Dispositivo micro centrífuga baseada capilar para a Formação tamanho controlável de Monodisperse microgotas

O objetivo geral deste procedimento é gerar microgotículas monodispersas de água e óleo para estudos biológicos usando um dispositivo microfluídico de cofluxo axi-simétrico centrífugo de base capilar. Este método pode ajudar a produzir microgotículas monodispersas para o campo bioquímico para avançar no estudo do trabalho em síntese, PCR de molécula única, encapsulamento único e modelagem simples de células vivas. As principais vantagens desta técnica são que ela é fácil e ajustável.

Requer menos de um microlitro de solução de amostra e pode produzir microgotículas monodispersas do tamanho necessário. Demonstrando o procedimento estará Morita, um pós-doutorado do meu laboratório. A montagem microfluídica baseada em capilares começa com a preparação do suporte capilar.

Comece fresando quatro discos de placas plásticas de poliacetil de dois milímetros de espessura usando uma fresadora. Os discos são usados para formar uma coluna suportada por hastes e parafusos. Usando parafusos M.2, monte as placas.

Primeiro, a partir dos discos um e dois, monte a parte inferior do suporte. Em seguida, encurte os parafusos cortando-os nas seções roscadas. Conecte três dos quatro orifícios para prender os dois discos, formando uma pilha de 0,9 centímetro.

Da mesma forma, monte a parte superior do suporte a partir dos discos três e quatro. Use dois dos orifícios em cada placa para conectar as placas. Faça a pilha com 0,7 centímetros de altura.

Agora, use um parafuso longo para unir os dois orifícios vazios na parte superior do suporte com os dois orifícios vazios na parte inferior do suporte. O parafuso longo deve colocar um espaço entre os suportes de cerca de dois a três milímetros e a cabeça do parafuso deve pender sobre o suporte completo em cerca de 2,2 centímetros. Cada experimento usa um novo conjunto de capilares fabricados a partir de dois capilares.

A partir de um capilar de 90 milímetros, faça dois capilares internos usando um cortador de vidro. Faça duas seções de tamanhos iguais. A partir de um capilar de 150 milímetros, faça três seções capilares internas.

Em seguida, usando um extrator de vidro, afie cada seção capilar. Defina o peso do extrator para o máximo e defina o nível de calor para 60-70 graus para o capilar externo ou 70-80 para o capilar interno. Em seguida, afie cuidadosamente o vidro.

Mantenha o comprimento das partes contraídas dos capilares dentro dos limites recomendados. Se o comprimento das pontas for muito longo ou curto, ajuste o elemento de aquecimento até que o comprimento correto seja alcançado. Agora, prepare-se para cortar as pontas.

Primeiro, use um pouco de fita adesiva transparente para prender um capilar a um estágio de microscópio. Pendure a ponta sob a objetiva. Em segundo lugar, usando um fio de platina coberto por contas de vidro, corte a ponta em três etapas.

Primeiro, coloque o capilar onde a quebra deve ocorrer em contato com um cordão frio. Em segundo lugar, aqueça o fio por um a dois segundos. Em seguida, em terceiro lugar, corte a ponta resfriando o fio de platina.

Esta operação deve ser realizada usando um pedal de controle para aquecer o fio. Agora, usando uma microforja, ajuste os diâmetros dos orifícios capilares. Para os dois capilares de vidro externos, faça seus orifícios de 60 mícrons.

Para os três capilares internos, faça orifícios com diâmetros de cinco, 10 e 20 mícrons. Para gerar as microgotículas, primeiro encha um capilar de vidro externo com um surfactante contendo óleo, como hexadecano, contendo 2% de monooleato de sorbitina em peso. Carregue 10 microlitros da solução no capilar.

Em seguida, prenda o copilar carregado na parte inferior do suporte. Em seguida, usando ação capilar, carregue cerca de 0,1 microlitros de solução aquosa em um capilar de vidro interno. Posicione o capilar interno carregado na parte superior do suporte.

Agora, insira o capilar interno no suporte e no capilar externo. Enquanto observa a ponta através de um microscópio, gire o parafuso longo do suporte para avançar lenta e cuidadosamente no capilar interno para o capilar externo. Avance o capilar interno para onde o diâmetro do capilar externo esteja entre 100 e 150 mícrons.

Agora, introduza 100 microlitros do mesmo óleo com surfactante no fundo de um microtubo de 1,5 mililitro. Isso servirá como um tubo de coleta de microdoplet. Posicione cuidadosamente o suporte e os capilares no microtubo carregado.

Certifique-se de que o capilar externo não esteja em contato com a solução no microtubo. Em seguida, carregue o tubo em uma centrífuga do tipo basculante de mesa. Para gerar as microgotículas, opere a centrífuga a 1.600 vezes a gravidade por um ou dois segundos.

Em seguida, remova os capilares e o suporte do tubo e pegue uma alíquota das microgotículas de água-óleo coletadas no tubo. Ejete as microgotículas em uma lâmina de vidro e visualize-as para análise. Usando este protocolo, várias microgotículas de água-óleo foram feitas de hexadecano contendo 2% de monooleato de sorbitina.

As gotículas feitas usando uma pipeta interna com um diâmetro de orifício de cinco mícrons foram medidas em média com 8,3 mícrons de diâmetro. As gotículas feitas usando uma pipeta interna com um diâmetro de orifício de 10 mícrons foram medidas em média com 12,7 mícrons de diâmetro. As gotículas feitas usando uma pipeta interna com um orifício de 20 mícrons tinham cerca de 17,9 mícrons de diâmetro.

Assim, este método produz microgotículas monodispersas que têm um diâmetro próximo ao tamanho do orifício capilar interno. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como produzir e controlar o tamanho de microgotículas monodispersas de água e óleo para experimentos químicos quantitativos. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco a 10 minutos, se for executada corretamente.