Alta taxa de transferência de célula única e múltipla de células Micro-encapsulamento

Aplicações que utilizam células encapsuladas em pequenas gotas de tamanho picolitro frequentemente foram limitadas pela incapacidade de controlar o número de células por gota. Este protocolo demonstra um método para controlar o encapsulamento celular combinando dois fenômenos microfluídicos distintos: o ordenamento hidrodinâmico de células e a geração de gotas em uma microbocuia com focagem de fluxo. Em um canal a montante, fornece-se uma taxa de fluxo suficientemente alta de solução aquosa contendo células ou partículas suspensas, de modo a provocar a formação de trens com espaçamento igual na direção do fluxo a jusante.

Utiliza-se um bico gerador de gotas por focalização de fluxo para formar gotas aquosas a taxas de quilohertz em um fluido de transporte oleoso admissível estabilizado por surfactante. Em seguida, os trens ordenados de partículas celulares são combinados com a geração de gotas mediante o ajuste das vazões dos fluxos aquoso e oleoso, de modo a obter taxas de geração de gotas sincronizadas com a chegada de células ou partículas ordenadas longitudinalmente ao bico gerador de gotas, utilizando-se partículas como substitutas das células. Para demonstrar este protocolo, as vazões devem ser suficientemente pequenas para limitar o fluido.

Tensões de cisalhamento em células biológicas, a sobreposição da ordenação celular, a geração de gotículas e a viabilidade celular. As restrições na taxa de fluxo aquoso fornecem um regime operacional ideal para o encapsulamento controlado de uma ou múltiplas células. A análise de dados de microscopia em vídeo mostra que as eficiências de encapsulamento de uma única célula ou de duas células ou partículas superam as eficiências de encapsulamento aleatório e reduzem significativamente o número de gotículas que não contêm o número desejado de células ou partículas.

O confinamento de células e gotículas limita a diluição das secreções celulares, evidencia a heterogeneidade celular e também controla os sinais intercelulares quando comparado a uma suspensão em massa. Meios eficientes para encapsular essas células em gotículas fornecem uma ferramenta valiosa para pesquisadores biológicos. Para iniciar este procedimento, projete um padrão de microcanal conforme mostrado nesta figura no software AutoCAD.

A seção do canal longo representa o canal de ordenamento de fluxo aquoso com uma largura de 27 micrômetros. O esquema ampliado do bico mostra larguras iguais de canal de 27 micrômetros para o canal de ordenamento aquoso e o canal de óleo, seguido pela contração do bico de 22 micrômetros e expansão súbita para um canal mais largo de 61 micrômetros. A altura do dispositivo é de 52 micrômetros.

As entradas para a fase aquosa e para o óleo possuem filtros grandes para detritos, com aberturas da ordem da largura do canal de ordenação, conforme ilustrado neste esquema ampliado da entrada de óleo. Abaixo, uma imagem real do canal de ordenação e do bico injetados com corante. Utilize um fabricante terceirizado para imprimir uma máscara de transparência de alta resolução em filme de Mylar ou quartzo, na qual os canais são transparentes sobre um fundo escuro.

Posteriormente, crie um molde mestre de silício e fotoresina SU-8 para moldagem por replica. Fixe o molde mestre no fundo de uma placa de Petri para a moldagem por replica de PDMS. Após a conclusão da moldagem por replica e o recorte do contorno do dispositivo, utilize um furador de biópsia com diâmetro externo de 0,75 mm para perfurar as portas fluidicas nas três regiões circulares mostradas nesta figura. Aplique fita adesiva transparente no lado com o padrão do PDMS e puxe para remover qualquer poeira após a ligação por plasma.

O PDMS para uma lâmina de microscópio de vidro limpa. Coloque todo o dispositivo em um forno e aqueça o forno gradualmente até 120 graus Celsius. Deixe o dispositivo no forno a 120 graus Celsius durante a noite para completar a ligação e para que o PDMS retorne ao seu estado hidrofóbico original.

Um método alternativo para tornar a superfície de vidro do canal hidrofóbica é injetar um revestimento, como aquae, nas portas fluidicas e, em seguida, purgar com ar. Usando uma seringa de um mililitro e uma agulha de seringa, aspire algumas centenas de microlitros de ar, seguidos por uma pequena quantidade de aquil, suficiente apenas para preencher cuidadosamente a ponta metálica da seringa. Em seguida, injete firmemente a aqua, seguida pelo ar de purgação, nas portas fluidicas, sem romper agressivamente a ligação entre PDMS e vidro.

Repita a purga de ar em todas as portas de entrada e saída, limpando qualquer excesso de água para evitar depósitos que possam entupir os canais durante a secagem. Controlar a concentração celular é essencial para obter o número adequado de células em relação ao número adequado de gotas. Isso possui dois componentes desafiadores.

O primeiro é estimar a concentração adequada previamente, e o segundo é manter essa concentração durante o experimento. Para o dispositivo específico utilizado neste estudo, células ou partículas de oito a 15 mícrons devem se ordenar adequadamente para uma encapsulação controlada. Nesta demonstração, microesferas poliméricas de 9,9 mícrons serão usadas como substitutos celulares para preparar a concentração da suspensão aquosa de partículas, a fim de alcançar uma encapsulação ideal. Comece com uma concentração estoque de microesferas de 1% em peso de sólidos, utilizando dados anteriores para ordenação completa. Como orientação, aumente a concentração para 1,5% em peso de sólidos por meio da centrifugação suave de um mililitro da amostra estoque, removendo 250 microlitros do líquido sobrenadante e ressuspendendo as partículas por agitação em vórtex ou mistura mais suave.

Ao utilizar células, tanto as células quanto as partículas de poliestireno possuem densidade específica maior que um, embora isso não seja mostrado neste vídeo. Para experimentos de longa duração, que duram da ordem de vários minutos a horas, a solução pode ser ajustada para equivalência de flutuabilidade pela adição de um soluto como cloreto de cálcio para partículas ou OptiPrep para células. Após a suspensão de células ou partículas estar pronta, prepare uma amostra de 10 mililitros da fase contínua de óleo fluorocarbonado em um tubo cônico de 15 mililitros utilizando vórtex.

Misture o surfactante e o óleo de fluorocarbono até aproximadamente 2,5% peso em peso. Aqui obtemos uma mistura de 2,4% peso em peso, o que é aceitável para montar o experimento de microencapsulação. Primeiro, ligue a alimentação do microscópio óptico invertido e da câmera de alta velocidade.

Foque na camada de microcanais e inspecione os canais quanto a entupimentos e qualquer detrito que possa se soltar. Selecione um canal livre de detritos grandes ou entupimentos evidentes. Corte três comprimentos de tubo de PVC translúcido tigon para a entrada aquosa, entrada de óleo e saída da emulsão, a fim de minimizar o volume morto.

Corte uma quantidade de tubo suficiente para alcançar do bomba de seringa até o microscópio. Corte as extremidades dos tubos em um ângulo de 45 graus para facilitar a inserção nos portos fluidicos; use pinças para encaixar firmemente as pontas dos tubos nos portos fluidicos. Em seguida, encaixe firmemente uma agulha de seringa de aço inoxidável com ponta cega de calibre 30 na extremidade livre do tubo de entrada aquosa.

Repita para o tubo de entrada de óleo. Mova o dispositivo e fixe a tubulação ao estágio do microscópio usando uma objetiva de 20 vezes, alinhando e focalizando no bico do dispositivo. Ajuste manualmente o microscópio para iluminação de Köhler, proporcionando iluminação ideal no plano focal.

Usando o recorte de software da câmera de alta velocidade, delimite o campo de visão ao redor do bico para permitir taxas de quadros mais altas e, em seguida, ajuste a taxa de quadros, o tempo de exposição e outras configurações da câmera conforme necessário para uma gravação ideal. Em seguida, preencha uma seringa de um mililitro com a solução aquosa previamente preparada e bem misturada. Preencha uma seringa de três mililitros com a solução da fase oleosa.

Coloque uma das seringas cheias na posição vertical e bata levemente para mover as bolhas de ar até a saída da seringa. Pressione lentamente o êmbolo por tempo suficiente para empurrar o ar até a ponta da seringa, mantendo-a na posição vertical. Conecte a seringa à agulha correspondente já fixada no dispositivo.

Pressione o êmbolo para forçar o ar através do volume morto da agulha da seringa até que o fluido seja empurrado pela tubulação, quase até o dispositivo; fixe a seringa firmemente a uma bomba de seringa e acople o bloco do êmbolo. Repita as conexões para a segunda seringa e fixe-a a uma segunda bomba de seringa. Ligue cada bomba de seringa e programe cada uma delas. Utilizando os protocolos do fabricante, defina as taxas de fluxo iniciais em 50 microlitros por minuto para a fase oleosa e cinco microlitros por minuto.

Para o início com a fase aquosa, as bombas aguardam a entrada de cada fluido no dispositivo e o preenchimento dos canais, expulsando o ar morto remanescente. Isso pode levar vários minutos utilizando as taxas de fluxo iniciais. Observe a formação de gotas no bico.

Aumente lentamente a taxa de fluxo aquoso para observar o ordenamento das partículas no longo canal da solução aquosa. À medida que a taxa de fluxo aumenta, não a eleve até o ponto em que ocorra o jato do fluxo de fluido aquoso na saída do bico, como mostrado neste exemplo, utilizando um bico diferente de geração de gotas; observe que o fluxo instável e as gotas inconsistentes estão presentes aqui. Se a concentração de partículas for muito baixa para fornecer trens alternados com relativamente poucas partículas ausentes e a amostra não tiver sido ajustada para equivalência de flutuabilidade, incline fisicamente a bomba de seringa em direção à saída da seringa para promover a sedimentação gradual das partículas em direção às saídas da seringa.

Uma vez que a ordenação adequada ocorra, ajuste a taxa de fluxo do óleo para regular a frequência de geração e o tamanho das gotas. Ajuste iterativamente ambas as taxas de fluxo para obter as taxas de encapsulação e volumes de gotas desejados. Após a confirmação de encapsulação ordenada estável, transfira o tubo de saída do reservatório de descarte para um reservatório de coleta para uso futuro.

A encapsulação de partículas ou células únicas e duplas pode ser alcançada com alta eficiência. Utilizando este protocolo apresentado aqui, obtém-se um resultado representativo de encapsulação de partículas únicas com uma taxa de fluxo de óleo de 60 microlitros por minuto e uma taxa de fluxo aquoso de nove microlitros por minuto. Lambda, o número médio de partículas por gota, é 0,95.

O espaçamento entre partículas na direção do fluxo é de cerca de 17 a 18 mícrons para partículas alternadas totalmente ordenadas. A taxa de geração de gotas neste exemplo é de 6,1 quilohertz, com um tamanho médio de gota de 24,4 picolitros. O histograma compara a eficiência de encapsulação de partículas em gotas em ordem de encapsulação única de partículas com mais.

Em termos estatísticos, para um tamanho de amostra de 517 gotas, a fração média de gotas contendo uma partícula é de 79,5%, em contraste com uma fração prevista de encapsulamento aleatório de 36,7%. Observou-se que a fração de partículas que acabam nas gotas corretamente encapsuladas foi de 83,7% para um tamanho de amostra de 491 partículas, enquanto a fração de encapsulamento aleatório foi de 37,3%. O encapsulamento de partículas duplas é alcançado simplesmente reduzindo a taxa de fluxo de óleo para 30 microlitros por minuto, mantendo a taxa de fluxo aquoso em nove microlitros por minuto. Aqui, lambda, o número médio de partículas por gota, é 1,8, semelhante ao encapsulamento de partículas únicas.

O espaçamento entre partículas na direção do fluxo é de cerca de 17 a 18 mícrons para partículas alternadas totalmente ordenadas. As gotas maiores possuem um tamanho médio de 39,8 picolitros e foram formadas a uma taxa de 3,8 quilohertz em comparação com a encapsulação aleatória. Para um tamanho de amostra de 383 gotas, a fração média de gotas com encapsulação ordenada contendo duas partículas é de 71,5%, em oposição a uma fração prevista de encapsulação aleatória de 26,8%. A fração de partículas que acabaram nas gotas corretamente encapsuladas foi observada como sendo de 79,5% para um tamanho de amostra de 689 partículas, enquanto a fração de encapsulação aleatória foi de 33,4%. Considerado.

Em conjunto, esses resultados mostram que as eficiências de encapsulação de partículas únicas e duplas superam as eficiências de encapsulação aleatória por um fator superior a dois e reduzem significativamente o número de gotas que não contêm o número desejado de células ou partículas. A importância de concentrações adequadas de partículas ou células para uma alta eficiência de encapsulação é ilustrada nesta execução experimental. Embora as vazões de óleo e de fase aquosa sejam as mesmas da execução de encapsulação de partículas duplas mostrada anteriormente, o número médio de células por gota lambda é reduzido para 1,57.

Consequentemente, a ordenação completa não ocorre, e, portanto, surgem lacunas nos trens, deixando gotas com menos partículas do que o esperado. Este histograma mostra a eficiência reduzida para encapsulamento de duas partículas devido ao valor mais baixo de Lambda. Para um tamanho de amostra de 324 gotas, a fração média de gotas contendo duas partículas foi de 55,9%, com quase tantas gotas com partícula única quanto gotas com duas partículas.

Isso indica que Lambda deve ser igual ou próximo ao número de células desejadas por gota para maximizar as partículas ou células corretamente encapsuladas, com o valor exato de lambda escolhido conforme a tolerância a menos ou mais células por gota. Nesta demonstração, exploramos diferenças de flutuabilidade para permitir o controle em tempo real da concentração durante o experimento. No entanto, para experimentos de longa duração, pode ser aconselhável equalizar a flutuabilidade para obter resultados mais consistentes após o encapsulamento de células em gotas aquosas.

Experimentos dependentes do tempo podem ser realizados em tubo de centrífuga ou sob microscópio, reinjetando as gotas em arranjos microfluídicos.