Uma plataforma microfluídica para processamento de precisão de pequeno volume de amostra e respectiva utilização para Tamanho partículas biológicas separadas com um microdispositivos Acústico

O objetivo geral deste procedimento é realizar separações automatizadas de partículas de pequeno volume usando um dispositivo fótico microfluídico. Este método pode permitir procedimentos-chave no campo da engenharia biomédica, incluindo processamento robusto e separação de amostras para aplicações de biodetecção e pesquisa clínica. As principais vantagens desta técnica são modularidade, precisão, robustez e automação, tornando-a adaptável e flexível não apenas para separação retic, mas ampla variedade de escoamento através de dispositivos de separação microfluídica.

Reconhecemos pela primeira vez a necessidade dessa capacidade de executar separações de forma rotineira e confiável em volumes de amostras biológicas submilimétricas sem diluição significativa ou perda de analito. A integração da medição de amostras e do roteamento automatizado da fonte aos arquivos de coleta, juntamente com as operações padrão da bomba de seringa, é fundamental para trabalhar com sucesso nessa escala. Para começar, projete o dispositivo acústico e o layout das duas máscaras fotográficas, conforme descrito na seção um do protocolo de texto que o acompanha.

Em seguida, padronize as portas de fluido traseiras em um wafer de silício 1 0 0 polido de lado duplo. Usando fotolitografia de resistência positiva padrão Grave esta geometria usando gravação de íons reativos profundos a uma profundidade de 350 a 400 micrômetros. Em seguida, vire o wafer e padronize a geometria do canal de fluido frontal.

Novamente, usando fotolitografia de resistência positiva padrão, monte o wafer padronizado em um segundo wafer transportador de silício em branco. Usando fotorresistor, agora grave os canais expostos a uma profundidade de 200 micrômetros. Usando corrosão de íons de reação profunda, em seguida, mergulhe o wafer do dispositivo em uma solução de decapagem resistente para retirá-lo do wafer de silício em branco.

Em seguida, limpe o wafer do dispositivo e um wafer de vidro de silicato boro de 0,5 milímetro de espessura usando solução de piranha. Uma vez limpo, sele os canais de fluido ligando ionicamente o vidro e o wafer de silício usando as condições mostradas aqui. Finalmente, corte os cavacos individuais com uma lâmina de diamante em uma serra de corte de um kit de epóxi de baixa viscosidade de dois componentes.

Pese a proporção recomendada de ambos os componentes e misture-os bem. Em seguida, coloque o titanato de chumbo Zirkin oito ou a cerâmica piezoelétrica PCT em um gabarito adequado e use uma pipeta para espalhar aproximadamente 10 microlitros da mistura epóxi uniformemente sobre ele para criar uma camada fina e uniforme. Em seguida, coloque o chip no gabarito e alinhe o lado epóxi da cerâmica pizo com o chip microfluídico.

Pode ser necessário prender o chip com fita adesiva para mantê-lo no lugar durante o alinhamento. Prenda o conjunto em um torno tomando cuidado para não rachar nenhum dos componentes e cure a temperatura e a duração recomendadas pelo fabricante do epóxi. Depois que o epóxi curar, use um ferro de solda de ponta fina para prender fios de bitola fina em cada lado da cerâmica pizo.

Se necessário, use o fluxo apropriado para preparar a superfície pizo. Tome cuidado para fazer o contato mais breve possível com o pizo Para evitar despolarizá-lo termicamente. Anexe o chip a uma placa de ensaio fluídica usando dispositivos de fixação.

Além disso, conecte um ventilador de resfriamento à placa de ensaio para regular a temperatura durante os experimentos acústicos. Em seguida, aparafuse o chip nos conectores mundiais. Monte a placa de ensaio na platina do microscópio e junte-se ao mundo para conectar conectores a tubos adicionais nas entradas e saídas.

Usando uniões roscadas padrão de um quarto 28. Para uma tubulação de 16 polegadas, conecte o chip microfluídico à bomba de seringa, válvulas de seleção multiportas controladas por computador, medidores de vazão com interface de PC e tubulação, conforme mostrado aqui e descrito na figura quatro do protocolo de texto que acompanha. Antes de executar a separação, encha os reservatórios de reagentes de limpeza e prepare suas linhas de fluido correspondentes.

Defina também as válvulas três e quatro nas saídas de cavacos para fluir inicialmente para os reservatórios de resíduos. Em seguida, ligue o ventilador de resfriamento. Conecte os fios de cerâmica pizo ao amplificador de potência e defina o gerador de funções na frequência de ressonância para o chip acústico que está sendo usado.

Ajuste o voltage ponto de ajuste no gerador de funções para que o RF amplifier emite entre 12 e 25 volts pico a pico, conforme apropriado para a separação desejada. Em seguida, conecte os frascos de coleta apropriados e o frasco de entrada do buffer ao sistema. Utilizar o tampão de amostra adequado para as células ou partículas a separar ou, conforme exigido pelo ensaio de análise, a utilizar após a separação.

Em seguida, carregue o software de controle e use-o para controlar as válvulas, sensores de fluxo e bomba para realizar a rotina de escorva e separação totalmente automática. Imediatamente antes de iniciar o procedimento de separação, agite brevemente o frasco de amostra para ressuspender quaisquer partículas que possam ter se depositado. Como alternativa, pipete a amostra para cima e para baixo 10 vezes para misturar amostras biológicas que são mais suscetíveis a danos ou aglomeração por vórtice.

Em seguida, conecte o sample frasco à linha de entrada e inicie a rotina de escorva e separação sem demora. Comece usando o software para preparar a entrada de ar das válvulas um e dois para garantir que a tubulação não contenha fluido. Prepare simultaneamente a tubulação que conecta o frasco de entrada do tampão à válvula dois e o sample frasco de entrada à válvula um.

Faça com que a bomba de seringa retire aproximadamente 15 microlitros de ambos os frascos para encher completamente a tubulação, conectando-os às válvulas. Finalmente, troque as válvulas um e dois para resíduos para expelir qualquer excesso de fluido ou ar que tenha entrado na bobina de carregamento. Em seguida, configure o programa para carregar a bobina de amostra retirando primeiro 25 microlitros de ar a 50 microlitros por minuto.

Em seguida, carregando 250 microlitros de amostra a 200 microlitros por minuto, seguido por 35 microlitros de tampão principal a 200 microlitros por minuto e, finalmente, outros 25 microlitros de ar a 50 microlitros por minuto. Em seguida, configure as bombas de seringa para infundir os tampões de fluido carregados em 100 microlitros por minuto e monitore as taxas de fluxo nas saídas de partículas pequenas e grandes usando sensores de fluxo. A taxa de fluxo apropriada pode ser determinada conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Quando os sensores de fluxo detectarem um pico na vazão indicando a passagem do primeiro entreferro, troque a válvula de saída correspondente do frasco de resíduos para um sample frasco de coleta. Certifique-se de que o fluxo seja estável à medida que a amostra transita pelo chip e seja separada observando as leituras do sensor de fluxo. À medida que a amostra passa pelo chip, as frações separadas são coletadas nas válvulas de saída.

No final do sample plugue, observe o sensor de fluxo, detecte o segundo entreferro. Neste ponto, mude as válvulas de saída de volta para o lixo. Após a dispensação do volume total, interrompa a infusão da bomba de seringa e encerre a rotina de automação.

Após a conclusão do experimento de separação, desconecte os frascos de coleta de amostras de partículas pequenas e grandes e armazene-os adequadamente para análise subsequente. Prenda o sample tubo de coleta em frascos vazios para coletar o excesso de soluções de limpeza que serão lavadas através dos tubos. Em seguida, inicie a rotina de limpeza automatizada do sistema, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha.

Durante este processo, o programa controlará as válvulas e a bomba de seringa para carregar sequencialmente a bobina de retenção com reagentes de limpeza e lavá-los através do sistema. Uma vez concluído o processo automatizado de limpeza e descontaminação, descarte o excesso de soluções de lavagem e os frascos em que foram coletados, seguindo os procedimentos apropriados para o manuseio de resíduos biológicos ou químicos. Aqui é mostrada uma varredura de frequência representativa de um dispositivo pizo e microfluídico bem acoplado.

Quando o acoplamento entre o dispositivo pizo e microfluídico é bom, as partículas focalizam firmemente na frequência de ressonância, resultando em um pico claro na intensidade fluorescente e migração para a posição de foco esperada. Em contraste, onde há partículas de acoplamento ruim não focarão bem e o dispositivo é inadequado quando o foco de alta qualidade ou o fluxo rápido são críticos para a aplicação necessária. Cada linha neste gráfico representa os resultados da separação usando vários tamanhos de partículas de poliestireno e tensões de acionamento pizo.

Em geral, tensões mais altas são necessárias para extrair partículas menores. As tensões secas não podem ser aumentadas indefinidamente, no entanto, devido à maior dissipação de calor e ao aumento dos efeitos do fluxo acústico. Para demonstrar a utilidade desta plataforma para a separação de partículas biológicas, células raji humanas com um diâmetro médio de oito a 10 micrômetros foram enriquecidas com o vírus da dengue com um diâmetro aproximado de 50 nanômetros e depois separadas usando o dispositivo microfluídico acústico.

Uma vez que um sistema como este é montado e programado, as separações podem ser realizadas rotineiramente em aproximadamente cinco minutos. Cerca de três amostras por hora podem ser processadas com limpeza e descontaminação completas entre as amostras. Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como contagem de células, western blotting ou sequenciamento de próxima geração, a fim de confirmar a pureza da separação e elucidar o significado biológico.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fabricar um dispositivo típico de separação microfluídica. Use as conexões do mundo para chip para fazer interface com o hardware e executar um procedimento de separação automatizado de maneira precisa e robusta. Não se esqueça de que trabalhar com materiais infecciosos pode ser extremamente perigoso e só deve ser realizado por pessoal devidamente treinado, usando os equipamentos e procedimentos apropriados prescritos institucionalmente para segurança biológica.