Uma plataforma microfluídica para processamento de precisão de pequeno volume de amostra e respectiva utilização para Tamanho partículas biológicas separadas com um microdispositivos Acústico

O objetivo geral deste procedimento é realizar separações automatizadas de partículas em pequeno volume utilizando um dispositivo microfluídico fotônico. Este método pode viabilizar procedimentos fundamentais na área de engenharia biomédica, incluindo o processamento robusto e a separação de amostras para aplicações em detecção biológica e pesquisas clínicas. As principais vantagens desta técnica são modularidade, precisão, robustez e automação, tornando-a adaptável e flexível não apenas para separação de reticulócitos, mas também para uma ampla variedade de dispositivos microfluídicos de separação contínua.

Reconhecemos inicialmente a necessidade dessa capacidade para executar rotineira e confiavelmente separações em volumes de amostras biológicas submilimétricas sem diluição significativa ou perda de analito. A integração da medição da amostra e do encaminhamento automatizado dos arquivos de origem aos de coleta, juntamente com as operações padrão de bomba de seringa, é fundamental para trabalhar com sucesso nessa escala. Para iniciar o projeto, desenhe o dispositivo reticulado acústico e o layout para as duas máscaras fotolitográficas conforme descrito na seção um do protocolo textual complementar.

Em seguida, defina os orifícios de fluido do lado posterior sobre uma pastilha de silício 1 0 0 com dupla face polida. Utilizando litografia fotográfica com resistência positiva padrão, grave essa geometria por meio de etching reativo iônico profundo até uma profundidade de 350 a 400 micrômetros. A seguir, vire a pastilha e defina a geometria do canal de fluido do lado frontal.

Novamente, utilizando litografia fotônica com resistência positiva padrão, monte a pastilha padronizada em uma segunda pastilha de silício portadora virgem. Usando agora o fotoresistente, grave os canais expostos até uma profundidade de 200 micrômetros. Mediante ataque iônico profundo, em seguida, mergulhe a pastilha do dispositivo em uma solução removedora de resistente para separá-la da pastilha de silício virgem.

Em seguida, limpe a pastilha do dispositivo e uma pastilha de vidro borossilicato sem características com espessura de 0,5 milímetro utilizando solução de piranha. Após a limpeza, sela-se os canais de fluido por ligação iônica entre o vidro e a pastilha de silício utilizando as condições mostradas aqui. Por fim, corte as pastilhas individuais separadamente com uma lâmina de diamante em uma serra de corte a partir de um kit de epóxi de baixa viscosidade com dois componentes.

Pese a proporção recomendada de ambos os componentes e misture-os completamente. Em seguida, coloque o titanato de zircônio-chumbo oito ou o cerâmico piezoelétrico PCT em um suporte apropriado e use uma pipeta para espalhar aproximadamente 10 microlitros da mistura de epóxi uniformemente sobre ele, formando uma camada fina e homogênea. A seguir, coloque o chip no suporte e alinhe o lado com epóxi do cerâmico piezoelétrico com o chip microfluídico.

Pode ser necessário prender o chip com fita para mantê-lo no lugar durante o alinhamento. Prenda o conjunto em uma morsa, tomando cuidado para não trincar nenhum dos componentes, e cure na temperatura e duração recomendadas pelo fabricante do epóxi. Após a cura do epóxi, use uma ponteira fina de solda para ligar fios de bitola fina a cada lado da cerâmica piezoelétrica.

Se necessário, use o fluxo apropriado para preparar a superfície do pizo. Tenha cuidado para fazer o menor contato possível com o pizo, a fim de evitar sua despolimerização térmica. Fixe o chip em uma placa fluidica utilizando dispositivos de fixação.

Além disso, fixe um ventilador de refrigeração na matriz de contatos para regular a temperatura durante os experimentos acústicos. Em seguida, parafuse os conectores do chip ao mundo. Monte a matriz de contatos no estágio do microscópio e conecte os conectores do mundo ao chip a tubos adicionais nas entradas e saídas.

Utilizando uniões roscadas padrão de um quarto de polegada com 28 fios. Para uma tubulação de um dezesseis avos de polegada, conecte o chip microfluídico à bomba de seringa, às válvulas seletoras multicanais controladas por computador, aos medidores de fluxo conectados ao PC e às tubulações conforme mostrado aqui e descrito na figura quatro do protocolo de texto complementar. Antes de realizar a separação, preencha os reservatórios de reagentes de limpeza e purgue as respectivas linhas de fluido.

Também ajuste as válvulas três e quatro nas saídas do chip para fluir inicialmente para os reservatórios de descarte. Em seguida, ligue o ventilador de refrigeração. Conecte os cabos do piezo cerâmico ao amplificador de potência e ajuste o gerador de funções na frequência de ressonância do chip acústico que está sendo utilizado.

Ajuste o ponto de tensão no gerador de funções para que o amplificador de RF forneça entre 12 e 25 volts pico a pico, conforme apropriado para a separação desejada. Em seguida, conecte os frascos de coleta apropriados e o frasco de entrada do tampão ao sistema. Utilize o tampão de amostra adequado para as células ou partículas a serem separadas ou conforme exigido pelo ensaio analítico a ser utilizado após a separação.

Em seguida, carregue o software de controle e utilize-o para operar as válvulas, sensores de fluxo e bomba, executando assim a rotina automática completa de escorvamento e separação. Imediatamente antes de iniciar o procedimento de separação, agite brevemente o frasco da amostra em vórtex para ressuspender quaisquer partículas que possam ter sedimentado. Alternativamente, pipete a amostra para cima e para baixo 10 vezes para homogeneizar amostras biológicas mais suscetíveis a danos ou agregação causados pelo vórtex.

Em seguida, conecte o frasco da amostra à linha de entrada e inicie imediatamente a rotina de escorvamento e separação. Comece utilizando o software para escorvar a entrada de ar das válvulas um e dois, garantindo que os tubos não contenham fluido. Simultaneamente, escorve os tubos que conectam o frasco de entrada do tampão à válvula dois e o frasco de entrada da amostra à válvula um.

Deixe a bomba de seringa aspirar aproximadamente 15 microlitros de ambos os frascos para preencher completamente a tubulação, conectando-os às válvulas. Por fim, comute as válvulas um e dois para o descarte, a fim de expelir qualquer fluido em excesso ou ar que tenha entrado na bobina de carregamento. Em seguida, configure o programa para carregar a bobina de amostra, primeiro aspirando 25 microlitros de ar a 50 microlitros por minuto.

Em seguida, carregue 250 microlitros da amostra a 200 microlitros por minuto, seguido por 35 microlitros do tampão líder a 200 microlitros por minuto e, finalmente, mais 25 microlitros de ar a 50 microlitros por minuto. Ajuste as bombas de seringa para infundir os êmbolos de fluido carregados a 100 microlitros por minuto e monitore as vazões nas saídas de partículas pequenas e grandes utilizando sensores de fluxo. A proporção de fluxo apropriada pode ser determinada conforme descrito no protocolo de texto complementar.

Quando os sensores de fluxo detectarem um pico na taxa de fluxo indicando a passagem do primeiro intervalo de ar, comute a válvula de saída correspondente do frasco de descarte para um frasco de coleta de amostra. Certifique-se de que o fluxo esteja estável enquanto a amostra atravessa o chip e é separada, observando as leituras dos sensores de fluxo. À medida que a amostra passa pelo chip, as frações separadas são coletadas nas válvulas de saída.

No final do tampão da amostra, observe o sensor de fluxo e detecte a segunda bolha de ar. Neste momento, comute as válvulas de saída novamente para o descarte. Após o volume completo ser dispensado, pare a infusão da bomba de seringa e encerre a rotina de automação.

Após a conclusão do experimento de separação, desconecte os frascos de coleta das amostras de partículas pequenas e grandes e armazene-os adequadamente para análises subsequentes. Prenda o tubo de coleta da amostra em frascos vazios para recolher soluções de limpeza em excesso que serão passadas pelos tubos. Em seguida, inicie a rotina automatizada de limpeza do sistema conforme descrito no protocolo textual complementar.

Durante este processo, o programa controlará as válvulas e a bomba de seringa para carregar sequencialmente a bobina de retenção com reagentes de limpeza e lavá-los através do sistema. Após a conclusão do processo automatizado de limpeza e descontaminação, descarte as soluções excedentes de lavagem e os frascos nos quais foram coletadas, seguindo os procedimentos apropriados para o manuseio de resíduos biológicos ou químicos. É mostrado aqui um espectro de frequência representativo de um dispositivo piezoelétrico e microfluídico bem acoplado.

Quando o acoplamento entre o pizo e o dispositivo microfluídico é bom, as partículas se focam fortemente na frequência ressonante, resultando em um pico nítido na intensidade fluorescente e na migração para a posição de foco esperada. Em contraste, quando há acoplamento fraco, as partículas não se focam adequadamente e o dispositivo é inadequado quando o foco de alta qualidade ou fluxo rápido são essenciais para a aplicação exigida. Cada linha neste gráfico representa resultados de separação utilizando diversos tamanhos de partículas de poliestireno e tensões de acionamento do pizo.

Em geral, são necessárias tensões mais altas para extrair partículas menores. No entanto, as tensões em meio seco não podem ser aumentadas indefinidamente devido à maior dissipação de calor e aos efeitos crescentes do streaming acústico. Para demonstrar a utilidade desta plataforma para separação de partículas biológicas, células humanas Raji com diâmetro médio de oito a 10 micrômetros foram adicionadas ao vírus da dengue, com diâmetro aproximado de 50 nanômetros, e então separadas utilizando o dispositivo microfluídico acústico.

Uma vez que um sistema como este é montado e programado, as separações podem ser rotineiramente realizadas em aproximadamente cinco minutos. Cerca de três amostras por hora podem ser processadas com limpeza e descontaminação completas entre as amostras. Após este procedimento, outros métodos podem ser realizados, como contagem celular, western blotting ou sequenciamento de nova geração, a fim de confirmar a pureza da separação e elucidar sua significância biológica.

Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como fabricar um dispositivo microfluídico típico de separação. Utilize conexões do mundo para o chip para interagir com o equipamento e executar um procedimento automatizado de separação de forma precisa e robusta. Não se esqueça de que trabalhar com materiais infecciosos pode ser extremamente perigoso e deve ser realizado apenas por pessoal devidamente treinado, utilizando os equipamentos e procedimentos biologicamente seguros prescritos pela instituição.