Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade
25 de julho de 2016
As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).
O objetivo geral deste procedimento é descrever o desenvolvimento de um modelo organotípico tridimensional multicerular da mucosa intestinal humana cultivado sob microgravidade fornecida por biorreatores de vaso com parede rotatória. Este método possui um amplo potencial como ferramenta para descobertas tanto na saúde quanto na doença, incluindo interações com patógenos, tráfego de antígenos e processos inflamatórios.
As principais vantagens desta técnica são a imitação da diversidade fenotípica do gato e o uso de biorreatores de vaso D-12 que permitem uma difusão eficiente de nutrientes e oxigênio. Comece desparafusando a tampa do orifício de enchimento do vaso de cultura e adicionando 50 mililitros do nosso PMI. Uma vez que o vaso esteja cheio, recoloque a tampa e limpe qualquer meio derramado com etanol a 70%.
Deixe o vaso em incubação por pelo menos 15 minutos até a noite toda à temperatura ambiente. Quando estiver pronto para continuar, use o orifício de enchimento para descartar o meio de cultura e adicione 30 mililitros do meio de cultura 3-D ao vaso. Substitua a tampa no orifício de enchimento e, novamente, limpe qualquer derramamento de meio com etanol a 70%.
Retire os frascos quase confluentes contendo células endoteliais de veia umbilical humana e fibroblastos colônicos humanos do incubador e lave-os duas vezes com PBS. Em seguida, desprenda as células cobrindo-as com uma solução de tripsina a 0,25% contendo EDTA a 0,05%. Assim que as células se desprenderem, colete-as em um tubo de 50 mililitros pré-carregado com 30 mililitros de DMEM contendo 30% de FBS.
Centrifugue o tubo por 10 minutos para formar o pellet celular. Em seguida, re-suspenda as células em 30 mililitros de DMEM contendo 30% de FBS. A seguir, dilua 20 microlitros das células re-suspensas com 20 microlitros de corante azul de tripano.
Carregue o hemocitômetro com a mistura de células e conte a concentração de células viáveis. Em seguida, re-suspenda cada tipo celular em 50 a 80 milhões de células por mililitro em DMEM contendo 30% de FBS. Primeiro, coloque o número apropriado de insertos de cultura nos poços de uma placa de seis poços.
Em seguida, prepare a mistura de colágeno adicionando primeiro DMEM 10x, Meio de Reconstituição 10x, L-glutamina 200 milimolar e FBS inativado pelo calor a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione colágeno bovino tipo um, laminina, colágeno tipo quatro, fibronectina, proteoglicano de sulfato de heparina e, por fim, adicione hidróxido de sódio para neutralizar o pH da solução. Se em algum momento a mistura apresentar coloração amarelada e aspecto ácido, adicione algumas gotas de hidróxido de sódio estéril 1 normal para neutralizar a mistura.
Feche o tubo e misture a solução invertendo-o várias vezes, evitando a formação de bolhas. Quando não estiver misturando, mantenha a solução em gelo para evitar sua polimerização. Após a mistura, adicione as suspensões celulares à preparação de colágeno e misture os tubos invertendo-os suavemente várias vezes para evitar a form ação de bolhas.
Em seguida, coloque-os novamente sobre o gelo. Adicione de quatro a cinco mililitros da solução de colágeno contendo células em cada inserto e deixe o colágeno formar gel na câmara de fluxo laminar com pouca ou nenhuma movimentação por uma hora. Após uma hora, transfira a placa de seis poços para uma incubadora por mais uma a duas horas adicionais.
Em seguida, retorne a placa para a câmara de cultura de tecidos e utilize uma pinça estéril e um bisturi para cortar assépticamente a membrana do inserto. Desprenda o gel contendo as células da membrana e, em seguida, corte o gel destacado em pequenos quadrados. Adicione os pequenos quadrados de colágeno contendo células a um dos frascos de 50 mililitros previamente preenchidos, utilizando a porta de enchimento.
Em seguida, prepare uma suspensão de células epiteliais humanas HCT-8 conforme descrito no protocolo textual complementar. Re-suspenda as células numa concentração de 10 milhões de células por mililitro em DMEM contendo 30% de soro bovino fetal (FBS). Em seguida, adicione um mililitro da suspensão de células HCT-8 ao recipiente de 50 mililitros utilizando sua porta de enchimento.
Após adicionar as células, acrescente mais 20 mililitros de meio de cultura 3-D ao recipiente, de modo que ele fique quase cheio. Substitua a tampa e umedeça a borda do orifício de enchimento com etanol 70%. Em seguida, coloque uma seringa de cinco mililitros contendo de três a quatro mililitros de meio de cultura 3-D em uma das portas do recipiente e uma seringa vazia de cinco mililitros na outra porta.
Remova todas as bolhas visíveis puxando para dentro da seringa vazia, enquanto aproximadamente o mesmo volume de meio é injetado pela outra seringa no vaso. Com todo o ar agora removido, coloque os vasos no biorreator, ligue a energia e ajuste a velocidade em 13 a 14 rotações por minuto. Ajuste a velocidade conforme necessário para evitar que as células entrem em contato com as paredes do vaso.
Cultive as células sob microgravidade e troque o meio de cultura a cada três a quatro dias. Para trocar os meios, utilize o método de seringa dupla para substituir aproximadamente 30 mililitros do meio usado por meio de cultura 3-D fresco. Após três a cinco dias em cultura, isole as células mononucleares do sangue periférico conforme descrito no protocolo de texto associado.
Em seguida, remova o vaso do biorreator e adicione aproximadamente 20 milhões de células constituídas por linfócitos e monócitos aos vasos através da porta de enchimento. Coloque os vasos de volta no biorreator e cultive por mais quatro a seis dias. Por volta do nono dia de cultivo, adicione mais 20 milhões de células constituídas por linfócitos e monócitos ao vaso e continue os cultivos por até 12 dias adicionais.
No final do experimento, utilize uma pipeta de transferência para colher cada fragmento pequeno do gel, agora chamado de constructo, e coloque-os nos poços de uma placa de seis poços contendo 10 mililitros de tampão de formalina a 10%. Fixe os constructos por três horas à temperatura ambiente e, em seguida, prossiga com protocolos padrão de inclusão histológica, corte e coloração. Os métodos apresentados neste vídeo produzem um modelo organotípico tridimensional multicerular da mucosa intestinal humana.
Em cultura sob microgravidade, as células tornam-se bem diferenciadas e formam estruturas ordenadas, semelhantes a vilosidades, até o dia 20. Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em seis horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar-se de seguir as boas práticas de cultura celular.
É fundamental controlar sistematicamente as células quanto à viabilidade, contaminação por micoplasma e alterações no comportamento de crescimento celular. Após este procedimento, outros métodos, como imunohistoquímica, podem ser realizados para identificar marcadores de linhagem e diferenciação celular. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como desenvolver um modelo organotípico tridimensional multicitário da mucosa intestinal humana cultivado sob microgravidade.
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Visão Geral
Este artigo descreve o desenvolvimento de um modelo organotípico tridimensional multicitular da mucosa intestinal humana cultivado sob microgravidade utilizando biorreatores de parede rotatória (RWV). Essa abordagem inovadora melhora o cultivo celular em comparação com os métodos tradicionais bidimensionais.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Microgravidade
Contexto
- Modelos de cultivo celular tridimensionais imitam melhor as condições in vivo.
- Ambientes de microgravidade podem influenciar o comportamento celular e as interações.
- Os biorreatores de parede rotatória facilitam a difusão de nutrientes e oxigênio.
- Compreender a mucosa intestinal é fundamental para a pesquisa em saúde e doenças.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo organotípico tridimensional da mucosa intestinal humana.
- Explorar interações celulares em um ambiente de microgravidade.
- Fornecer uma plataforma para o estudo de mecanismos de saúde e doença.
Métodos Utilizados
- Utilização de biorreatores de vaso com parede rotatória para cultivo celular.
- Preparação de um modelo multicelular para simular a mucosa intestinal.
- Avaliação de interações e respostas celulares.
- Avaliação da eficiência da difusão de nutrientes e oxigênio.
Resultados Principais
- O modelo 3D imitou com sucesso a diversidade fenotípica das células intestinais.
- As condições de microgravidade influenciaram o comportamento e as interações celulares.
- O modelo demonstrou potencial para o estudo das interações com patógenos e processos inflamatórios.
- Uma difusão eficiente de nutrientes e oxigênio foi alcançada na configuração do biorreator.
Conclusões
- O modelo desenvolvido representa um avanço significativo na tecnologia de cultivo celular.
- Oferece novas perspectivas sobre a saúde intestinal e os mecanismos das doenças.
- Essa abordagem pode ser uma ferramenta valiosa para pesquisas biomédicas futuras.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo organotípico tridimensional multicitular da mucosa intestinal humana cultivado sob microgravidade fornece um sistema fisiologicamente relevante para o estudo de interações entre hospedeiro e patógeno, tráfego de antígenos e processos inflamatórios. Ao imitar a arquitetura tecidual e a diversidade celular in vivo, o modelo aumenta a confiança preditiva na validação pré-clínica de alvos e na redução de riscos mecanicistas. Ele sustenta a continuidade translacional desde a descoberta até as fases pré-clínicas, permitindo avaliação reprodutível e quantitativa das respostas da mucosa em um sistema relevante para doenças.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas envolvendo interações epitélio-imunes em um modelo humano multicelular da mucosa intestinal.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos ao manter estruturas diferenciadas, semelhantes a vilosidades, sob condições de microgravidade.
- Valor Preditivo: Reduz a ambiguidade mecanicista na seleção precoce de alvos ao modelar a complexidade da mucosa humana.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para triagem subsequente de compostos que afetam a função de barreira ou modulação imunológica.
- Valor Operacional: Garante padronização e reprodutibilidade do ensaio por meio de cultivo em microgravidade controlada e razões definidas de semeadura celular.
- Escalabilidade: Permite a reutilização da plataforma em múltiplas execuções experimentais com formação consistente de constructos até o dia 20.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Relevância Translacional: Modela a mucosa intestinal humana com componentes epiteliais, endoteliais, fibroblastos e linfócitos para estudos relevantes a doenças.
- Continuidade Pré-clínica: Permite decisões de avanço com ajuste de risco ao possibilitar cultivos longitudinais de até 30 dias com características fenotípicas estáveis.
- Redução de Riscos Mecanísticos: Permite a avaliação de processos inflamatórios e interações com patógenos em um sistema controlado derivado de humanos.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra ao continuum de descoberta, desde a validação inicial do alvo até a modelagem pré-clínica, especialmente para pipelines voltados à gastroenterologia e imunologia.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre respostas imunes mucosas e integridade epitelial em um sistema tridimensional relevante para humanos.
- Triagem: Fornece resultados quantitativos por meio de análises histológicas e imunohistoquímicas após fixação e seccionamento do constructo.
- Análises: Permite a comparação da localização celular, marcadores de diferenciação e organização estrutural entre diferentes condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas iniciais à validação pré-clínica por meio do cultivo prolongado de constructos multicelulares.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma padronizada e rotativa baseada em biorreatores, aplicável a múltiplos modelos de doenças intestinais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva por meio da diversificação fenotípica e da morfogênese semelhante a vilosidades sob microgravidade.
- Valor Operacional: Padronização por meio do semeadura celular definida, gelificação do colágeno e controle da velocidade do biorreator (13–14 rpm).
- Valor Estratégico: Melhoria nas decisões de prosseguir ou interromper projetos, reduzindo o risco de falhas em estágios avançados devido à seleção inadequada de alvos mucosos.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de candidatos com base em seus efeitos em um modelo intestinal complexo e derivado de humanos.
Considerações sobre a Implementação
- Requer experiência em isolamento de células primárias, preparação de géis tridimensionais e operação de biorreatores.
- Depende de biorreatores de parede rotatória (HARV/STLV) e manipulação estéril de fluidos livres de bolhas.
- Necessita padronização entre equipes para a origem das células, mistura de colágeno e cronogramas de troca de meio.
- As considerações de adaptação incluem o escalonamento de tipos celulares e proporções para diferentes regiões mucosas ou estados patológicos.
- As limitações práticas incluem longos períodos de cultivo (até 30 dias) e sensibilidade ao estresse de cisalhamento se a velocidade do biorreator não for adequadamente ajustada.
