Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a ligação de uma proteína de membrana extrínseca na superfície de uma membrana de nanodisco por microscopia eletrônica de transmissão de coloração negativa como um primeiro passo para a determinação da estrutura de alta resolução da proteína. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em vários campos de pesquisa, pois diz respeito às atividades proteicas que ocorrem dentro e sobre as membranas celulares. A principal vantagem dessa técnica são as pilhas características de formas de nanodiscos se a proteína não puder se ligar às membranas.

Essas pilhas são claramente visíveis por microscopia eletrônica de transmissão. A implicação dessa técnica se estende ao desenvolvimento de medicamentos, pois os compostos podem ser facilmente rastreados quanto à capacidade de bloquear ou permitir as interações proteicas da membrana. Embora esse método possa fornecer informações sobre as condições ideais para a ligação de proteínas monotópicas à sua membrana, ele também fornece uma estrutura de baixa resolução do complexo de nanodiscos de proteínas.

Para iniciar o procedimento, expresse e purifique a proteína do andaime da membrana, como MSP1E3D1. Em seguida, usando uma seringa de vidro com agulha de metal, dispense 305 microlitros de 25 miligramas por mililitro de POPC em clorofórmio em um frasco de fundo redondo de vidro. Evaporar o clorofórmio sob uma corrente suave de gás nitrogênio em uma capela de exaustão.

Seque o lipídio restante durante a noite em um dessecador a vácuo. Em seguida, dissolva o bolo lipídico seco em 200 microlitros de tampão padrão MSP enriquecido com colato de sódio 100 milimolar como detergente. Vortex a mistura até ficar transparente para obter uma suspensão de 50 millimolar POPC em tampão.

Em seguida, lave cinco gramas de esferas hidrofóbicas com 30 mililitros de metanol 100%, depois com 40 mililitros de água ultrapura e, finalmente, com 10 mililitros de tampão padrão MSP. Armazene as contas sob 15 mililitros de tampão padrão a quatro graus Celsius. Em seguida, combine 190 microlitros de uma solução 0,124 milimolar de MSP1E3D1 e 61,5 microlitros de uma suspensão 50 milimolar de POPC em tampão, resultando em uma proporção de um para 130 molares de MSP para POPC e uma concentração de colato de sódio de 25 milimolar.

A proporção ideal do lipídio por MSP varia de acordo com cada escolha de tipo de lipídio e lente MSP e deve ser otimizada para obter uma preparação homogênea de nanodiscos. Incube a mistura em gelo úmido por uma hora. Em seguida, adicione a solução a um tubo contendo 0,5 gramas de grãos hidrofóbicos lavados por mililitro de mistura de reconstituição para iniciar a automontagem do nanodisco.

Incube a mistura a quatro graus Celsius por 16 horas a sete a oito rotações por minuto. Após a incubação, deixe as contas assentarem por gravidade. Remover e armazenar o sobrenadante a quatro graus Celsius até estar pronto para realizar a cromatografia de exclusão de tamanho.

Antes da cromatografia de exclusão de tamanho, centrifugar a mistura a 13 000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Decantar o sobrenadante e rejeitar o pellet. Equilibre uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho com tampão padrão MSP até que a linha de base em 280 nanômetros esteja estável.

Injectar o sobrenadante na coluna e recolher o produto em fracções de 0,5 mililitros. Meça a absorbância das frações a 280 nanômetros com um espectrofotômetro UV. Calcule a concentração de nanodiscos usando o coeficiente de extinção molar para o MSP escolhido.

Para realizar a eletroforese em gel não desnaturante, primeiro misture 15 microlitros da amostra com cinco microlitros do tampão de carga apropriado. Encha o tanque de cátodo com tampão catódico leve e o tanque de ânodo com tampão de funcionamento. Carregue a amostra em um gel de quatro a 16% Bis-Tris e comece a corrida.

Manchar o gel de acordo com as instruções do fabricante do gel. Para iniciar a preparação de um complexo de proteína monotópica de nanodisco com cinco lipoxigenases como proteína, prepare um lote de tampão padrão MSP enriquecido com cloreto de cálcio 1,5 milimolar. Expresse e purifique a proteína 5LO.

Prepare imediatamente uma mistura de 100 microlitros de 5LO 0,8 micromolar e nanodiscos de 0,8 micromolar em tampão padrão MSP enriquecido com cálcio. Nosso exemplo de uma proteinase monotópica cinco lipoxigenase depende de quantidades de cálcio para se ligar à membrana. O 5LO é altamente sensível e deve ser usado dentro de algumas horas após a preparação.

Incube a mistura no gelo por 10 minutos. Armazene a amostra de complexo de proteína de nanodisco resultante a quatro graus Celsius por até um mês. Para iniciar a preparação para a análise MET, dissolva um grama de sal de fosfotungstato de sódio em 50 mililitros de água ultrapura à temperatura ambiente.

Ajustar o pH da solução para 7,4 com uma solução molar de hidróxido de sódio. Filtrar a solução de fosfotungstato de sódio através de um filtro de seringa de 0,22 micrómetros e conservar a solução à temperatura ambiente. Em seguida, descarga incandescente de grade de cobre revestida de carbono de 400 mesh por 20 segundos a 30 miliamperes para tornar a superfície da grade hidrofílica.

Coloque entre 2,5 e cinco microlitros da amostra do complexo de proteína monotópica de nanodisco na grade e deixe a amostra descansar por 30 segundos. Em seguida, use papel de filtro para enxugar o excesso de solução da grade. Aplique imediatamente uma gota de solução de fosfotungstato sódico e deixe a solução agir por 30 segundos.

Seque o excesso de solução e deixe a grelha secar ao ar. Realize microscopia eletrônica de transmissão com uma tensão acelerada de 120 a 200 quilovolts. Exclua imagens que mostrem pilhas longas do processamento de imagem subsequente.

Para as imagens selecionadas, use métodos de processamento padrão para determinar as médias de classe e gerar um modelo 3D de baixa resolução da proteína monotópica do nanodisco. Usando este método, nanodiscos vazios foram preparados com uma proporção de um para 130 de proteínas de andaime de membrana para lipídios. Apenas um pico principal foi observado durante a cromatografia de exclusão de tamanho e apenas uma banda foi observada na eletroforese em gel nativo azul.

Quando os nanodiscos vazios são tratados com uma solução de sal de sódio fosfotungstato, o empilhamento é induzido. Essas pilhas longas podem então ser observadas pelo TEM. Esse empilhamento não foi interrompido pela inclusão de íons de cálcio na solução de nanodisco antes da aplicação da solução de fosfotungstato de sódio.

Quando uma proteína monotópica, como a cinco lipoxigenase, está ligada à superfície do nanodisco, o empilhamento é dificultado pela obstrução esteárica da proteína. Ambos os lados do nanodisco estão disponíveis para ligação, permitindo a formação de um para um e dois para um complexos de nanodiscos 5LO. A amostra de dois para um complexo de nanodiscos 5LO exibiu menos empilhamento do que a amostra de um para um.

A ligação 5LO requer a presença de íons cálcio. Isso foi confirmado pela observação do empilhamento em uma mistura de 5LO e nanodiscos sem cálcio, que indicou que o 5LO não havia se ligado às superfícies da membrana. Uma vez que a proteína monotópica e os nanodiscos são preparados, a avaliação da ligação da proteína à sua membrana pode ser feita em uma tarde, se for realizada corretamente.

Ao tentar este procedimento, é importante estimar a área da proteína no nanodisco para escolher o comprimento correto do MSP. Para tamanhos bem combinados, no máximo duas proteínas extrínsecas podem se ligar a uma de cada lado do disco. Também é importante que o sal de sódio do fosofotungstênio seja usado para o suporte negativo para garantir o empilhamento máximo, pois a ligação é confirmada pela comparação da ausência de pilhas com as pilhas longas de uma amostra sem uma proteína monotópica.

O uso dos nanodiscos em vez de lipossomas permite o uso de espalhamento dinâmico de luz, espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para responder a perguntas adicionais sobre homogeneidade, tamanho ou estrutura molecular da amostra. A estrutura 3D de baixa resolução de uma proteína de membrana monotópica ligada a um nanodisco pode ser um primeiro passo facilmente acessível no caminho para a estrutura de alta resolução dessas proteínas ligadas.