Murino do tendão flexor lesão ea cirurgia de reparação

O objetivo geral deste procedimento cirúrgico é melhorar a compreensão dos processos celulares e moleculares de formação de cicatrizes e aderências durante a cicatrização do tendão flexor. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o processo de cicatrização do tendão flexor, como quais tipos de células contribuem para a formação e reparo da cicatriz. A principal vantagem dessa técnica é que camundongos transgênicos e nocautes podem ser usados para entender melhor o processo de cicatrização.

Essa técnica pode identificar alvos biológicos potenciais para melhorar os resultados da cicatrização do tendão flexor, pois facilita a investigação dessas populações de células mal projetadas que contribuem para a cicatrização. Depois de confirmar a falta de resposta ao beliscão do dedo do pé, aplique uma pomada oftálmica nos olhos do animal e corte o pelo de todo o membro posterior. Esterilize o local cirúrgico com iodo povedone sequencial e esfoliantes com etanol a 70% e localize o tendão flexor longo dos dedos, ou FDL, na face medial da panturrilha.

Em seguida, faça uma incisão de 0,5 a um centímetro na pele para expor o tendão. Use a pinça para separar o tendão FDL do tecido circundante e trace o tendão até a junção miotendínea. Usando uma tesoura de mola, solte o tendão na junção, tomando cuidado para evitar a artéria tibial posterior.

Em seguida, feche a pele com suturas de náilon 5-0. Agora transfira o mouse para um microscópio estéreo e use uma microtesoura de mola para fazer uma incisão de três milímetros sobre o aspecto posterolateral da pata traseira. Use a pinça para retrair suavemente o tecido mole e o músculo circundantes, tomando cuidado para minimizar o dano tecidual e identificar o tendão FDL.

Em seguida, levante suavemente o tendão e use uma microtesoura para transeccionar completamente o tecido. Usando suturas 8.0 em um padrão de Kessler modificado, ligue as extremidades do tendão FDL. Hidratar periodicamente o tendão com solução salina durante todo o procedimento, se necessário.

Quando as extremidades tiverem sido suturas, retorne o tecido mole e o músculo sobre o tendão e use suturas de náilon 5.0 para fechar a incisão. Em seguida, coloque o mouse em um aquecedor de lâminas de 37 graus Celsius com monitoramento até que esteja totalmente recuperado. 24 horas antes do ponto final experimental, injete nos camundongos 100 micro litros de EDU.

No dia seguinte, localize o tendão reparado como acabamos de demonstrar e colha o tecido seccionado. Isolar o tecido granulado ao redor do tendão em cicatrização é uma etapa crítica para permitir a eventual análise aminocitoquímica. E deve-se tomar cuidado para minimizar a inclusão de tecidos periféricos.

Coloque o tendão em uma placa de Petri contendo um mililitro de colagenase. Em seguida, pique os tecidos com o bisturi seguido de trituração dos fragmentos com várias passagens por uma agulha de calibre 18. Transfira a pasta para tubos de centrífuga de 1,5 mililitro e digerir os pedaços do tendão por uma hora e 37 graus Celsius com agitação.

No final da digestão, centrifugue as suspensões de tecido e ressuspenda os pellets em 500 microlitros de três por cento de BSA em PBS. Em seguida, filtre as células através de um filtro de 70 mícrons para remover os detritos e grandes pedaços de tendão não digerido. E coloque as células em uma incubadora de 37 graus Celsius.

Transfira os pedaços de tendão não digeridos para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo um mililitro de colagenase fresca e misture os pedaços por cabeçalho de tubo. Após mais uma hora de digestão com agitação, gire os pedaços de tecido novamente e ressuspenda os pellets em 500 microlitros de PBS suplementado com BSA. Em seguida, filtre a suspensão através de um novo filtro de células de 70 mícrons no tubo de células coletadas após a primeira digestão.

Conte as células e gire-as por centrifugação. Em seguida, ressuspenda o pellet em três a seis vezes 10 elevado a quarto células por 100 microlitros de PBS suplementado com concentração de BSA. Para detectar a incorporação de EDU por imunocitoquímica, primeiro use uma caneta de barreira hidrofóbica para circundar as células nas lâminas e fixe imediatamente as amostras com 150 microlitros de paraformaldeído a três por cento e PBS à temperatura ambiente.

Após 15 minutos, enxágue as células com duas lavagens de cinco minutos em 150 microlitros de PBS suplementado com BSA. Em seguida, permeabilize as amostras com 0,5% triton X 100 em PBS por 20m minutos. Após a lavagem conforme demonstrado, adicione 150 microlitros de coquetel de reação EDU recém-preparado às células para uma incubação de 30 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, lave as células novamente e contra-core as amostras com 150 microlitros de Hoechst. Após 30 minutos em temperatura ambiente, adicione uma a duas gotas de meio de montagem antidesbotamento às células e cubra cuidadosamente cada amostra com a lamínula, tomando cuidado para evitar bolhas. Cure o meio de montagem durante a noite no escuro em temperatura ambiente.

Em seguida, sele as lamínulas com esmalte transparente. Por fim, crie imagens das lâminas em um microscópio fluorescente usando ampliação de 40X. Em um reparo bem-sucedido, o tecido de granulação exibe uma celularidade muito aumentada em comparação com o tendão não lesionado.

Nesta imagem, é mostrado um exemplo histológico de reparo de tendão flexor rompido. A marcação de EDU destaca apenas as células que proliferam ativamente durante as 24 horas após o pulso de EDU em camundongos vivos. Facilitar uma avaliação quantitativa da proliferação dentro do tecido de granulação do tendão em cicatrização.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a lesão do tendão flexor e a cirurgia de reparo em camundongos, para entender melhor as populações de células que contribuem para a formação de cicatrizes no tendão flexor durante a cicatrização.