executadas corretamente. Utilizando este procedimento, outros fatores de montagem do fuso podem ser encapsulados para estudar seu efeito na morfologia e posicionamento do fuso.
Precauções, como o uso de luvas, devem sempre ser tomadas ao manipular clorofórmio ou PDMS.
Visão Geral
Este estudo apresenta um método para reconstituir estruturas semelhantes ao fuso mitótico dentro de confinamento geométrico, utilizando gotículas de emulsão água-em-óleo. A abordagem tem como objetivo elucidar os mecanismos de montagem e posicionamento dos fusos mitóticos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Biofísica
Contexto
- Os fusos mitóticos são cruciais para a divisão celular.
- O entendimento da dinâmica dos fusos pode revelar informações sobre processos celulares.
- O confinamento geométrico imita ambientes celulares.
- Os métodos anteriores careciam de técnicas eficazes de reconstituição.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver uma abordagem ascendente para o estudo da montagem do fuso.
- Investigar as contribuições de componentes individuais na dinâmica do fuso.
- Explorar os efeitos do confinamento em processos celulares.
Métodos Utilizados
- Preparação de moldes de PDMS para chips microfluídicos.
- Formação de gotículas lipídicas utilizando pressões controladas.
- Incorporação de centrôsomas e componentes de microtúbulos.
- Imageamento em tempo real do crescimento de microtúbulos utilizando microscopia confocal.
Resultados Principais
- Reconstituição bem-sucedida de estruturas semelhantes a fusos em gotículas.
- Observação da dinâmica de microtúbulos em confinamento.
- Compreensão do papel de componentes individuais na montagem do fuso.
- Demonstração da aplicabilidade do método a outros processos celulares.
Conclusões
- O método fornece uma plataforma inovadora para o estudo dos fusos mitóticos.
- O confinamento geométrico é essencial para mimetizar as condições celulares.
- Pesquisas futuras podem ampliar a compreensão da dinâmica dos fusos.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A reconstrução de estruturas semelhantes ao fuso mitótico em gotículas de emulsão com confinamento geométrico permite a análise precisa dos componentes geradores de força essenciais para a divisão celular. Esse sistema baseado em abordagem ascendente oferece uma plataforma controlada para desvendar mecanismos e validar alvos no estágio inicial de descoberta, reforçando a confiança preditiva em portfólios de alvos medicamentosos ligados ao citoesqueleto. A abordagem preenche a lacuna entre a reconstrução in vitro e a complexidade celular relevante para doenças, orientando decisões de avanço com ajuste de risco.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação quantitativa de fatores individuais de montagem do fuso sob condições definidas.
- Apóia a desmistificação mecanicista ao isolar os efeitos de motores de microtúbulos, ligadores cruzados e âncoras corticais.
- Facilita a validação funcional de alvos ao recapitular o confinamento celular e o equilíbrio de forças.
- Oferece uma plataforma para testes orientados por hipóteses de moduladores do citoesqueleto.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaio
- Estabelece sistemas biológicos reprodutíveis e confinados para fluxos de trabalho de triagem posteriores.
- Fornece saídas quantitativas sobre a dinâmica dos microtúbulos e o posicionamento do fuso.
- Permite a padronização e escalabilidade de ensaios para avaliação de compostos que visam componentes do fuso.
- Apoia a reutilização da plataforma para diversos estudos de perturbação do citoesqueleto.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha medições in vitro de equilíbrio de forças com defeitos mitóticos relevantes para doenças.
- Oferece continuidade do descobrimento mecanicista à validação em modelos pré-clínicos de agentes que visam o fuso mitótico.
- Informa o desenvolvimento de biomarcadores translacionais mediante a quantificação de fenótipos de montagem do fuso.
- Reduz o risco biológico em estágios avançados ao esclarecer os fundamentos mecanicistas da falha mitótica.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método de reconstituição integra-se ao continuum de descoberta, desde estudos mecanicistas iniciais até a identificação de compostos líderes e validação pré-clínica para alvos do citoesqueleto.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de geração de força e montagem do fuso.
- Triagem: Fornece sistemas prontos para ensaios, confinados, com leituras quantitativas reprodutíveis.
- Análises: Permite a medição do posicionamento do fuso, da dinâmica dos microtúbulos e dos resultados do equilíbrio de forças.
- Pesquisa Translacional: Conecta achados in vitro a fenótipos mitóticos relevantes para doenças e estratégias de biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular adaptável a diversos fatores e perturbações na montagem do fuso.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista em programas de direcionamento ao fuso.
- Valor Operacional: Fornece sistemas padronizados, escaláveis e reprodutíveis de ensaio para pesquisa do citoesqueleto.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao esclarecer mecanismos-alvo precocemente.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos mitóticos e citoesqueléticos para avanço.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em microfluídica, bioquímica do citoesqueleto e microscopia avançada.
- Exige acesso a infraestrutura de microfabricação, microscopia confocal e geração de gotículas controlada por pressão.
- Necessita padronização entre equipes dos protocolos de formação de gotículas e de imageamento.
- A adaptação a outros sistemas modelo pode exigir otimização do confinamento e das concentrações dos componentes.
- As limitações práticas incluem restrições na produtividade e a necessidade de controle preciso da estequiometria dos componentes.
