Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

Olá, eu sou Jersey. Olá, meu nome é Shabi e nós dois somos pesquisadores de pós-doutorado no Imperial College of London, trabalhando com o professor Andrew Di Melo e o Dr. Josh Del em plataformas de gotículas microfluídicas. Plataformas microfluídicas baseadas em gotículas prometem candidatos para experimentação de maior rendimento porque podem ser geradas em volumes muito altos definidos com precisão e suas competições, a frequência de geração pode ser tão alta quanto vários quilos.

Além disso, como a região de interesse pode ser encapsulada em compartimentos de até alguns litros, tanto a diafonia quanto a dispersão podem ser eliminadas e os processos analíticos podem ser cronometrados com maior precisão. Em nosso grupo, já implementamos com sucesso plataformas de microgotículas para muitas aplicações. Por exemplo, reação em cadeia da polimerase, síntese de nanopartículas e ensaio de célula molecular única.

As grandes quantidades de informações geradas nesses sistemas devem ser extraídas, aproveitadas e utilizadas com eficiência. A este respeito, o método de detecção escolhido deve ser correto, fornecer alta sensibilidade e baixos limites de detecção, ser aplicável a uma variedade de espécies moleculares, ser não destrutivo e poder ser integrado a dispositivos microfluídicos de maneira fácil. Para atender a essa necessidade, desenvolvemos um conjunto de ferramentas e protocolos experimentais que permitem a extração de grandes quantidades de informações físicas de ambientes de pequeno volume e são aplicáveis à análise de uma ampla gama de tores físicos, químicos e biológicos.

Neste protocolo, apresentaremos métodos que são aplicados à detecção de células únicas e ao mapeamento de processos de mistura no Dropbox. Os chips microfluídicos são tradicionalmente fabricados em poli dimetil Sloane PGMS usando métodos de fotolitografia. Este processo deve ser realizado em uma instalação de sala limpa para obter canais microfluídicos Spinco, SU oito 50 em um wafer de silício macio assar em uma placa quente a 65 graus e 95 graus para evaporar o solvente e densificar o filme após o resfriamento, expor o SU oito, resistir com radiação UV sob a máscara apropriada, e, em seguida, asse o wafer a 65 graus e 95 graus após o resfriamento.

Desenvolva as áreas não expostas usando a solução de revelação apropriada enquanto agita. Use solvente EC fresco para enxaguar o wafer e depois seque-o sob gás para gerar uma superfície limpa. Trate o wafer com lavagens de hexano e metanol.

Também para completar o processo de fabricação do mestre esato, evaporar um agente de apreensão na superfície em um dessecador por 40 minutos. Para formar substratos microfluídicos estruturados, misturamos S guard 1 8 4 em uma proporção de 10 para um de reticulador de resina e puxamos sobre o mestre. Desgaseifique isso em um dessecador e cure o dispositivo a 65 graus.

Corte o PDMS curado e retire-o do mestre. Crie orifícios de acesso para tubos fluídicos usando um punção de biópsia. Catalise outra camada de PDMS por 20 minutos a 65 graus.

Coloque a camada superior preparada na camada inferior e catalise durante a noite a 65 graus. Descasque as fichas da placa de Petri e corte em cubos. Uma vez que os chips tenham sido fabricados, eles estão prontos para serem usados infundindo as soluções de interesse.

Encha as seringas com as soluções necessárias, garantindo que não haja bolhas de ar em nenhuma parte da tubulação. Para a geração de gotículas, duas fases são usadas. A fase aquosa dispersa contém os reagentes de interesse.

A fase oleosa atua como o tubo de ajuste de fase contínua com o mesmo diâmetro interno que as pontas das agulhas da seringa em uma extremidade das agulhas, monta as seringas em uma bomba de seringa e define a taxa de fluxo de infusão desejada. Para cada fase, recomenda-se uma proporção mínima de vazão aquosa de óleo de um para evitar o umedecimento do PDMS pela fase aquosa, o que levaria à formação de gotículas instáveis. Conecte as outras extremidades da tubulação diretamente aos orifícios perfurados no substrato PDMS.

Para soluções mais complexas, sílica, portas capilares ou conectores também podem ser implementados. Conecte a porta de saída do cavaco à tubulação e direcione para um coletor para coleta de resíduos ou processamento de análise adicional. Uma vez configurado, existem duas configurações principais de microcanais para gerar foco de fluxo de gotículas ou um formato de junção T como resultado das forças puras que surgem do uso dessas geometrias para unir os dois fluidos admissíveis e as subsequentes entradas capilares que se desenvolvem na interface.

Um oh dispersar gotículas tão pequenas quanto alguns femtolitros são geradas espontaneamente. Uma vez que as gotículas estão sendo geradas, elas podem ser sondadas usando uma configuração óptica. O sistema óptico é configurado com o seguinte protocolo.

Use um microscópio confocal com capacidade de posicionamento submicrônico automatizado e um laser operando em um comprimento de onda que corresponda à absorção das quedas de flúor envolvidas. Para excitá-los, use um laser de pulso operando a taxas de repetição de vários megahertz para imagens fluorescentes ao longo da vida. Os experimentos de catarro usam espelhos de direção de feixe e óptica para controlar a altura do feixe, bem como a direção do feixe.

Use um espelho dicróico para refletir o feixe de laser na lente objetiva. Se dois lasers forem usados simultaneamente, um espelho diic de banda dupla pode ser instalado. Para permitir a reflexão dos dois feixes de laser, use uma objetiva de microscópio NA de alta abertura numérica corrigida para o infinito para trazer a luz do laser para um foco apertado dentro de um canal microfluídico.

Colete a fluorescência emitida pela amostra dentro do canal microfluídico, usando a mesma objetiva de alta NA e transmitida através do mesmo espelho dicróico. Remova qualquer luz de excitação residual usando um filtro de emissão de banda única ou dupla. Concentre a emissão de fluorescência em um orifício de 75 micrômetros.

Usando uma lente plana convexa. Posicione o orifício no plano confocal da objetiva do microscópio. Use outro espelho dicróico para dividir o sinal fluorescente em dois detectores.

Filtrar a fluorescência reflectida pelo espelho dicróico com um filtro de emissão e focalizá-la com uma lente convexa simples no primeiro detector. Para experimentos envolvendo um flúor vermelho secundário, filtre a fluorescência transmitida pelo espelho diic com outro filtro de emissão e, em seguida, focalize-a com outra lente plana convexa no segundo detector. Use fotodiodos de avalanche para detecção de fótons de fluorescência.

Para a aquisição de dados de fluorescência, acople o sinal eletrônico do detector de fotodiodo de avalanche a um dispositivo DAQ multifuncional para registro de dados em execução em um computador pessoal. Para experimentos de catarro, use um laser de pulso e conecte os detectores a uma placa TCS PC de contagem de fótons únicos correlacionada ao tempo em execução em um PC separado. Este cartão permite que os dados de vida útil da fluorescência sejam obtidos.

Usando uma metodologia TCS PC. Cada fóton fluorescente detectado é correlacionado a um pulso de laser incidente e, portanto, cada fóton fluorescente emitido recebe um tempo de atraso. Esses dados podem ser ajustados a uma curva de decaimento exponencial única ou múltipla para obter uma estimativa da taxa radiativa dos fluoróforos.

Agora sabemos que as células são altamente heterogêneas do ponto de vista biológico, físico e químico. Portanto, idealmente, devemos analisar cada célula de cada vez. No entanto, os ensaios devem ser realizados com um rendimento mais alto para que possamos coletar informações quantitativas suficientes para chegar a uma conclusão confiável e significativa.

Aqui temos um exemplo de encapsulamento de células de e coli em gotícula única, de modo que o como está pode ser executado. Use a cepa top 10 de E coli que foi cultivada durante a noite. Para detectar a viabilidade das células, use citonove e iodeto de propídio.

Ambos os corantes são corantes de intercalação de DNA e sua intensidade de fluorescência aumenta em mais de 20 vezes. Ao se ligar ao DNA, o citogênio é um corante fluorescente verde que é permeável à membrana e iodeto de propídio. É um corante fluorescente vermelho, que é impermeável à membrana.

Assim, as células vivas fluorescem em verde, enquanto as células mortas exibem emissões verdes e vermelhas. Aqui podemos ver a geração de gotículas e um encapsulamento de célula única com uma junção T. Este vídeo foi gravado com uma câmera de alta velocidade, mas gotículas podem ser geradas a uma taxa de milhares por segundo.

Ao encapsular as células, deve-se certificar-se de que a cultura das células seja diluída para que haja menos células do que as gotículas geradas, que as células sejam impedidas de sedimentar, o que pode ocorrer na seringa ou tubo. Use uma barra de agitação magnética dentro da seringa para manter as células uniformemente distribuídas na solução. Use tubos muito finos, 50 micrômetros para conectar a seringa ao microchip.

Isso garante uma taxa de fluxo rápida dentro da tubulação e, portanto, evita que as células sedimentem. Aqui estão os exemplos típicos de contagens de fotos em função do tempo para os experimentos baseados em células. Para mapear processos de mistura dentro de gotículas.

As gotículas podem ser geradas usando dois quatros fluorados diferentes com diferentes tempos de vida. Dentro de uma gota de fluxo, um campo de fluxo é gerado, que eventualmente mistura as duas soluções originalmente separadas para aprimorar o processo de mistura. A simetria do campo de fluxo pode ser alterada usando canais de enrolamento.

Para sondar as gotículas, focalize o volume da sonda óptica na metade da altura de um microcanal ao longo do qual as gotículas estão fluindo, começando de um lado do canal, realize cada experimento ao longo de toda a largura do canal. Em intervalos de um micrômetro. Implemente um algoritmo para diferenciar rajadas únicas associadas a gotículas do fundo de ruído da fase oleosa e para estabelecer a duração de cada rajada.

Implemente um segundo algoritmo para extrair os valores de tempo de atraso e intensidade ao longo do comprimento de cada gota na largura específica em que o experimento foi realizado. Em seguida, use um algoritmo MLE estimador de máxima verossimilhança para avaliar o tempo de vida de fluorescência de cada gotícula no experimento. A média dos valores de tempo de vida para todas as gotículas no experimento reduz o erro final do cálculo do MLE.

Quanto mais gotículas forem sondadas, menor será o erro uma vez obtida uma trajetória de vida. Para cada largura, combine todas as trajetórias em um mapa 2D. Uma vez que cada valor de vida está associado a uma mistura particular dos dois quatro florais, um mapa de concentração ou mistura pode ser obtido.

Descrevemos a fabricação de um microdispositivo e configuração experimental e protocolos associados para a formação de microgotículas e o encapsulamento da região e a detecção óptica do processo, as gotículas. Os dois exemplos selecionaram a detecção de células únicas em gotículas e o mapeamento dos processos de mistura. Dentro da gota que flui representam aplicações comuns que estão sendo investigadas atualmente com a microfluídica de gotículas.

Como ilustram os experimentos apresentados, o uso de plataformas microfluídicas de gotículas apresenta certas características atrativas, como alto rendimento, causam o confinamento perfeito e maior reprodutibilidade. A grande quantidade de informações produzidas e a maior velocidade com que essas informações estão sendo geradas. O DU exigiu o uso de métodos de detecção rápida com a mais alta resolução espacial temporal para que a vantagem total fosse obtida com essas plataformas miniaturizadas.

Nesse caso, demonstramos que isso é possível usando técnicas espectroscópicas fluoradas de alta precisão.