Name: Murino do tendão flexor lesão ea cirurgia de reparação (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Aprenda a realizar cirurgia de lesão e reparação do tendão flexor em camundongos para estudar processos celulares e moleculares da cicatrização. Este método identifica populações celulares envolvidas na formação de cicatrizes.

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Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Sociedade Americana de Cirurgia do Prêmio Pilot Mão e NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (a AEL) e NIAMS / NIH P30AR061307.

O Comité University em Pesquisa Animal da Universidade de Rochester aprovado todos os experimentos com animais. Dez-12 semanas de idade C57BL fêmea / 6J foram usadas. 1. Preparação de Animais para a cirurgia do tendão flexor (~ 15 min) <ol><li> instrumentos cirúrgicos autoclave para esterilizar, usar luvas estéreis por toda parte, e manter um campo de cirurgia estéril. </li><li> Anestesiar o rato através de injecção intraperitoneal (IP) com um volume de cetamina (80 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) correspondente ao peso do corpo. Confirmar profundidade de sedação através de ausência de reflexo toe-pitada. </li><li> Administrar analgesia preventiva (buprenorfina, 0,05-0,1 mg / kg) via injecção subcutânea. Aplicar pomada oftálmica para evitar que os olhos sequem. </li><li> Prepare o local da cirurgia grampeando a pele em toda a pata traseira. Esterilizar a pele por lavagem sequencial com iodo povidona, seguido por 70% de etanol, e novamente com iodo povidona. </li></ol><ol><li> Encontrar o tendão flexor longo dos dedos (FDL), visto superficialmente na face medial da panturrilha. Utilizando um bisturi, fazer uma pequena incisão 0,5-1 cm na pele com micro-tesouras para expor o tendão. </li><li> Use uma pinça para separar o tendão FDL do tecido circundante e segui-lo até a junção miotendínea. Cortar o tendão nesta junção com uma tesoura de mola para liberá-lo, tomando cuidado para evitar a artéria tibial posterior. </li><li> Feche a pele com 5-0 nylon. Nota: A transecção e reparação (passos 2.4) FDL deve ser efectuada utilizando um estereomicroscópio. </li><li> Faça uma incisão 3 milímetros sobre o aspecto póstero da pata traseira com molas micro-tesoura. Gentilmente retirar o tecido mole ao redor e músculo com uma pinça, tomando cuidado para minimizar danos nos tecidos, e identificar o tendão FDL. <ol><li> Delicadamente levantar o tendão FDL e transecto-lo completamente usando micro-tesoura. Suturar as extremidades do tendão FDL em conjunto num padrão de Kessler modificada com 8-0 suturas, evitando a secagem do tendão por molhar periodicamente com solução salina. </li><li> Substituir tecidos moles e músculos sobre o tendão, em seguida, fechar a incisão com 5-0 nylon. </li></ol></li><li> Coloque ratos sobre uma lâmina quente conjunto a 37 ° C, para manter a temperatura corporal até recuperado da anestesia. </li><li> Monitorar ratos pós-operatório para os sinais de deterioração ou infecção, incluindo o aumento da vocalização e de peles de babados. Injectar buprenorfina (50 ul / mouse) como analgésico a cada 12 horas até que os ratos não mostrar sinais de dor ou angústia. </li><li> Permitir que os ratos para curar por um período de 10 dias após a cirurgia, antes de continuar com as próximas etapas. Nota: As células podem ser colhidas em qualquer ponto de tempo de pós-cirurgia. Aqui, 10 dias são escolhidos para estas experiências representativas, dada a relativamente alta celularidade do tecido, neste momento. </li></ol> 3. Labeling de células em divisão (~ 10 min) <ol><li> Prepare EdU (5-etinil-2&#39;desoxiuridina) solução (10 mg / ml em tampão fosfato salino estéril [PBS] + 1% de dimetilsulfóxido [DMSO] para aumentar a solubilidade). </li><li> Injectar murganhos com 100 ul EdU (50 mg / kg) via injecção ip de 24 horas antes do sacrifício. </li></ol> 4. Células colheita para Citologia centrifugação (2,5 horas, ~ 30 min Hands-on Time) <ol><li> Prepare a 3 mg / ml de colagenase I em PBS. </li><li> Eutanásia rato através de asfixia com dióxido de carbono a uma taxa de fluxo de não mais de 3 L / min, e efectuar o deslocamento cervical como uma medida secundária. </li><li> Localize o tendão reparado usando o passo 2.4 acima, e isolar tecido do tendão pelo corte de cerca de 2 mm de cada lado do sítio de lesão com micro-tesouras. <ol><li> tecido tritura com escalpelo em uma placa de Petri com 1 ml de 3 mg / ml de colagenase, em seguida, passar mistura através de um 18 G agulha várias vezes para quebrar o tecido. Recolhe mistura para um tubo de centrífuga de 1,5 ml. </li&gt; <li> Digerir tecido do tendão durante 1 hora a 37 ° C com agitação. </li><li> Rotação tecido para baixo (300 xg durante 5 min), colagenase aspirado, em seguida, ressuspender as células / tecido com albumina de soro bovino a 500 ul de 3% (BSA) em PBS por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> suspensão de células do filtro através de um filtro de células 70 mm para remover detritos e pedaços grandes de tendão, e reserve em um 37 ° C incubadora. </li><li> Coloque tecido do tendão em outra 1,5 ml tubo de centrífuga, e refrescar-se com 1 ml de solução de colagenase, pipetando para cima e para baixo para misturar. </li><li> Incubar tecido mais uma hora a 37 ° C com agitação. </li><li> Girar tecido do tendão digerido (300 xg durante 5 min), em seguida ressuspender em 500 ul de 3% BSA em PBS por pipetagem para cima e para baixo várias vezes. </li><li> Filtro de suspensão de células através de um filtro de células 70 mm, combinam com suspensão isolado no 4.3.3, em seguida, contar as células com um hemocitómetro. </li><li> Lave as células uma vez mais com 3% de BSA em PBS, em seguida ressuspender a 6/3x 10 4/100 ul. </li></ol></li><li> Anexar um funil de citologia para um slide carregado positivamente e bloquear no suporte de slides. Inserir todo o aparelho numa centrífuga citologia e adicionar 100 ul de suspensão de células para o funil. Centrifuga-se a 300 xg durante 5 minutos para dispersar as células para a corrediça. </li></ol> 5. Imunocitoquï¿½ica para detectar EdU (2 h, ~ 45 min Hands-on Time) Nota: Todos os passos de incubação deve ser realizada no escuro para limitar a fotodegradação de fluoróforos. <ol><li> células de círculo com uma caneta barreira hidrofóbica para minimizar a solução necessária para as seguintes etapas, em seguida, fixar imediatamente com 150 ul de 3% de paraformaldeído em PBS, 15 min à temperatura ambiente (RT). <ol><li> Lavar duas vezes durante 5 min com 150 ul de BSA a 3% em PBS. </li><li> permeabilizar as células com 0,5% de Triton X-100 em PBS de 20 minutos à temperatura ambiente. </li><li> Repita o passo de lavagem como em 5.1.1. </li></ol></li><li> Prepare EdU cockt reaçãoAil de acordo com as instruções do kit de não mais do que 30 minutos antes da utilização. <ol><li> Adicionar 150 ul de coquetel para cada lâmina, incubar 30 min a RT. </li><li> Repita o passo de lavagem como em 5.1.1. </li></ol></li><li> Incubar com 150 ul de contraste nuclear Hoechst33342 diluído 1: 2000 em PBS 30 min à temperatura ambiente. <ol><li> Lavar duas vezes durante 5 min com 150 ul de PBS 1x. </li></ol></li><li> Adicionar 1-2 gotas de médio a células de montagem anti-fade, em seguida, lentamente lamela inferior para evitar bolhas. <ol><li> Permitir que o meio de montagem para curar durante a noite no escuro à temperatura ambiente. </li><li> Use unha polonês clara para selar a lamela ao slide. </li></ol></li><li> imagem desliza em 40X usando um microscópio de fluorescência equipado com filtros de excitação / emissão capazes de detectar DAPI (Hoeschst33342) e Texas Red (Alexa Fluor 594). </li></ol>

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</ol>

Os autores declaram que não têm interesses financeiros conflitantes

O procedimento cirúrgico para um modelo murino de transecção completa e reparação do flexor longo dos dedos tendão é apresentado neste estudo. Além disso, uma nova aplicação de concentrar populações de células pequenas com citologia centrífuga é demonstrada, permitindo a análise imunocitoquímica quantitativa do ambiente celular durante a cicatrização do tendão flexor. Este modelo de reparação do tendão flexor demonstra uma resposta de cura reprodutível, que pode ser utilizado para avaliar mudanças no processo de cura ut...

tendões flexores da mão de obra em conjunto com os músculos flexores do antebraço e bainhas digitais para permitir a flexão dos dígitos e função de agarrar a mão. tendões flexores executar ao longo do aspecto palmar da mão; este local relativamente superficial muitas vezes resulta em lesões nos tendões flexores durante um trauma para a mão. Tendões curar através de uma resposta do tecido da cicatriz em vez de regeneração do tecido do tendão normal de 1. Embora este tecido cicatricial dá continuidade ao tendão, função dramaticamente é diminuída em relação ao tendão saudável. Compósitos tecido do tendão-de cicatriz são caracterizados por propriedades mecânicas com deficiência 1, tornando os tendões reparados mais propensos à ruptura. Além disso, o tecido cicatricial não tem a organização da estrutura de fibra de colagénio de tendão nativa, resultando num aumento do tamanho do tendão e grandes quantidades. Dadas as limitações anatômicas do tendão-bainha, mesmo um modesto aumento no tamanho do tendão pode drasticamente vermelhoUCE a função de deslizamento do tendão, e, portanto, gama dígitos de movimento e função da mão. Antes de lesões década de 1960 para os tendões flexores, particularmente os da Zona II da mão, não foram rotineiramente reparado devido a complicações graves em cura que surgiram com esses reparos 2. Esta área da mão foi referido como &#39;terra de ninguém&#39; 3. No entanto, as melhorias nas técnicas cirúrgicas, padrões de sutura e protocolos de reabilitação de fisioterapia têm resultados do tendão flexor reparos 2 melhorou dramaticamente. Apesar destes avanços, até 40% das reparações resultar na formação de aderência suficiente para impedir a função da mão 4. Portanto, uma abordagem biológica é necessário para melhorar a cicatrização. Infelizmente, muito pouco se sabe sobre o processo de cicatrização do tendão no nível celular e molecular. Assim, o objectivo foi desenvolver um modelo murino que poderia ser usado para melhorar a understandin fundamentaisg dos componentes celulares e moleculares da cicatrização do tendão flexor e a resposta de formação de cicatrizes, como um meio para identificar novos alvos terapêuticos para melhorar a cicatrização. modelos animais maiores têm sido fundamentais para aprofundar a compreensão do processo de cicatrização do tendão flexor. Canino e coelho estudos demonstraram tanto a capacidade de cura intrínseca e extrínseca de tendões flexores 5,6, a importância de movimento passivo precoce controlada para minimizar a formação de aderência em relação à imobilização 7, bem como os efeitos de diferentes padrões de sutura sobre o processo de cura 8 , 9. Além disso, o modelo canino tem sido útil em testes de abordagens de engenharia de tecidos para melhorar a cicatrização de translação 10. No entanto, existem várias vantagens importantes na utilização de um modelo de murino em relação a um modelo animal de grande porte, incluindo o custo relativo, da disponibilidade de reagentes específicos de murino, e a facilidade de gerar KNOC mundialk-outs ou construções de deleção / superexpressão de tecidos específicos. Além disso, as semelhanças funcionais entre humanos e ratinhos com respeito aos tendões flexores 11 indicam a utilidade potencial no desenvolvimento de um modelo de murino. Desenvolvimento de um modelo murino de transecção do tendão flexor e reparação imita muitos aspectos da cura clínica, incluindo a formação de tecido cicatricial abundante e propriedades mecânicas prejudicada. O modelo descrito aqui não é uma verdadeira recapitulação da prática clínica devido à transecção do FDL na junção miotendínea, a fim de proteger o local de reparação. Além disso, este modelo não leva em conta a contribuição de células da bainha sinovial à resposta de cura, já que não há bainha sinovial que cobre a porção média do tendão onde o reparo ocorre. Apesar destas limitações, este modelo tem a vantagem de intervalo de geração de adesões de limitação de movimento, que ainda tem de ser demonstrada em modelos murinos que mais closEly aproximar o cenário clínico. Este modelo tem sido utilizado para avaliar knock-out modelos de ratinho 12,13, e para testar diferentes abordagens farmacológicas para melhorar a cicatrização 14-17. As análises histológicas deste modelo, usando imuno-histoquímica e hibridação in situ, pode fornecer informações importantes para a localização de genes-chave e proteínas durante a cura. No entanto, histologia fornece apenas uma análise espacial do corte transversal e não permite a quantificação ao longo de todo o tecido. A citometria de fluxo representa uma abordagem mais quantitativa, mas apenas um número muito limitado de células podem ser isoladas a partir do tecido de cicatrização do tendão no modelo de ratinho, e este número é ainda mais reduzida durante os passos de fixação, permeabilização e lavagem. Tendo isto em conta a, citometria de fluxo torna-se uma abordagem inviável devido ao número de animais que seria necessária. Um método alternativo é necessário para preservar a maioria desta população de células pequenas, a fimpara caracterizar ainda mais o meio de cura. O método utilizado para alcançar este objetivo, mostrado aqui, envolve a concentração das células isoladas através de centrifugação citologia numa lâmina de vidro, seguido por imunocitoquímica. No presente estudo EdU (5-etinil-2&#39;desoxiuridina, um análogo da timidina) incorporação e rotulagem subsequente foi usada para determinar o estado proliferativo relativa de células no local de cicatrização. Esta abordagem pode ser aplicada para testar a eficácia dos tratamentos farmacológicos sobre a proliferação celular, o gene de knock-out ou sobre-expressão, ou para identificar e quantificar as populações de células diferentes.

<table><tbody><tr><td><forte>Preparação cirúrgica</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camundongos C57BL/6J&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Cetamina</td><td>Hospira</td><td>NDC # 0409-2051-05</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Lloyd Inc.</td><td>NDC # 61311-482-10</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Par Pharmaceutical Inc.</td><td>NDC# 42023-179-10</td><td></td></tr><tr><td>Irrigação com cloreto de sódio a 0,9%</td><td>Hospira</td><td>NDC# 0409-6138-03</td><td>Para preparação de soluções de cetamina/xilazina e buprenorfina</td></tr><tr><td>Seringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G agulha</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Solução de iodopovidona</td><td>Aplicare</td><td>82-226</td><td></td></tr><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pomada oftálmica veterinária Puralube</td><td>Dechra Produtos Veterinários</td><td>NDC# 17033-211-38</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Ferramentas cirúrgicas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Balança portátil 200 g</td><td>Ohaus</td><td>SP202</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15124-12</td><td></td></tr><tr><td>Dumont # 5 fórceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td></td></tr><tr><td>Porta-agulhas</td><td>Fine Science Tools</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Micro tesoura de mola</td><td>Fine Science Tools</td><td>15003-08</td><td></td></tr><tr><td>Micro porta-agulhas</td><td>Fine Science Tools</td><td>12061-02</td><td></td></tr><tr><td>Suturas de nylon 5-0 Suturas de nylon</td> para microcirurgia <td>Ethicon</td><td>668G</td><td></td></tr><tr><td>8-0</td> Aquecedor de lâminas de histologia <td>Ethicon</td><td>2808G</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Line</td><td>Barnstead International</td><td>26025</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td><método forte>citospina</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>colagenase tipo I, liofilizado</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>1700-017</td><td></td></tr><tr>Tecnologias de sinalização celular de<td>albumina de soro bovino</td><td></td><td>9998S</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Funis de citologia</td><td>Fisher HealthCare</td><td>10-354</td><td></td></tr><tr><td>HistoBond+ lâminas de microscópio</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 centrífuga</td><td>Shandon</td><td>SH-CYTO2</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários<</td></tr><tr><td>strong>Immunocytochemistry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de coloração deslizante com tampa preta</td><td>IHC World</td><td>M920-2</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Kit de Imagem</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>C10639</td><td>Inclui EdU e&nbsp; </td></tr><tr><td>Caneta de barreira hidrofóbica Immedge</td> Hoeschst 33342 <td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond meio de montagem</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36970</td><td></td></tr><tr><td>Lamínulas de vidro 24 x 50 mm #1.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td><td></td> transparente</tr></tbody></table>

murino do tendão flexor lesão ea cirurgia de reparação

Murine Flexor Tendon Injury and Repair Surgery

Tendão conecta o músculo esquelético e o osso, facilitando o movimento de quase todo o corpo. Na mão, tendões flexores (STF) permitem flexão dos dedos e função geral mão. Lesões ao SFT são comuns, e cura satisfatória é muitas vezes prejudicada devido ao tecido cicatricial em excesso e aderências entre o tendão eo tecido circundante. No entanto, pouco se sabe sobre os componentes moleculares e celulares de reparação FT. Para esse fim, num modelo murino de reparação FT que recapitula muitos aspectos de cicatrização em humanos, incluindo a gama de movimento diminuída e diminuição propriedades mecânicas, tem sido desenvolvido e descrito anteriormente. Aqui uma demonstração em profundidade deste procedimento cirúrgico é fornecido, envolvendo o corte transversal e subsequente reparação do tendão flexor longo dos dedos (FDL) na pata posterior murino. Esta técnica pode ser usado para realizar a análise da linhagem de diferentes tipos celulares, avaliar os efeitos do ganho do gene ou a perda de função, e para testar a eficácia de intervenções farmacológicas no processo de cicatrização. No entanto, existem duas limitações principais para este modelo: i) o tendão FDL na porção média da pata posterior de murino, em que a transecção e reparação ocorrer, não é rodeado por uma bainha sinovial. Portanto, este modelo não leva em conta a potencial contribuição da bainha para o processo de formação de cicatriz. ii) A fim de proteger a integridade do local de reparação, o FT é libertado na junção miotendínea, diminuindo as forças mecânicas do tendão, provavelmente contribui para aumentar a formação de cicatriz. Isolamento de células suficientes a partir do tecido de granulação do FT durante o processo de cura para a análise de citometria de fluxo demonstrou ser um desafio; citologia centrifugação a concentrar-se nestas células é um método alternativo utilizado, e permite a geração de preparações de células no qual a rotulagem de imunofluorescência pode ser realizada. Com este método, a quantificação de células ou proteínas de interesse durante FT cura torna-se possível.

O flexor longo dos dedos (FDL) muscular, localizada na panturrilha, age para flexionar os dígitos da pata de camundongo traseira através do tendão flexor (esboçada em azul na Figura 1A, e mostrado histologicamente na Figura 2A), que funciona proximal do miotendínea junção e termina nas falanges distais. Neste modelo de cicatrização do tendão flexor, o tendão FDL é seccionado e reparado no mid-pé, proximal à bifurcação para os dígitos da pata posterior (s...

tendões flexores na mão são comumente feridos, levando a mão função prejudicada. No entanto, a resposta de cura de tecido cicatricial não está bem caracterizada. Um modelo murino de cura do tendão flexor é demonstrada aqui. Este modelo pode melhorar a compreensão global do processo de cura e avaliar abordagens terapêuticas para melhorar a cicatrização.

Murino do tendão flexor lesão ea cirurgia de reparação

Tendon connects skeletal muscle and bone, facilitating movement of nearly the entire body. In the hand, flexor tendons (FTs) enable flexion of the fingers ...

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é aprimorar a compreensão dos processos celulares e moleculares de formação de cicatriz e aderência durante a cicatrização do tendão flexor. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais sobre o processo de cicatrização do tendão flexor, como quais tipos celulares contribuem para a formação de cicatriz e reparo. A principal vantagem desta técnica é que camundongos transgênicos e knock out podem ser utilizados para compreender melhor o processo de cicatrização.Essa técnica pode identificar alvos biológicos potenciais para melhorar os resultados da cicatrização dos tendões flexores, pois facilita a investigação dessas populações celulares mal definidas que contribuem para a formação de cicatrizes. Após confirmar a ausência de resposta ao aperto nos dedos dos pés, aplique uma pomada oftálmica nos olhos dos animais e retire a pelagem de toda a perna traseira. Esterilize o local cirúrgico com limpezas sequenciais de povidona-iodo e etanol a 70%, e localize o tendão do flexor digitorum longus, ou tendão FDL, na face medial da panturrilha.Em seguida, faça um corte na pele de 0,5 a 1 centímetro para expor o tendão. Use a pinça para separar o tendão do flexor longo dos dedos (FDL) dos tecidos circundantes e siga o tendão até a junção miotendínea. Com tesoura de ponta fina, libere o tendão na junção, tomando cuidado para evitar a artéria tibial posterior.Em seguida, feche a pele com pontos de náilon 5-0. Agora, transfira o camundongo para sob um microscópio estereoscópico e use uma tesoura microcirúrgica de mola para fazer uma incisão de três milímetros na região posterolateral da pata traseira. Use a pinça para retrair suavemente os tecidos moles e o músculo circundantes, tomando cuidado para minimizar os danos teciduais, e identifique o tendão FDL.Em seguida, levante suavemente o tendão e use tesoura microcirúrgica para seccionar completamente o tecido. Utilizando suturas 8.0 em um padrão de Kessler modificado, ligue as extremidades do tendão FDL. Hidrate periodicamente o tendão com solução salina ao longo do procedimento, se necessário.Quando as extremidades forem suturadas, recoloque o tecido mole e o músculo sobre o tendão e use suturas de náilon 5,0 para fechar a incisão. Em seguida, coloque o camundongo sobre um aquecedor de lâmina a 37 graus Celsius com monitoramento até a recuperação completa. 24 horas antes do ponto final do experimento, injete nos camundongos 100 micro litros de EDU.No dia seguinte, localize o tendão reparado conforme acabou de ser demonstrado e colete o tecido transeccionado. O isolamento do tecido granuloso que envolve o tendão em cicatrização é uma etapa crítica para permitir a subsequente análise aminocitoquímica. Deve-se ter cuidado para minimizar a inclusão de tecidos periféricos.Coloque o tendão em uma placa de Petri contendo um mililitro de colagenase. Em seguida, pique os tecidos com o bisturi, seguido de trituração dos fragmentos com várias passagens através de uma agulha de 18 gauge. Transfira a suspensão para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e digira os pedaços de tendão por uma hora a 37 graus Celsius com agitação.No final da digestão, centrifugue as suspensões teciduais e re-suspenda os pellets em 500 micro litros de PBS com três por cento de BSA. Em seguida, filtre as células através de uma peneira de 70 mícrons para remover detritos e grandes fragmentos de tendão não digerido. E coloque as células em uma incubadora a 37 graus Celsius.Transfira os fragmentos de tendão não digeridos para novos tubos microcentrífugos de 1,5 mililitro contendo um mililitro de colagenase fresca e misture os fragmentos por pipetagem. Após mais uma hora de digestão com agitação, centrifugue novamente os fragmentos de tecido e re-suspenda os pellets em 500 microlitros de PBS suplementado com BSA. Em seguida, filtre a suspensão através de uma nova peneira celular de 70 mícrons para o tubo contendo as células coletadas após a primeira digestão.Conte as células e centrifugue-as. Em seguida, re-suspenda o pellet em três a seis vezes 10 à quarta células por 100 microlitros de PBS suplementado com concentração de BSA. Para detectar a incorporação de EDU por imunocitoquímica, utilize primeiro uma caneta de barreira hidrofóbica para delinear as células sobre as lâminas e fixe imediatamente as amostras com 150 microlitros de paraformaldeído a três por cento em PBS, à temperatura ambiente.Após 15 minutos, lave as células com duas lavagens de cinco minutos em 150 microlitros de PBS suplementado com BSA. Em seguida, permeabilize as amostras com 0,5% de Triton X-100 em PBS por 20 minutos. Após a lavagem conforme demonstrado anteriormente, adicione 150 microlitros do coquetel de reação de EDU recém-preparado às células para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente.Em seguida, lave as células novamente e contraclare as amostras com 150 microlitros de Hoechst. Após 30 minutos à temperatura ambiente, adicione uma a duas gotas de meio de montagem antifadente às células e cubra cuidadosamente cada amostra com a lamínula, tomando cuidado para evitar bolhas. Deixe o meio de montagem curar durante a noite no escuro à temperatura ambiente.Em seguida, selar as lamínulas com esmalte incolor. Por fim, observar as lâminas em microscópio de fluorescência utilizando aumento de 40X. Em uma reparação bem-sucedida, o tecido de granulação apresenta uma celularidade muito aumentada em comparação com o tendão não lesionado.Nesta imagem, é mostrado um exemplo histológico de uma reparação de tendão flexor rompido. A marcação com EDU destaca apenas as células que proliferam ativamente nas 24 horas seguintes ao pulso de EDU em camundongos vivos. Facilita uma avaliação quantitativa da proliferação dentro do tecido de granulação do tendão em cicatrização.Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a cirurgia de lesão e reparo do tendão flexor em camundongos, para entender melhor as populações celulares que contribuem para a formação de cicatriz no tendão flexor durante a cicatrização.

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Research

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Fonte: Dalkin, W., et al. O método de lesão do nervo fibular: um ensaio confiável para identificar e testar fatores que reparam as junções neuromusculares. J. Vis. Exp. (2016)Este vídeo demonstra um procedimento cirúrgico para induzir lesão do nervo fibular em um camundongo para estudar a regeneração da junção neuromuscular (JNM). O procedimento envolve expor o nervo fibular, aplicar pressão controlada para induzir lesão e garantir que o epineuro permaneça intacto para apoiar a regeneração...

Induzindo lesão do nervo fibular em um camundongo para estudar a regeneração da junção neuromuscular

Este protocolo descreve um modelo do rato de cirurgia ortopédica que tem sido usado para estudar os mecanismos de neuroinflammation pós-operatória e alterações comportamentais e quando combinado com parabiosis, para estudar a regeneração de tecidos durante o envelhecimento.

Um modelo do rato de cirurgia ortopédica para estudar a disfunção cognitiva pós-operatória e regeneração de tecidos

Neste artigo, apresentamos um protocolo in vitro e in situ para reparar uma lacuna tendinosa de até 1,5 cm, preenchendo-a com enxerto de colágeno projetado. Isso foi realizado desenvolvendo uma técnica de sutura modificada para levar a carga mecânica até que o enxerto amadurecer no tecido hospedeiro.

Uma nova técnica de sutura tenorrhaphy com enxerto de colágeno projetado por tecido para reparar defeitos grandes do tendão

Aqui, nós apresentamos um protocolo para descrever uma técnica minimamente invasora para a imobilização da junção de joelho em um modelo do rato. Este protocolo reprodutível, baseando-se no modus da separação da músculo-abertura e na habilidade da mini-incisão, é apropriado para estudar o mecanismo molecular subjacente da contratura comum adquirida.

Técnica de fixação interna mini-invasiva para estudo de contratura de flexão de joelho induzida por imobilização em ratos

Aqui, apresentamos uma técnica de sutura "Q" que pode ser realizada na reparação do tendão e seus efeitos na formação de lacunas e resistência à tração dos tendões reparados. A sutura Q mostra-se eficiente no aumento da resistência à tração e da resistência ao reparo do tendão.

Usando sutura Q para melhorar a resistência à formação de lacunas e resistência à tração dos tendões flexores reparados

O presente protocolo ilustra um método de avaliação das propriedades biofísicas de reparos tendinosos ex vivo. Um material de sutura de politetrafluoretileno (PTFE) foi avaliado por este método e comparado com outros materiais sob diferentes condições.

Politetrafluoretileno (PTFE) como material de sutura em cirurgia tendínea

A articulação do complexo tornozelo-subtalar (JSCA) é o núcleo do pé e desempenha um papel fundamental no controle do equilíbrio nas atividades diárias. Lesões esportivas muitas vezes levam à instabilidade nessa articulação. Aqui, descrevemos um modelo murino de instabilidade induzida por transecção ligamentar da JSCA.

Um Modelo de Instabilidade Articular do Complexo Tornozelo-Subtalar em Camundongos

Este estudo detalha os procedimentos para o estabelecimento de uma lesão crônica do manguito rotador (MR) de coelhos. Especificamente, a lesão é criada na unidade músculo-tendão/miotendíneo subescapular (SSC) para mimetizar a anatomia e fisiopatologia do MR humano, incluindo degeneração gordurosa muscular (DF) grave. Este protocolo pode ser aplicado para estudar lesões do MR e avaliar terapias regenerativas.

Desenvolvimento de um modelo de lesão crônica do manguito rotador de coelhos para estudo de fibrose e degeneração gordurosa muscular

Apresentamos uma plataforma experimental personalizada e um protocolo de cultura de tecidos que recria a alteração fibrocartilaginosa impulsionada pelo impacto da inserção do tendão de Aquiles em explantes murinos de membros posteriores com viabilidade celular sustentada, fornecendo um modelo adequado para explorar a mecanobiologia do impacto tendíneo.

Modelo de Explante de Membro Posterior Murino para Estudo da Mecanobiologia do Impacto do Tendão de Aquiles

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Aguda e crônica teste sensorial tátil após a lesão medular em ratos

Aprenda a realizar cirurgia de lesão e reparação do tendão flexor em camundongos para estudar processos celulares e moleculares da cicatrização. Este método identifica populações celulares envolvidas na formação de cicatrizes.

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