Name: Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: Aprenda a encapsular células em gotículas de picolitro com alta eficiência usando microfluídica. Este método combina ordenação celular dinâmica com geração de gotas para controlar o número de células por gota em aplicações biológicas.

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Agradecemos Technologies Raindance para a amostra de PFPE-PEG surfactante utilizada neste estudo, e agradecemos a BioMEMS Resource Center (Mehmet Toner, diretor) para o molde de wafer de silício usado para criar réplicas dos canais de PDMS.

<ol><li>Zagnoni, M., Lain, G. L. e, Cooper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrocoalescence+mechanisms+of+microdroplets+using+localized+electric+fields+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Electrocoalescence mechanisms of microdroplets using localized electric fields in microfluidic channels.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 26, 14443-14449 (2010).</li>
<li>Niu, X. Z., Gielen, F., Edel, J. B., deMello, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microdroplet+dilutor+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem%22%5BJournal%5D)">A microdroplet dilutor for high-throughput screening.</a> Nat. Chem. 3, 437-442 (2011).</li>
<li>Vincent, M. E., Liu, W., Haney, E. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+stochastic+confinement+enhances+analysis+of+rare+cells+by+isolating+cells+and+creating+high+density+environments+for+control+of+diffusible+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+reviews%22%5BJournal%5D)">Microfluidic stochastic confinement enhances analysis of rare cells by isolating cells and creating high density environments for control of diffusible signals.</a> Chemical Society reviews. 39, 974-984 (2010).</li>
<li>Huebner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+of+protein+expression+in+single+cells+using+droplet+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection of protein expression in single cells using droplet microfluidics.</a> Chemical communications. , 1218-1220 (2007).</li>
<li>Love, J. C., Ronan, J. L., Grotenbreg, G. M., van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengraving+method+for+rapid+selection+of+single+cells+producing+antigen-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A microengraving method for rapid selection of single cells producing antigen-specific antibodies.</a> Nature biotechnology. 24, 703-707 (2006).</li>
<li>Bradshaw, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+detection+of+secreted+products+from+human+lymphocytes+by+microengraving%3A+Cytokines+and+antigen-reactive+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: Cytokines and antigen-reactive antibodies.</a> Clin. Immunol. 129, 10-18 (2008).</li>
<li>Liu, W. S., Kim, H. J., Lucchetta, E. M., Du, W. B., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+incubation%2C+and+parallel+functional+testing+and+identification+by+FISH+of+rare+microbial+single-copy+cells+from+multi-species+mixtures+using+the+combination+of+chemistrode+and+stochastic+confinement%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Isolation, incubation, and parallel functional testing and identification by FISH of rare microbial single-copy cells from multi-species mixtures using the combination of chemistrode and stochastic confinement.</a> Lab on a chip. 9, 2153-2162 (2009).</li>
<li>Boedicker, J. Q., Li, L., Kline, T. R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+bacteria+and+determining+their+susceptibility+to+antibiotics+by+stochastic+confinement+in+nanoliter+droplets+using+plug-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Detecting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics by stochastic confinement in nanoliter droplets using plug-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 8, 1265-1272 (2008).</li>
<li>Koster, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drop-based+microfluidic+devices+for+encapsulation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Drop-based microfluidic devices for encapsulation of single cells.</a> Lab on a chip. 8, 1110-1115 (2008).</li>
<li>Kelly, R. T., Page, J. S., Marginean, I., Tang, K., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dilution-free+analysis+from+picoliter+droplets+by+nano-electrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">Dilution-free analysis from picoliter droplets by nano-electrospray ionization mass spectrometry.</a> Angew Chem. Int. Ed. Engl. 48, 6832-6835 (2009).</li>
<li>Hong, J., deMello, A. J., Jayasinghe, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-electrospraying+and+droplet-based+microfluidics%3A+control+of+cell+numbers+within+living+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+materials%22%5BJournal%5D)">Bio-electrospraying and droplet-based microfluidics: control of cell numbers within living residues.</a> Biomedical materials. 5, 21001(2010).</li>
<li>Edd, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+encapsulation+of+single-cells+into+monodisperse+picolitre+drops%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Controlled encapsulation of single-cells into monodisperse picolitre drops.</a> Lab on a chip. 8, 1262-1264 (2008).</li>
<li>Anna, S. L., Bontoux, N., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+dispersions+using+%22flow+focusing%22+in+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Formation of dispersions using "flow focusing" in microchannels.</a> Applied Physics Letters. 82, 364(2003).</li>
<li>Utada, A., Fernandez-Nieves, A., Stone, H., Weitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dripping+to+Jetting+Transitions+in+Coflowing+Liquid+Streams%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Dripping to Jetting Transitions in Coflowing Liquid Streams.</a> Physical Review Letters. 99, (2007).</li>
<li>Chabert, M., Viovy, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+high-throughput+encapsulation+and+hydrodynamic+self-sorting+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic high-throughput encapsulation and hydrodynamic self-sorting of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 3191-3196 (2008).</li>
<li>Segrí, G., Silberberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Particle+Displacements+in+Poiseuille+Flow+of+Suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Radial Particle Displacements in Poiseuille Flow of Suspensions.</a> Nature. 189, 209-210 (1961).</li>
<li>Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Inertial microfluidics.</a> Lab on a chip. 9, 3038-3046 (2009).</li>
<li>Carlo, D. D. i, Edd, J., Humphry, K., Stone, H., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+Segregation+and+Dynamics+in+Confined+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Particle Segregation and Dynamics in Confined Flows.</a> Physical Review Letters. 102, (2009).</li>
<li>Humphry, K. J., Kulkarni, P. M., Weitz, D. A., Morris, J. F., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+and+lateral+particle+ordering+in+finite+Reynolds+number+channel+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+of+Fluids%22%5BJournal%5D)">Axial and lateral particle ordering in finite Reynolds number channel flows.</a> Physics of Fluids. 22, 081703(2010).</li>
<li>Lee, W., Amini, H., Stone, H. A., Carlo, D. D. i <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+self-assembly+and+control+of+microfluidic+particle+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dynamic self-assembly and control of microfluidic particle crystals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22413(2010).</li>
<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+microfluidic+systems+in+poly%28dimethylsiloxane%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of microfluidic systems in poly(dimethylsiloxane.</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li>
<li>Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+Device+Fabrication+and+Surface+Modification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">PDMS Device Fabrication and Surface Modification.</a> J. Vis. Exp. (8), e319(2007).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab on a chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Hatch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab on a chip. , 3838-3845 (2011).</li>
<li>Holtze, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biocompatible+surfactants+for+water-in-fluorocarbon+emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Biocompatible surfactants for water-in-fluorocarbon emulsions.</a> Lab on a chip. 8, 1632-1639 (2008).</li>
<li>Garstecki, P., Stone, H., Whitesides, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+for+Flow-Rate+Controlled+Breakup+in+Confined+Geometries%3A+A+Route+to+Monodisperse+Emulsions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Mechanism for Flow-Rate Controlled Breakup in Confined Geometries: A Route to Monodisperse Emulsions.</a> Physical Review Letters. 94, (2005).</li>
<li>Garstecki, P., Fuerstman, M. J., Stone, H. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+droplets+and+bubbles+in+a+microfluidic+T-junction-scaling+and+mechanism+of+break-up%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Formation of droplets and bubbles in a microfluidic T-junction-scaling and mechanism of break-up.</a> Lab on a chip. 6, 437-446 (2006).</li>
<li>Nie, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsification+in+a+microfluidic+flow-focusing+device%3A+effect+of+the+viscosities+of+the+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluidics+and+Nanofluidics%22%5BJournal%5D)">Emulsification in a microfluidic flow-focusing device: effect of the viscosities of the liquids.</a> Microfluidics and Nanofluidics. , (2008).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Chow, W. Y., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorosurfactants+for+microdroplets%3A+interfacial+tension+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+colloid+and+interface+science%22%5BJournal%5D)">Fluorosurfactants for microdroplets: interfacial tension analysis.</a> Journal of colloid and interface science. 350, 205-211 (2010).</li>
<li>Holt, D. J., Payne, R. J., Abell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+novel+fluorous+surfactants+for+microdroplet+stabilisation+in+fluorous+oil+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Fluorine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Synthesis of novel fluorous surfactants for microdroplet stabilisation in fluorous oil streams.</a> Journal of Fluorine Chemistry. 131, 398-407 (2010).</li>
<li>Hatch, A. C., Fisher, J. S., Pentoney, S. L., Yang, D. L., Lee, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+3D+droplet+self-assembly+for+ultra-high-density+digital+micro-reactor+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Tunable 3D droplet self-assembly for ultra-high-density digital micro-reactor arrays.</a> Lab on a chip. 11, 2509-2517 (2011).</li>
<li>Baret, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactants+in+droplet-based+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Surfactants in droplet-based microfluidics.</a> Lab on a chip. 12, 422-433 (2012).</li>
</ol>

JE é um inventor em uma patente pendente baseado na tecnologia utilizada neste manuscrito.

Apesar graus relativamente elevados de ordenação, nem todos os gotas conterá o número apropriado de partículas ou células. Eficiência de encapsulação pode ser calculada como o número de células ou partículas que ficam encapsulados em gotas com a ocupação desejado dividido pelo seu número total. Estes dados em bruto pode ser obtido quer a partir de um algoritmo de vídeo de alta velocidade automático ou de imagiologia de uma amostra de emulsão recolhida. Isto pode ser comparado com a fracção de partículas de ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome do reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> AutoCAD </td><td> AutoDesk </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Máscara de transparência </td><td> Fineline Imaging Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SU-8 Photoresist </td><td> Microchem </td><td> 2050 </td><td></td></tr><tr><td> Profilometer Dektak </td><td> Veeco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Placa de Petri </td><td> BD Falcon </td><td> 351058 </td><td></td></tr><tr><td> PDMS Kit Elastômero de Silicone </td><td> A Dow Corning Corp </td><td> Sylgard 184, número de material (240) 4019862 </td><td></td></tr><tr><td> Exsicador de vácuo </td><td> Jencons </td><td> 250-030 </td><td></td></tr><tr><td> Bomba de vácuo </td><td> Alcatel Vacuum Technology </td><td> 2010 C2 </td><td></td></tr><tr><td> Regulador de vácuo </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-00910-10 </td><td></td></tr><tr><td> Forno </td><td> Thermo Scientific </td><td> Lindberg Blue M, OV800F </td><td></td></tr><tr><td> Biópsia com punch, 0,75 mm </td><td> Harris </td><td> Uni-Core 15072 </td><td></td></tr><tr><td> Laboratório de Corona Treater </td><td> Electro-Technic Products Inc. </td><td> BD-20AC, SKU 12051A </td><td></td></tr><tr><td> Lâminas de vidro </td><td> Gold Seal </td><td> 3010 </td><td></td></tr><tr><td> Aquapel </td><td> PPG Industries </td><td></td><td> Estratégia Alternativa </td></tr><tr><td> Microesferas de poliestireno, 9,9 mM </td><td> Thermo </td><td> G1000 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> OptiPrep </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D1556 </td><td> Não demonstraram </td></tr><tr><td> Luer-Lok Seringas </td><td> BD </td><td> 1 mL: 309,628 3 mL: 309,585 </td><td></td></tr><tr><td> FC-40 Óleo Fluorocarbon </td><td> 3M Inc. </td><td> Sigma Aldrich, F9755 </td><td></td></tr><tr><td> PFPE-PEG fluorotensioactivo </td><td> Raindance Technologies </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Óleo Mineral Luz </td><td> Processos Químicos PTI </td><td> 08042-47-5 </td><td> Estratégia Alternativa </td></tr><tr><td> Surfactante Óleo Mineral </td><td> Evonik Goldschmidt Corporação </td><td> ABIL EM 90 </td><td> Estratégia Alternativa </td></tr><tr><td> Tygon Tubing PVC </td><td> SmallParts </td><td> TGY-010 </td><td></td></tr><tr><td> Calibre 30 Luer-Lok Seringa Agulha, 1/2 &quot; </td><td> SmallParts </td><td> NE-301PL-C </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Carl Zeiss imagem </td><td> Axio Observer.Z1 </td><td></td></tr><tr><td> Câmera de alta velocidade </td><td> Vision Research </td><td> Fantasma V310 </td><td></td></tr><tr><td> Bombas de seringa (2) </td><td> Chemyx Inc. </td><td> Nexus 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Óleo de silicone </td><td> A Dow Corning </td><td> 200 de fluido, a 10 cSt </td><td> Opcional para armazenamento de emulsão </td></tr></tbody></table>

alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células micro-encapsulamento

High Throughput Single-cell and Multiple-cell Micro-encapsulation

Métodos de encapsulação microfluídica já foram utilizados anteriormente para capturar células em gotas aquosas monodispersas na escala de picolitros, proporcionando confinamento a partir de um ambiente fluido em volume, com aplicações em triagem de alto rendimento, citometria e espectrometria de massas. Descrevemos um método para não apenas encapsular células individuais, mas também capturar repetidamente um número determinado de células (aqui demonstramos encapsulação de uma e duas células) a fim de estudar tanto o isolamento quanto as interações entre células em grupos de tamanhos controlados. Ao combinar técnicas de geração de gotas com ordenação de células e partículas, demonstramos a encapsulação controlada de partículas de tamanho celular para uma encapsulação eficiente e contínua. Utilizando uma suspensão aquosa de partículas e óleo de fluorocarbono imiscível, geramos gotas aquosas em óleo com um bico de focagem de fluxo. A taxa de fluxo aquoso é suficientemente alta para criar o ordenamento de partículas que alcançam o bico em frequências múltiplas inteiras da frequência de geração de gotas, encapsulando um número controlado de células em cada gota. Para resultados representativos, partículas de poliestireno de 9,9 μm são utilizadas como substitutas de células. Este estudo mostra uma eficiência de encapsulação de partícula única Pk=1 de 83,7% e uma eficiência de encapsulação de dupla partícula Pk=2 de 79,5%, comparadas às respectivas eficiências de Poisson de 39,3% e 33,3%. Demonstra-se que a concentração constante de células e partículas é de grande importância para uma encapsulação eficiente, e as transições de gotejamento para jato também são abordadas.
Introdução 
Suspendões celulares aquosas em meio contínuo compartilham um ambiente fluido comum que permite interações paralelas entre células e também homogeneiza os efeitos de células específicas nas medições realizadas no meio. O encapsulamento em alto rendimento de células em gotículas na escala de picolitros confina as amostras, protegendo-as contra contaminação cruzada, permitindo uma avaliação da diversidade celular dentro das amostras, evitando a diluição de reagentes e biomarcadores expressos e amplificando sinais provenientes de produtos de biorreatores. As gotículas também possibilitam a reunião novamente de gotículas em amostras aquosas maiores ou com outras gotículas, para estudos de sinalização intercelular.1,2 A redução na diluição implica sinais de detecção mais fortes, permitindo medições com maior precisão, além da possibilidade de reduzir volumes de amostras e reagentes, potencialmente onerosos.3 O encapsulamento de células em gotículas tem sido utilizado para aprimorar a detecção de expressão proteica,4 anticorpos,5,6 enzimas,7 e atividade metabólica8 em triagens de alto rendimento, e poderia ser empregado para melhorar a citometria de alto rendimento.9 Estudos adicionais apresentam aplicações na bioeletrosspraya de gotículas contendo células para espectrometria de massas10 e revestimentos celulares superficiais direcionados.11 Algumas aplicações, contudo, têm sido limitadas pela incapacidade de controlar o número de células encapsuladas nas gotículas. Aqui apresentamos um método de encapsulamento ordenado12 que aumenta as eficiências de encapsulamento demonstradas para uma e duas células e que pode ser extrapolado para o encapsulamento de um número maior de células.
Para obter a geração de gotas monodispersas, a técnica microfluídica de "focalização de fluxo" permite a criação de gotas de tamanho controlável de um fluido (uma mistura aquosa de células) dentro de outro (uma fase contínua de óleo) por meio de um bico no qual os fluxos convergem.13 Para uma geometria de bico específica, a frequência de geração de gotas f e o tamanho das gotas podem ser alterados ajustando-se as taxas de fluxo do óleo e da fase aquosa Qoil e Qaq. À medida que as taxas de fluxo aumentam, os fluxos podem transitar da geração de gotas para a ejeção instável do fluido aquoso a partir do bico.14
Quando a solução aquosa contém partículas suspensas, as partículas ficam encapsuladas e isoladas umas das outras no bico. Para a geração de gotas usando uma suspensão celular aquosa distribuída aleatoriamente, a fração média de gotas Dk contendo k células é determinada pelas estatísticas de Poisson, onde Dk = λk exp(-λ)/(k!) e λ é o número médio de células por gota. A fração de células que acabam nas gotas encapsuladas "corretamente" é calculada usando Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). A diferença sutil entre as duas métricas é que Dk está relacionada ao aproveitamento do fluido aquoso e à quantidade de separação de gotas que deve ser realizada após o encapsulamento, enquanto Pk está relacionada ao aproveitamento da amostra celular. Como exemplo, poder-se-ia usar uma suspensão celular diluída (baixo λ) para encapsular gotas nas quais a maioria das gotas contendo células teria apenas uma célula. Embora a métrica de eficiência Pk fosse alta, a maioria das gotas estaria vazia (baixo Dk), exigindo, portanto, um mecanismo de separação para remover as gotas vazias, o que também reduziria a produtividade.15
A combinação da geração de gotas com ordenamento inercial permite encapsular gotas com números mais previsíveis de células por gota e maiores produtividades do que o encapsulamento aleatório. A focalização inercial foi descoberta inicialmente por Segre e Silberberg16 e refere-se à tendência de partículas de tamanho finito migrarem para posições laterais de equilíbrio em escoamentos em canal. O ordenamento inercial refere-se à tendência das partículas e células se organizarem passivamente em fileiras igualmente espaçadas, escalonadas e com velocidade constante. Tanto a focalização quanto o ordenamento exigem taxas de fluxo suficientemente altas (alto número de Reynolds) e tamanhos de partículas elevados (alto número de Reynolds da partícula)17,18. Aqui, o número de Reynolds Re =uDh/ν e o número de Reynolds da partícula Rep =Re(a/Dh)2, onde u é uma velocidade característica do fluxo, Dh [=2wh/(w+h)] é o diâmetro hidráulico, ν é a viscosidade cinemática, a é o diâmetro da partícula, w é a largura do canal e h é a altura do canal. Empiricamente, o comprimento necessário para atingir fileiras totalmente ordenadas diminui com o aumento de Re e Rep. Observe que os requisitos de altos valores de Re e Rep (nesta pesquisa da ordem de 5 e 0,5, respectivamente) podem conflitar com a necessidade de manter baixas as taxas de fluxo aquoso para evitar a formação de jatos na ponteira de geração de gotas. Além disso, altas taxas de fluxo provocam maiores tensões de cisalhamento nas células, as quais não são abordadas neste protocolo. O estudo prévio de encapsulamento ordenado demonstrou que mais de 90% das células HL60 encapsuladas individualmente, sob condições de fluxo semelhantes às deste estudo, mantiveram a integridade da membrana celular12. Contudo, o efeito da magnitude e das escalas de tempo das tensões de cisalhamento precisará ser cuidadosamente considerado ao extrapolar para diferentes tipos celulares e parâmetros de fluxo. A sobreposição das restrições de ordenamento celular, geração de gotas e viabilidade celular em relação à taxa de fluxo aquoso fornece um regime operacional ideal para o encapsulamento controlado de uma ou múltiplas células.
Como pouquíssimos estudos abordam o espaçamento entre trens de partículas,19,20 a determinação desse espaçamento é mais facilmente realizada de forma empírica e dependerá da geometria do canal, da taxa de fluxo, do tamanho das partículas e da concentração das partículas. Apesar disso, o espaçamento lateral igual entre os trens implica que as células chegam em intervalos de tempo previsíveis e consistentes. Quando a geração de gotas ocorre na mesma taxa com que as células ordenadas chegam ao bico, as células são encapsuladas dentro das gotas de maneira controlada. Essa técnica tem sido utilizada para encapsular células individuais com produtividades da ordem de 15 kHz,12 uma melhoria significativa em comparação com estudos anteriores que relataram taxas de encapsulação da ordem de 60–160 Hz.4,15 No trabalho de encapsulação controlada, mais de 80% das gotas continham uma e apenas uma célula, uma melhoria significativa em eficiência em relação à estatística de Poisson (aleatória), que prevê menos de 40% de eficiência em média.12
Em trabalhos anteriores de encapsulação controlada,12 o número médio de partículas por gota λ foi ajustado para proporcionar encapsulação de célula única. Hipotetizamos que, mediante o ajuste das taxas de fluxo, podemos encapsular eficientemente qualquer número de células por gota quando λ é igual ou próximo ao número desejado de células por gota. Embora a encapsulação de célula única seja valiosa para determinar as respostas individuais das células a estímulos, a encapsulação de múltiplas células fornece informações relacionadas à interação entre números e tipos controlados de células. Aqui apresentamos um protocolo, resultados representativos utilizando microesferas de poliestireno e discussão sobre a encapsulação controlada de múltiplas células usando um canal passivo de ordenação inercial e um bico gerador de gotas.

Combinando monodispersos geração gota com ordenação de inércia de células e partículas, nós descrevemos um método para encapsular um número desejado de células ou partículas em uma única gota a taxas kHz. Nós demonstramos a eficiência duas vezes superiores às de encapsulamento desordenada para gotas simples e dupla-partícula.

Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento

Métodos de encapsulamento microfluídico têm sido utilizados anteriormente para capturar células em gotas aquosas monodispersas em escala de picolitros, proporcionando confinamento...

Aplicações que utilizam células encapsuladas em pequenas gotas de tamanho picolitro frequentemente foram limitadas pela incapacidade de controlar o número de células por gota. Este protocolo demonstra um método para controlar o encapsulamento celular combinando dois fenômenos microfluídicos distintos: o ordenamento hidrodinâmico de células e a geração de gotas em uma microbocarra de foco de fluxo. Em um canal a montante, fornece-se uma taxa de fluxo suficientemente alta de solução aquosa com células ou partículas suspensas para provocar a formação de trens com espaçamento igual na direção do fluxo a jusante.Uma ponteira de geração de gotas por focalização de fluxo é utilizada para formar gotas aquosas a taxas de quilohertz em um fluido de óleo imiscível estabilizado por surfactante. Em seguida, os trens ordenados de partículas celulares são combinados com a geração de gotas mediante o ajuste das vazões dos fluxos aquoso e oleoso para fornecer taxas de geração de gotas sincronizadas com a chegada de células ou partículas ordenadas longitudinalmente à ponteira de geração de gotas, utilizando-se partículas como substitutas das células. Para demonstrar este protocolo, as vazões devem s

high-throughput-single-cell-and-multiple-cell-micro-encapsulation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Nós desenvolvemos uma cultura de células automatizado e uma plataforma de interrogação para experiências de estimulação de células micro-escala. A plataforma oferece um controle simples, versátil e preciso para cultivar e estimular pequenas populações de células e recuperar lisados ​​para análises moleculares. A plataforma é bem adequado para os estudos que utilizam células preciosos e / ou reagentes.

A plataforma automatizada versátil para experiências de estimulação Micro escala celulares

Aqui, apresentamos um protocolo para isolar e cultivar células únicas com uma plataforma microfluídica, que utiliza um novo conceito de design de micropoços para permitir o isolamento de célula única de alta eficiência e cultura clonal de longo prazo.

Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Sequenciamento de célula única revela a heterogeneidade genotípica em sistemas biológicos, mas as tecnologias atuais não têm a produtividade necessária para a criação de perfil profundo de função e composição da Comunidade. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho microfluidic para sequenciamento &gt; 50.000 monocelulares genomas de diversas populações de células.

Uma plataforma Microfluidic de ultra alta taxa de transferência para o sequenciamento do genoma de célula única

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Apresentado aqui é um protocolo para o uso de alginato como polímero na microencapsulação de células imortalizadas para entrega a longo prazo de biológicos aos olhos de roedores.

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Este relatório descreve um método chip-baseado microfluídicos para estabelecer uma única experiência da cultura da pilha em que o emparelhamento de alta eficiência e a análise microscópica de pilhas únicas múltiplas podem ser conseguidos.

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