Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento

As aplicações que utilizam células encapsuladas em pequenas gotas de tamanho de picolitros têm sido frequentemente limitadas pela incapacidade de controlar o número de células por gota. Este protocolo demonstra um método para controlar o encapsulamento celular combinando dois fenômenos microfluídicos distintos, ordenação de células dinâmica de fluidos e geração de gotas em um microbico de foco de fluxo. Em um canal a montante, uma taxa de fluxo suficientemente alta de solução aquosa com células ou partículas suspensas é fornecida para causar a formação de trens com espaçamento igual na direção do fluxo a jusante.

Um bico de geração de gotas com foco de fluxo é usado para formar gotas aquosas a taxas de quilohertz em um fluido transportador de óleo admissível estabilizado com surfactante. Os trens de partículas celulares ordenados são então combinados com a geração de gotas, ajustando as taxas de fluxo aquoso e de óleo para fornecer taxas de geração de gotas que são sincronizadas com a chegada de células ou partículas ordenadas longitudinalmente no bico de geração de gotas, enquanto as partículas são usadas como substitutos celulares. Para demonstrar este protocolo, as taxas de fluxo devem ser suficientemente pequenas para limitar o fluido.

Tensões absolutas nas células biológicas, a sobreposição da geração de gotas de ordenação celular e a viabilidade celular. As restrições de taxa de fluxo aquoso fornecem um regime operacional ideal para encapsulamento controlado de células únicas e múltiplas. A análise dos dados de microscopia de vídeo mostra que as eficiências de encapsulamento de células ou partículas simples e duplas superam as eficiências de encapsulamento aleatório e reduzem muito o número de gotas, que não contêm o número desejado de células ou partículas.

O confinamento de células e gotas limita a diluição das secreções celulares, destaca a heterogeneidade celular e também controla os sinais intercelulares quando comparado a uma suspensão em massa. Meios eficientes para encapsular essas células em gotas fornecem uma ferramenta valiosa para pesquisadores biológicos Para iniciar este procedimento. Projete um padrão de microcanal como mostrado nesta figura no software AutoCAD.

A seção de canal longo representa o canal de ordenação de fluxo aquoso com uma largura de 27 mícrons. O esquema do bico ampliado mostra larguras de canal iguais de 27 mícrons para o canal de pedido aquoso e o canal de óleo, seguido pela contração do bico de 22 mícrons e expansão repentina para um canal mais amplo de 61 mícrons. A altura do dispositivo é de 52 mícrons.

Tanto as entradas aquosas quanto as de óleo têm grandes filtros de detritos com folgas na ordem da largura do canal de pedido, conforme ilustrado por este esquema ampliado da entrada de óleo. Mostrado. Aqui está uma imagem verdadeira do canal de pedido e do bico injetado com corante. Contrate um fabricante terceirizado para imprimir uma máscara de transparência de alta resolução em filme Mylar ou quartzo onde os canais são transparentes em um fundo escuro.

Posteriormente, crie um mestre fotorresistente de silício e SU oito para moldagem de réplica. Cole o molde mestre no fundo de uma placa de Petri para moldagem de réplica PDMS. Depois que a moldagem da réplica estiver concluída e o contorno do dispositivo tiver sido cortado, use um punção de biópsia de diâmetro externo de 0,75 milímetro para perfurar as portas fluídicas nas três regiões redondas mostradas nesta figura uma fita adesiva querida no lado do padrão do PDMS e descasque para remover qualquer poeira após a ligação do plasma.

O PDMS para uma lâmina de microscópio de vidro limpa. Coloque todo o dispositivo em um forno e aqueça o forno gradualmente até 120 graus Celsius. Deixe o dispositivo no forno a 120 graus Celsius durante a noite para completar a colagem e retornar o PDMS ao seu estado hidrofóbico original.

Um método alternativo para tornar a superfície de vidro do canal hidrofóbica é injetar um revestimento como aqua nas portas fluídicas e, em seguida, purgar com ar. Usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de seringa, aspire várias centenas de microlitros de ar, seguido por uma pequena quantidade de aquil suficiente para encher apenas a seringa de metal Dica com cuidado, mas injete firmemente o aqua seguido pelo ar de purga nas portas fluídicas. Sem quebrar o PDMS para a ligação do vidro agressivamente.

Repita a purga de ar em todas as portas de entrada e saída enquanto limpa o excesso de água para evitar depósitos que possam entupir os canais após a secagem. Controlar a concentração celular é essencial para atingir o número adequado de células para o número adequado de gotas. Isso tem dois componentes desafiadores.

A primeira é estimar a concentração adequada de antemão e a segunda é manter essa concentração durante o experimento Para o dispositivo específico usado neste estudo, células ou partículas de oito a 15 mícrons devem solicitar adequadamente o encapsulamento controlado. Nesta demonstração, microesferas diárias de polis de 9,9 mícrons serão usadas como substitutos celulares para preparar a concentração de suspensão de partículas aquosas para obter o encapsulamento de auditoria ideal, começando com uma concentração de estoque de microesferas de 1% de sólidos em peso usando dados anteriores para ordenação completa. Como guia, aumente a concentração para 1,5% de sólidos por meio de uma centrífuga suave de um mililitro da amostra de estoque, removendo 250 microlitros de líquido supinado e Resus suspendendo as partículas por mistura de vórtice ou mistura mais suave.

Ao usar células, tanto as células quanto as partículas de poliestireno têm uma gravidade específica maior que um, embora não seja mostrada neste vídeo. Para experimentos de longo prazo com duração de muitos minutos a horas, a solução pode ser combinada com a flutuabilidade pela adição de um soluto, como cloreto de cálcio para partículas ou opti prep para células. Depois que a suspensão da célula ou partícula estiver pronta, prepare uma amostra de 10 mililitros da fase contínua de óleo de fluorocarbono em um vórtice de tubo de centrífuga de 15 mililitros.

Misture o surfactante e o óleo de fluorocarbono até aproximadamente 2,5% de peso em peso. Aqui obtemos uma mistura de 2,4 peso em peso, o que é aceitável para configurar o experimento de microencapsulação. Primeiro, ligue a energia do microscópio óptico invertido e da câmera de alta velocidade.

Concentre-se na camada de microcanal e inspecione os canais em busca de entupimentos e quaisquer detritos que possam se desalojar. Selecione um canal livre de detritos grandes ou obstruções óbvias. Corte três pedaços de tubo de PVC tigon translúcido para a entrada aquosa, entrada de óleo e saída de emulsão para minimizar o volume morto.

Corte apenas o tubo suficiente para alcançar as bombas de seringa ao microscópio. Corte de estágio nas extremidades do tubo em um ângulo de 45 graus Para facilitar a inserção nas portas fluídicas, use uma pinça para encaixar as extremidades do tubo nas portas fluídicas. Em seguida, pressione uma agulha de seringa de aço inoxidável de ponta romba de calibre 30 na extremidade livre do tubo de entrada aquoso.

Repita para o tubo de entrada de óleo. Mova o dispositivo e conecte o tubo ao microscópio stage usando uma objetiva de 20 vezes alinhar e focar no bocal do dispositivo. Ajuste manualmente o microscópio para iluminação Kohler para fornecer iluminação ideal no plano focal.

Usando o corte do software da câmera de alta velocidade, o campo de visão ao redor do bico para permitir taxas de quadros mais altas e, em seguida, defina a taxa de quadros, o tempo de exposição e outras configurações da câmera conforme necessário para uma gravação ideal. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com a solução de fase aquosa bem misturada previamente preparada. Encha uma seringa de três mililitros com a solução da fase oleosa.

Incline uma das seringas cheias verticalmente e agite para mover as bolhas de ar para a saída da seringa. Pressione lentamente o êmbolo por tempo suficiente para empurrar o ar para a ponta da seringa segurando a seringa verticalmente. Conecte a seringa à respectiva agulha de seringa já conectada ao dispositivo.

Pressione o êmbolo para forçar o ar através do volume morto da agulha da seringa até que o fluido seja empurrado através do tubo quase até o dispositivo, monte firmemente a seringa em uma bomba de seringa e engate o bloco do êmbolo. Repita as conexões para a segunda seringa e monte-a em uma segunda bomba de seringa, ligue cada bomba de seringa e programe cada bomba. Usando os protocolos do fabricante, defina as taxas de fluxo iniciais para 50 microlitros por minuto para a fase oleosa e cinco microlitros por minuto.

Para o início da fase aquosa, as bombas esperam que cada fluido entre no dispositivo e preencha os canais expulsando o ar morto restante. Isso pode levar vários minutos usando as taxas de fluxo iniciais. Observe a formação de gotas no bico.

Aumente lentamente a taxa de fluxo aquoso para observar a ordenação das partículas no longo canal de solução aquosa. Como a taxa de fluxo aumenta, não aumente a taxa de fluxo até o ponto em que o jato do fluxo de fluido aquoso é acionado no bico, conforme mostrado neste exemplo, usando uma nota de bico de geração de gota diferente, o fluxo instável e a queda inconsistente estão aqui. Se a concentração de partículas for muito baixa para fornecer trens alternados com relativamente poucas partículas ausentes e a amostra não tiver correspondência de flutuabilidade, incline fisicamente a bomba da seringa em direção à saída da seringa para fornecer sedimentação gradual das partículas em direção às saídas da seringa.

Assim que ocorrer o pedido adequado, ajuste a taxa de fluxo de óleo para ajustar a frequência de geração e o tamanho das gotas. Ajuste iterativamente ambas as taxas de fluxo para atingir as taxas de encapsulamento e os volumes de queda desejados. Assim que o encapsulamento ordenado estável for confirmado, mova a tubulação de saída do reservatório de resíduos para um reservatório de coleta para uso futuro.

O encapsulamento de partículas simples e duplas ou células pode ser alcançado com alta eficiência. A utilização deste protocolo mostrado aqui é um resultado representativo do encapsulamento de partícula única com uma taxa de fluxo de óleo de 60 microlitros por minuto e uma taxa de fluxo aquoso de nove microlitros por minuto. Lambda, o número médio de partículas para queda é 0,95.

O espaçamento entre partículas na direção do fluxo é de cerca de 17 a 18 mícrons para partículas alternadas totalmente ordenadas. A taxa de geração de gotas neste exemplo é de 6,1 kilohertz com um tamanho médio de gota de 24,4 picolitros. O histograma compara a eficiência da partícula de encapsulamento de gota da ordem de encapsulamento de partícula única com mais.

Nas estatísticas, o encapsulamento aleatório para um tamanho de amostra de 517 gotas, a fração média de gotas contendo uma partícula é de 79,5% em oposição a uma fração de encapsulamento aleatório prevista de 36,7% A fração de partículas que acabam nas gotas corretamente encapsuladas foi observada como sendo de 83,7% para um tamanho de amostra de 491 partículas, enquanto a fração de encapsulamento aleatório foi de 37,3%O encapsulamento de partículas duplas é obtido simplesmente reduzindo a taxa de fluxo de óleo para 30 microlitros por minuto, mantendo a taxa de fluxo aquoso em nove microlitros por minuto. Aqui lambda, o número médio de partículas por gota é 1,8. Semelhante ao encapsulamento de partícula única.

O espaçamento entre partículas na direção do fluxo é de cerca de 17 a 18 mícrons para partículas alternadas totalmente ordenadas. As gotas maiores têm um tamanho médio de gota de 39,8 picolitros e se formaram a uma taxa de 3,8 kilohertz em comparação com o encapsulamento aleatório. Para um tamanho de amostra de 383 gotas, a fração média de gotas de encapsulamento ordenadas contendo duas partículas é de 71,5% em oposição a uma fração de encapsulamento aleatória prevista de 26,8% A fração de partículas que tendeu para cima nas gotas corretamente encapsuladas foi observada como sendo de 79,5% para um tamanho de amostra de 689 partículas, enquanto a fração de encapsulamento aleatória foi de 33,4% Tomada.

Juntos, esses resultados mostram que as eficiências de encapsulamento de partículas simples e duplas superam as eficiências de encapsulamento aleatório em mais de um fator de dois e reduzem bastante o número de gotas, que não contêm o número desejado de células ou partículas. A importância de concentrações adequadas de partículas ou células para alta eficiência de encapsulamento é ilustrada nesta execução experimental. Embora as taxas de fluxo aquoso e de óleo sejam as mesmas da execução de encapsulamento de partícula dupla mostrada anteriormente, o número médio de células por gota lambda é reduzido para 1,57.

Consequentemente, a ordenação completa não ocorre e, portanto, surgem buracos nos trens, deixando gotas de sol com menos partículas do que o previsto. Este histograma mostra a diminuição da eficiência para o encapsulamento de duas partículas devido ao menor valor de Lambda. Para um tamanho de amostra de 324 gotas, a fração média de gotas contendo duas partículas foi de 55,9% com quase tantas gotas de partícula única quanto gotas de partícula dupla.

Isso indica que Lambda deve ser igual ou próximo ao número de células desejadas por gota para maximizar partículas ou células encapsuladas corretamente com o valor exato de lambda escolhido, de acordo com se menos ou mais células por gota são toleráveis. Nesta demonstração, exploramos as incompatibilidades de flutuabilidade para permitir o controle em tempo real da concentração durante o experimento. No entanto, para experimentos de longo prazo, pode ser aconselhável combinar a flutuabilidade para obter resultados mais consistentes após o encapsulamento das células em gotas aquosas.

Experimentos dependentes do tempo podem ser realizados em um tubo de centrífuga ou sob um microscópio, reinjetando as gotas em matrizes microfluídicas.