Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade
July 25th, 2016
As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).
O objetivo geral deste procedimento é descrever o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivada sob microgravidade fornecida por biorreatores de vasos de parede rotativa. Este método tem um amplo potencial como ferramenta de descoberta tanto na saúde quanto na doença. Incluindo interações com patógenos, tráfego de antígenos e processos inflamatórios.
As principais vantagens desta técnica são a mimetização da diversidade fenotípica do gato e o uso dos biorreatores de vasos D-12 que permitem a difusão eficiente de nutrientes e oxigênio. Comece desparafusando a tampa da porta de enchimento do recipiente de cultura e adicionando 50 mililitros de nosso PMI. Quando o recipiente estiver cheio, recoloque a tampa e limpe qualquer meio derramado com etanol a 70%.
Deixe o recipiente incubar por pelo menos 15 minutos durante a noite em temperatura ambiente. Quando estiver pronto para continuar, use a porta de enchimento para descartar o meio de cultura e adicione 30 mililitros do meio de cultura 3D ao recipiente. Recoloque a tampa na porta de enchimento e, novamente, limpe qualquer meio derramado com etanol a 70%.
Remova frascos confluentes próximos contendo células endoteliais da veia umbilical humana e fibroblastos colônicos humanos da incubadora e lave-os duas vezes com PBS. Em seguida, retire as células cobrindo-as com uma solução de tripsina a 0,25% com EDTA a 0,05% de tripsina. Assim que as células se desprenderem, colete-as em um tubo de 50 mililitros pré-carregado com 30 mililitros de DMEM contendo 30% de FBS.
Centrifugue o tubo por 10 minutos para pellet as células. Em seguida, ressuspenda as células em 30 mililitros de DMEM contendo 30% de FBS. Em seguida, dilua 20 microlitros das células ressuspensas com 20 microlitros de corante azul de tripano.
Carregue o hemocitômetro com a mistura de células e conte a concentração de células viáveis. Em seguida, ressuspenda cada tipo de célula em 50 a 80 milhões de células por mililitro em DMEM contendo 30% de FBS. Primeiro, coloque o número apropriado de inserções de cultura nos poços de uma placa de seis poços.
Em seguida, prepare a mistura de colágeno adicionando primeiro 10x DMEM, 10x Reconstitution Media, 200 milimolar L-glutamina e FBS inativado por calor a um tubo cônico de 50 mililitros. Em seguida, adicione colágeno bovino tipo um, laminina, colágeno tipo quatro, fibronectina, proteoglicano de sulfato de heparina e, finalmente, adicione hidróxido de sódio para neutralizar o pH da solução. Se a qualquer momento a mistura desenvolver uma aparência ácida de cor amarelada, adicione algumas gotas de hidróxido de sódio normal 1 estéril para neutralizar a mistura.
Feche o tubo e misture a solução invertendo-a várias vezes, evitando a formação de bolhas. Quando não estiver misturando, mantenha a solução no gelo para evitar que ela polimerize. Uma vez misturado, adicione as suspensões celulares à preparação de colágeno e misture os tubos invertendo suavemente os tubos várias vezes para evitar a formação de bolhas.
Em seguida, coloque-os de volta no gelo. Adicione quatro a cinco mililitros da célula contendo solução de colágeno em cada inserção e deixe o colágeno gelificar no capuz com pouco ou nenhum movimento por uma hora. Após uma hora, transfira a placa de seis poços para uma incubadora por mais uma a duas horas.
Em seguida, retorne a placa para a capa de cultura de tecidos e use uma pinça estéril e um bisturi para cortar assepticamente a membrana da inserção. Separe a célula contendo gel da membrana e, em seguida, corte o gel destacado em pequenos quadrados. Adicione a pequena célula contendo quadrados de colágeno em um dos vasos pré-preenchidos de 50 mililitros usando a porta de enchimento.
Em seguida, prepare uma suspensão de células epiteliais humanas HCT-8, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Ressuspenda as células a uma concentração de 10 milhões de células por mililitro em DMEM contendo 30% de FBS. Em seguida, adicione um mililitro da suspensão de células HCT-8 no recipiente de 50 mililitros usando sua porta de enchimento.
Depois de adicionar as células, adicione mais 20 mililitros de meio de cultura 3-D no recipiente para que fique quase cheio. Recoloque a tampa e molhe a borda da porta de enchimento com etanol 70%. Em seguida, coloque uma seringa de cinco mililitros contendo três a quatro mililitros de meio de cultura 3-D em uma porta do recipiente e uma seringa vazia de cinco mililitros na outra porta.
Remova quaisquer bolhas visíveis puxando para dentro da seringa vazia enquanto aproximadamente o mesmo volume de meio é injetado através da outra seringa no recipiente. Com todo o ar agora removido, coloque os vasos no biorreator, ligue a energia e ajuste a velocidade em 13 a 14 rotações por minuto. Ajuste a velocidade conforme necessário para evitar que as células entrem em contato com as paredes do vaso.
Cultive as células sob microgravidade e troque o meio de cultura a cada três ou quatro dias. Para trocar o meio, use o método de seringa dupla para substituir aproximadamente 30 mililitros do meio usado por meio de cultura 3D fresco. Após três a cinco dias em cultura, isolar as células mononucleares do sangue periférico conforme descrito no protocolo de texto que acompanha o documento.
Em seguida, remova o vaso do biorreator e adicione aproximadamente 20 milhões de células consistindo de linfócitos e monócitos aos vasos através da porta de enchimento. Coloque os vasos de volta no biorreator e cultive por mais quatro a seis dias. Por volta do nono dia da cultura, adicione mais 20 milhões de células consistindo de linfócitos e monócitos no vaso e continue as culturas por até 12 dias adicionais.
No final do experimento, use uma pipeta de transferência para colher cada pequeno fragmento de gel, agora chamado de construção, e coloque-os nos poços de uma placa de seis poços contendo 10 mililitros de tampão formalina a 10%. Fixe as construções por três horas em temperatura ambiente e, em seguida, prossiga com os protocolos histológicos padrão de incorporação, corte e coloração. Os métodos apresentados neste vídeo produzem um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana.
Na cultura de microgravidade, as células tornam-se bem diferenciadas e formam características ordenadas semelhantes a vilosidades no dia 20. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em seis horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de seguir boas diretrizes de cultura de células.
É crucial controlar sistematicamente as células quanto à viabilidade, contaminação por micoplasma e mudanças no comportamento de crescimento celular. Após esse procedimento, outros métodos como a imuno-histoquímica podem ser realizados para identificar marcadores de linhagem e diferenciação celular. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como desenvolver um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivada sob microgravidade.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visão Geral
Este artigo descreve o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivada sob microgravidade usando biorreatores de parede giratória (RWV). Esta abordagem inovadora melhora o cultivo celular em comparação com métodos tradicionais 2-D.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Microgravidade
Fundamentos
- Modelos de cultura celular 3-D imitam melhor as condições in vivo.
- Ambientes de microgravidade podem influenciar o comportamento celular e as interações.
- Biorreatores de parede giratória facilitam a difusão de nutrientes e oxigênio.
- Entender a mucosa intestinal é crucial para pesquisas em saúde e doenças.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo organotípico 3-D da mucosa intestinal humana.
- Explorar interações celulares em um ambiente de microgravidade.
- Fornecer uma plataforma para estudar mecanismos de saúde e doenças.
Métodos Utilizados
- Utilização de biorreatores de parede giratória para cultivo celular.
- Preparação de um modelo multicelular para simular a mucosa intestinal.
- Avaliação das interações e respostas celulares.
- Avaliação da eficiência de difusão de nutrientes e oxigênio.
Principais Resultados
- O modelo 3-D mimetizou com sucesso a diversidade fenotípica das células intestinais.
- As condições de microgravidade influenciaram o comportamento e as interações celulares.
- O modelo mostrou potencial para estudar interações com patógenos e processos inflamatórios.
- A difusão eficiente de nutrientes e oxigênio foi alcançada na configuração do biorreator.
Conclusões
- O modelo desenvolvido é um avanço significativo na tecnologia de cultivo celular.
- Oferece novos insights sobre os mecanismos de saúde e doenças intestinais.
- Esta abordagem pode ser uma ferramenta valiosa para futuras pesquisas biomédicas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa grown under microgravity provides a physiologically relevant system for studying host-pathogen interactions, antigen trafficking, and inflammatory processes. By mimicking in vivo tissue architecture and cellular diversity, the model enhances predictive confidence in preclinical target validation and mechanistic de-risking. It supports translational continuity from discovery through preclinical stages by enabling reproducible, quantitative assessment of mucosal responses in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses involving epithelial-immune interactions in a multicellular human intestinal mucosa model.
- Operational Value: Supports functional target validation by maintaining differentiated, villus-like structures under microgravity conditions.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity in early-stage target selection by modeling human mucosal complexity.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening of compounds affecting barrier function or immune modulation.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled microgravity culture and defined cell seeding ratios.
- Scalability: Enables platform reuse across multiple experimental runs with consistent construct formation by day 20.
Translational & Preclinical Research
- Translational Relevance: Models human intestinal mucosa with epithelial, endothelial, fibroblast, and lymphocyte components for disease-relevant studies.
- Preclinical Continuity: Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling longitudinal culture up to 30 days with stable phenotypic features.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of inflammatory processes and pathogen interactions in a controlled, human-derived system.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through preclinical modeling, particularly for gastrointestinal and immunology-focused pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of mucosal immune responses and epithelial integrity in a human-relevant 3-D system.
- Screening: Delivers quantitative outputs via histological and immunohistochemical readouts after construct fixation and sectioning.
- Analytics: Enables comparison of cellular localization, differentiation markers, and structural organization across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical validation through sustained culture of multicellular constructs.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, rotatable bioreactor-based platform applicable across multiple intestinal disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through phenotypic diversification and villus-like morphogenesis under microgravity.
- Operational Value: Standardization via defined cell seeding, collagen gelation, and bioreactor speed control (13–14 rpm).
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing late-stage failure risk from poor target selection in mucosal targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on effects in a complex, human-derived intestinal model.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation, 3-D gel preparation, and bioreactor operation.
- Dependence on rotating-wall-vessel bioreactors (HARV/STLV) and sterile, bubble-free fluid handling.
- Necessitates cross-team standardization for cell sourcing, collagen mixing, and medium change schedules.
- Adaptation considerations include scaling cell types and ratios for different mucosal regions or disease states.
- Practical limitations include extended culture timelines (up to 30 days) and sensitivity to shear stress if bioreactor speed is not properly adjusted.
