Calcificação das células do músculo vascular liso e de imagem da aorta calcificação e inflamação

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a calcificação vascular aórtica ex vivo e modelar a calcificação vascular in vivo utilizando células musculares lisas aórticas murinas primárias cultivadas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais na área da biologia das doenças vasculares, fornecendo um modelo in vitro para estudar os mecanismos moleculares da calcificação vascular e permitindo a avaliação da calcificação vascular e da inflamação por macrófagos in vivo. A principal vantagem desta técnica é que ela permite a quantificação sensível e a co-localização da atividade de macrófagos com depósitos de cálcio em lesões ateroscleróticas, mesmo em estágios iniciais da doença.

Além de Caitlin e de mim, demonstrará este procedimento Robert Tainsh, um técnico em nosso laboratório. Para iniciar este procedimento, desinfete a cauda com um cotonete de álcool e localize as veias da cauda na região lateral. Em seguida, aplique uma leve pressão para frente na seringa enquanto uma agulha de calibre 30 é avançada para dentro da cauda sem oferecer resistência.

Em seguida, injete 100 microlitros de cálcio NIR e/ou 100 microlitros de cathepsina NIR em uma taxa constante. Retire a agulha após cinco segundos e colete as aortas entre três e 24 horas após a injeção. Sob um microscópio estereoscópico, remova o peritônio para expor os órgãos abdominais.

Posteriormente, remova os órgãos gastrointestinais tomando cuidado para não seccionar a aorta. Em seguida, faça uma incisão lateral no diafragma anterior e continue a incisão ao longo do abdômen. Usando tesoura de dissecação, libere a caixa torácica cortando pelos lados das costelas e removendo o tecido mole aderente à porção superior do esterno.

Em seguida, remova a caixa torácica e exponha os pulmões. Com cuidado, retire os pulmões. A seguir, remova a traqueia e o esôfago com cuidado, garantindo que a aorta permaneça intacta.

Posteriormente, remova o tecido mole ao redor da aorta, da bifurcação ilíaca até o arco aórtico. Tenha cuidado ao remover a gordura peri-aórtica. Em seguida, remova a gordura remanescente e o tecido mole ao redor da aorta torácica e dos grandes ramos do arco aórtico.

Em seguida, remova o timo. Agora, remova o coração da cavidade torácica, destacando-o cuidadosamente da aorta proximal. Em seguida, seccione a aorta distal na bifurcação ilíaca.

Usando uma agulha de insulina, injete solução salina normal na aorta a partir do arco aórtico para lavar as células sanguíneas remanescentes. Retire a aorta juntamente com os vasos do arco aórtico e remova-a completamente do corpo. Coloque a aorta em solução salina normal sobre gelo até o momento da imagem.

Neste passo, coloque as aortas em HBSS frio até que as dissecações estejam concluídas. Em uma câmara de cultura tecidual estéril, transfira as aortas para a solução de digestão aórtica nos recipientes de cultura tecidual de 35 × 10 milímetros. Em seguida, incube-as a 37 °C por 30 minutos com agitação intermitente suave.

Após a digestão, as aortas devem apresentar aparência esticada ou desfiada. Sob um microscópio de dissecação, remova a camada adventícia externa de uma aorta mantendo a camada média intacta. Para tanto, desprenda a camada externa da aorta em uma extremidade e remova-a da camada média subjacente como se fosse uma meia.

Após a remoção da camada adventícia, incubar o aorta remanescente em uma nova placa de cultura com meio de cultura celular a 37 graus Celsius por duas a quatro horas. Em seguida, cortar a aorta em anéis com largura de um a dois milímetros. Transferir os anéis para uma nova placa de cultura de tecidos com solução de digestão aórtica e incubar a 37 graus Celsius com agitação intermitente suave por 120 minutos.

Durante a incubação, pipete a solução para cima e para baixo várias vezes para ressuspender as células. Em seguida, adicione cinco mililitros de meio de cultura celular aquecido à solução de digestão e transfira para um tubo cônico de 15 mililitros. Centrifugue o tubo por cinco minutos a 200 G. Em seguida, aspire o meio e ressuspender as células no volume desejado de meio de cultura celular.

Para induzir a calcificação em células musculares lisas vasculares, transfira as células para uma placa de cultura de seis poços e permita que aderem. Em seguida, substitua o meio por meio de calcificação. Incube as células a 37 graus Celsius por pelo menos sete dias.

Em seguida, aspire o meio da placa de cultura celular. Lave as células uma vez com água ionizada. Fixe as células colocando-as em um mililitro de formalina 10% à temperatura ambiente por 20 minutos.

Em seguida, remova o formaldeído e lave as células fixadas com água destilada durante cinco minutos. Incube então as células em um mililitro de solução a 5% de nitrato de prata sob uma lâmpada de 60 a 100 watts por uma a duas horas. Posteriormente, aspire a solução de nitrato de prata e lave com água destilada por cinco minutos.

Após cinco minutos, remova a prata não reagida colocando as células em um mililitro de solução a 5% de tiossulfato de sódio em água destilada durante cinco minutos. Em seguida, enxágue as células com água destilada por cinco minutos. As células coradas com von Kossa estão agora prontas para serem visualizadas por microscopia óptica invertida convencional.

Nesta figura, camundongos selvagens knockout para MGP e camundongos knockout para LDLR foram injetados com NIR de cálcio e NIR de catepsina por injeção na veia caudal, e as aortas foram coletadas 24 horas depois e analisadas por imagem de fluorescência no infravermelho. Camundongos selvagens exibem praticamente nenhuma calcificação aórtica ou presença de macrófagos. As aortas de camundongos knockout para LDLR apresentam calcificação extensa que co-localiza com o acúmulo de macrófagos.

Em contraste, camundongos knockout para MGP apresentam calcificação aórtica que ocorre na ausência de infiltração de macrófagos. Neste experimento, células musculares lisas vasculares (VSMCs) aórticas cultivadas foram isoladas de camundongos knockout para MGP e infectadas com adenovírus expressando GFP ou MGP. VSMCs aórticas isoladas de camundongos selvagens foram transfectadas com siRNA controle aleatório ou siRNA direcionado ao MGP.

As células foram cultivadas em meio de calcificação A por sete dias e, posteriormente, fixadas e coradas com von Kossa. A coloração de cálcio foi quantificada utilizando o software ImageJ após a subtração do fundo. Após seu desenvolvimento, essas técnicas permitiram aos cientistas obter imagens da aterosclerose e da calcificação vascular ex vivo.

E para modelar a calcificação vascular in vitro. Isso abre a possibilidade de testar os efeitos de novos tratamentos medicamentosos sobre doenças vasculares. Após assistir a este vídeo, você deverá compreender bem como isolar aortas em células primárias de músculo liso vascular aórtico de camundongos, visualizar placas ateroscleróticas utilizando sondas de imagem fluorescente no infravermelho próximo e músculos lisos vasculares calcificados in vitro.