Name: Método para visualizar e analisar proteínas de interação de membrana por microscopia eletrônica de transmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Aprenda a visualizar proteínas de membrana extrínsecas em nanodiscos por microscopia eletrônica de transmissão com coloração negativa. Esta técnica revela interações proteína-membrana e auxilia no desenvolvimento de fármacos.

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Os autores agradecem o Conselho Sueco de Pesquisa, Conselho do Condado de Estocolmo, e os fundos de Ki para o seu apoio. A expressão e purificação de MSP foi realizado no Karolinska Institutet / SciLifeLab Protein Ciência Núcleo Facility (http://PSF.ki.se). Os autores também gostariam de agradecer ao Dr. Pasi Purhonen e Dr. Mathilda Sjöberg para compartilhar seus conhecimentos técnicos e para a sua assistência oportuna.

1. Preparação de Nanodiscs <ol><li> Expressão e purificação da proteína de membrana de andaimes 8, 35 <ol><li> Expressar a MSP1E3D1 marcada com His no coli BL21 E. (DE3) estirpe T1R pRARE2 em frascos. Prepara-se uma cultura de arranque durante a noite de 50 ml com meio LB suplementado com 50 ug / ml de canamicina a 37 ° C. Dilui-se a cultura de arranque durante a noite em 2 L de meio de caldo óptimo suplementado com 50 ug / ml de canamicina. </li><li> Crescer as células a 37 ° C até a densidade óptica a 600 nm (DO 600) atingir aproximadamente 3. induzem a expressão de proteínas com 0,5 mM de isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante 3 h a 18 ° C. </li><li> Preparar o tampão de lise (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; NaCl 100 mM; e 10% de glicerol). Adicionar TCEP 1 mM imediatamente antes da utilização. </li><li> Após 3 h de indução a 18 ° C, a colheita das células por centrifugação durante 10 min a 4500 xge 4 ° C. Descartar o sobrenadante, pesar as células colhidas e re-suspender-los em tampão de lise a uma razão de 2 ml de tampão de lise por g de células. </li><li> Lisar as células por ultra-sons pulsada (taxa de repetição: 4 está ligado, 4 s OFF) durante 3 min a 80% de amplitude. </li><li> Centrifugar os lisados ​​durante 20 minutos a 49000 xg e 4 ° C. Desprezar o pelete desta centrifugação. </li><li> Injectar o sobrenadante para a 5 ml de Ni + coluna quelante ligado a um sistema de cromatografia líquida automatizado de preferência mantida a 4 ° C. </li><li> Antes do passo de eluição (passo 1.1.9), lava-se a coluna com tampões 1 - 3 abaixo para remover todas as proteínas, excepto a marcada com His MSP. Controlar o teor de proteína a 280 nm a seguir o processo de purificação; a gravação de UV a 280 nm deve voltar à linha de base após cada lavagem. <ol><li> Lava-se com um tampão de lavagem: 40 mM Tris-HCl, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM, e 1% de Triton, pH 8,0. </li><li> Lava-se com tampão de lavagem 2: 40 mM de Tris-HCl, 300 mMDe NaCl, imidazole 20 mM, e colato de sódio 50 mM, pH 8,0. </li><li> Lava-se com tampão de lavagem 3: 40 mM de Tris-HCl, NaCl 300 mM e imidazole 50 mM, pH 8,0. </li></ol></li><li> Elui-se o MSP com Tris-HCl 40 mM, NaCl 300 mM e imidazole 500 mM, pH 8,0. </li><li> Mudar o tampão para MSP tampão convencional (20 mM de Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; e EDTA 0,5 mM) por filtração em gel 8, 35; o rendimento por lote deve ser em torno de 7 mg L -1. </li></ol></li><li> Preparação da solução de fosfolipídios <ol><li> Adicionar 305 uL de 1-palmitoil-2-oleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina (POPC) dissolvido em clorofórmio a uma concentração de 25 mg / mL para um copo de vidro e evapora-se o clorofórmio, purgando-o com uma corrente suave de azoto . Seca-se a noite lipídico em um excicador de vácuo. NOTA: Este passo é realizado para remover o solvente a partir do lípido, o que deixa uma fina película de lípido na parte inferior do copo de vidro.</li><li> Ressuspender o bolo de lípido em 200 uL de tampão de padrão MSP contendo colato de sódio 100 mM em vortex do tubo até que a solução se torna transparente; isto irá proporcionar uma solução com uma concentração de 50 mM de POPC. NOTA: De um modo geral, a razão molar de lípido para detergente neste ponto deverá ser de 1: 2 (lípido: detergente) 8. Esta mistura de lípido-detergente pode ser armazenado a -80 ° C durante cerca de 2 meses. </li></ol></li><li> Preparação dos grânulos hidrófobos para a remoção do detergente <ol><li> Colocar 5 g de pérolas (-peso seco) num tubo de 50 mL. </li><li> Lavam-se as esferas com 30 ml de metanol a 100% e depois com 40 ml de água ultrapura. </li><li> Lavam-se as esferas com 10 ml de tampão padrão MSP. Finalmente, armazenar as pérolas com 15 mL de solução tampão padrão de MSP a 4 ° C. </li></ol></li><li> Nanodisc reconstituição <ol><li> Dispensar 190 ul de MSP1E3D1 (0,124 mM) num tubo de microcentrífuga e adicionar 61,5 mL de solução de estoque de fosfolípido (50 mM de POPC) para o mesmo tubo. Incubar a mistura reconstituição em gelo húmido durante 1 h. NOTA: Este é igual a uma proporção molar de 1: 130 (MSP1E3D1: POPC). </li><li> Adicionar pérolas hidrofóbicas a uma concentração de 0,5 g de pérolas por ml de mistura de reconstituição para iniciar o processo de auto-montagem. Incubar numa incubadora rotativa durante 16 horas a 4 ° C. </li><li> Depois da incubação, centrifuga-se durante 10 min a 13000 xg e 4 ° C para remover os precipitados e agregados. Descartar o pellet e guardar o sobrenadante. </li><li> Equilibrar a coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (montado em um sistema de cromatografia líquida automatizado) com tampão padrão MSP até a absorvância a 280 nm é estável. Injecta-se o sobrenadante na coluna e recolher as fracções de pico. </li><li> Medem-se as concentrações de nanodiscs nas fracções de pico a 280 nm. Utilizar o coeficiente de extinção molar de MSP1E3D1 (£ = 29,910 centímetros -1 M-1) para o cálculo da concentração nanodisc. Note onúmero de lípidos por nanodisc pode ser medido por uma combinação de lípidos radiomarcados e análise de fosfato de 4 ou por análise de fosfato sozinha. </li></ol></li></ol> 2. Preparação da Proteína monotópico 5-lipoxigenase 35 <ol><li> Prepara-se uma cultura de arranque durante a noite. Suplemento 50 ml de meio LB com 100 ug / ml de ampicilina. Inocular o meio com E. coli BL21 (DE3) contendo o plasmídeo do gene da 5-lipoxigenase (ALOX5). Dilui-se a cultura de arranque durante a noite em meio de expressão contendo 42 mM de Na 2 HPO 4, mM de KH 2 PO 4, NaCl 9 mM, 19 mM de NH4CI, MgSO4 1 mM, CaCl 0,1 2, 0,2% de D-glucose 24, 0,1 %, 5 uM de FeSO4, e 100 ug / ml de ampicilina. Crescer as células até que a OD 600 é ~ 0,5 a 25 ° C. Induzem a expressão de proteínas com IPTG 0,2 mM durante 16 h a 20 ° C 35. </li><li> Colheita por centrifugação durante 10 min a 7000 xg e 4 ° C e desprezar o sobrenadante. Pesa-se o sedimento encontra no fundo do tubo contendo as células colhidas e ressuspender as células colhidas em tampão de lise (Tris-HCl a 100, pH 8,0; NaCl 100 mM; glicerol a 10%; e TCEP 1 mM) contendo inibidores de protease e 0,5 mg / mL de lisozima de 35 a uma razão de 2 ml de tampão de lise por g de células. </li><li> Lisar as células por sonicação durante 5 x 15 segundos a 80% de amplitude. Remover os detritos celulares por centrifugação durante 10 min a 7000 xg e 4 ° C. Realizar de amónio sulfato de precipitação de 30 - 60% de saturação para precipitar as proteínas na solução 35. Centrifugar durante 15 minutos a 16000 xg e 4 ° C. NOTA: O sedimento 5LO pode ser rapidamente congeladas e armazenadas a -80 ° C durante até 6 meses. </li><li> Ressuspender o sedimento com 20 ml de tampão de lise e centrifugação durante 15 min a 40000 xg e 4 ° C. </li><li> Incubar o sobrenadante sobre<html> uma coluna de agarose com ATP a 4 ° C durante 30 min. Lava-se a coluna uma vez com um volume de coluna de tampão de lise contendo NaCl 0,5 M. Eluir a 5LO com ATP 20 mM em tampão de lise contendo 10 mM de FeSO4 e 20 ug / ml de catalase. Realizar cromatografia de filtração em gel para remover o ATP de 35. NOTA: O 5LO é instável e deve ser utilizado imediatamente após a purificação. Caso contrário, recomenda-se a suspender no passo de precipitação com sulfato de amónio (ver a nota depois do passo 2.1.3). </li></ol> 3. Preparação do Complexo de proteína-Nanodisc <ol><li> Preparar um volume total de 100 ul de complexo. Misture 0,8 uM e 0,8 uM ND 5LO com Ca 2+ 1 mM presentes no tampão padrão MSP (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; NaCl 100 mM; EDTA 0,5 mM; e 1,5 mM de CaCl2) e incubar durante 10 min no gelo. NOTA: A amostra pode ser armazenada durante até um mês a 4 ° C 35. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 4. análise das amostras <ol><li> A electroforese em gel <ol><li> Não eletroforese desnaturante <ol><li> Misturar 15 mL da amostra com 5 uL de tampão de carga (BisTris 50 mM, HCl 6, 50 mM de NaCl, 10% (w / v) de glicerol, e 0,001% de Ponceau S, pH 7,2) 49 e carregá-lo sobre um 4 - 16% de gel de Bis-Tris de realizar electroforese. </li><li> Encher o reservatório de cátodo com tampão de luz cátodo (Bis Tris 50 mM; Tricina 50 mM, pH 6,8, e 0,002% de Coomassie G-250) e o reservatório de ânodo com tampão (50 mM de Bis Tris e Tricina 50 mM, pH 6,8) em execução. Comece a separação usando uma voltagem constante de 150 V. </li><li> Pare a separação electroforética quando a frente de Coomassie atinge a extremidade do gel. </li><li> Corar o gel com azul de Coomassie de um protocolo padrão. </li></ol></li><li> eletroforese desnaturante <ol><li> Misturar 40 ul de amostra com 10 ul de tampão de carga contendo SDS (0,05% (w / v) de azul de bromofenol; M de Tris-HCl 0,2,pH 6,8; 20% (v / v) de glicerol; 10% (w / v) de SDS; e 10 mM de 2-mercaptoetanol) e carregá-lo sobre um 4 - glicina gel de Tris a 20% para realizar a electroforese. </li><li> Encher os tanques de cátodo e ânodo com tampão de corrida (25 mM Tris-HCl, pH 6,8; 200 mM de glicina, e 0,1% (w / v) de SDS). Comece a separação usando uma voltagem constante de 150 V. </li><li> Pare a separação electroforética quando a frente de corante de carga atinge a extremidade do gel. </li><li> Corar o gel com azul de Coomassie de um protocolo padrão. </li></ol></li></ol></li><li> Preparação da solução napt <ol><li> Dissolve-se 1 g de sal de fosfotungstato de sódio em 50 ml de água por agitação à temperatura ambiente para dar origem a 2% (w / v) de solução ácida. </li><li> Ajustar o pH para 7,4 com NaOH 1 M. Remover as partículas utilizando um filtro de seringa de 0,22? M. Guardar a solução à temperatura ambiente ou a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparação da amostra para análise TEM <ol><li> Glow-descarga grades de cobre revestido de carbono (400 mesh) por 20 s a 30 mA para processar as grelhas hidrofílicos antes da adsorção da amostra. Colocar 3,5 mL da amostra (0,8 uM no que diz respeito aos nanodiscs) da grelha e incubar durante 30 s. NOTA: O volume aplicada pode variar entre 2,5 e 5 ul, dependendo da concentração da amostra. Um intervalo de concentração é adequado para nanodiscs 0,5 - 1 jiM. </li><li> Blot off solução excedente usando papel de filtro. </li><li> Imediatamente manchar a grelha com uma gota de 2% napt durante 30 s. Seque o excesso de solução e deixar a grade para secar ao ar. </li><li> Avaliar as grades por TEM. Um microscópio com 120-200 keV tensão de aceleração suficiente para estimar o grau de empilhamento. NOTA: Para o presente protocolo, foi utilizado um microscópio eletrônico de transmissão calibrado, equipado com um canhão de emissão de campo de 200 keV. </li><li> Grave as imagens de TEM. Para as imagens que mostram pilhas de comprimento, não processam mais longe; imagens mostram o complexo de nanodiscs, com proteína extrínseca que pode conter algunsshort stacks, mas a maioria das partículas são no complexo. Registe várias imagens e processo desses acordo com métodos convencionais para a obtenção de classe-média e de baixa resolução, 3 modelo dimensional do complexo. NOTA: Para a coleta de dados de mancha negativa, as redes foram feitas em pelo menos três dias diferentes. Para cada dia, as incubações amostra fresca (como na etapa 3.1) foram feitas antes da coloração negativa foi aplicado. </li></ol></li></ol>

Os autores não têm nada a divulgar.

O método pode ser dividido em três partes: a reconstituição de nanodiscs vazio, a preparação de complexos de proteína-nanodisc, e a coloração negativa para a ETM destes complexos. Cada parte será tratado separadamente sobre limitações da técnica, passos críticos, e as modificações úteis. Reconstituição de nanodiscs vazios. passos e limitações críticas na produção e utilização de nanodiscs. Para a preparação dos nanodiscs vazias, que é essencial para optimizar a rela...

Na pesquisa médica, muita atenção está focada em proteínas de membrana, quer intrínsecos ou extrínsecos, envolvidos em uma variedade de interações lipídicas. Trabalhando com proteínas interactuantes de lípidos inclui quer seleccionando um substituto para os lípidos, tais como detergentes, amphipols 1, ou 2 pequenas proteínas, ou encontrar um substituto membrana que mantém a proteína solúvel e activa. Substitutos de membrana lipóico incluem lipossomas e nanodiscs (ND) 3, 4. Nanodiscs são plataformas de membrana de quase-nativos desenvolvidos por engenharia a parte de proteína, ApoA-1, da lipoproteína de alta densidade (HDL) no sangue que ocorrem naturalmente. ApoA-1 é um resíduo 243 ao longo da cadeia de curtas hélices a anfipáticas e tem uma conformação solúvel livre de lípidos. In vitro, quando na presença de lípidos, duas cópias da proteína de ApoA-1 espontaneamente rearranjar para rodear o hidrporção da cadeia acil ophobic de um lipídico remendo bicamada 5. versões modificadas de ApoA-1 são geralmente chamadas proteínas de membrana de andaime (MSP), e um número crescente estão comercialmente disponíveis como plasmídeos ou como proteínas purificadas. Repetições ou deleções das hélices em ApoA-1 resultam em proteínas de membrana de andaimes 7 6 mais longos ou mais curtos. Isto por sua vez faz com que seja possível formar discos de cerca de 6 nm 7 a 17 nm de diâmetro 8. Existem diferentes tipos de aplicações para o nanodiscs 3, 9. A aplicação mais vulgarmente utilizado é o de proporcionar um ambiente de membrana quase nativo para a estabilização de uma proteína de membrana integral 8, avaliação previamente 3, 9. Uma utilização menos explorado é proporcionar uma superfície de membrana para o estudo nanoescala demembrana periférica proteínas 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Seção 1 do protocolo abaixo visualiza o procedimento para fazer nanodiscs compostos de fosfolipídios e proteínas andaimes membrana. A preparação da amostra é um gargalo na maioria dos métodos. amostras específicos do método pode adicionar informações particular, mas também fazer comparações de resultados difícil. Portanto, é mais simples quando as amostras são multimodais e pode ser utilizado directamente em vários métodos diferentes. Uma vantagem com a utilização de nanodiscs é o tamanho pequeno do nanodisc em comparação com lipossomas (por exemplo, as amostras podem ser utilizados directamente para ambos TEM e electroforese em gel não desnaturante, tal como no presente protocolo). <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; vesículas e lipossomas têm sido muito utilizados para compreender a função de proteínas que interagem com membrana. Para os estudos estruturais e de visualização, um exemplo da determinação estrutural de uma proteína transmembranar em lipossomas está disponível 18. No entanto, nenhuma estrutura 3D de alta resolução de uma proteína de membrana monotópico incorporado em uma membrana de lipossoma ainda não foi publicada, tanto quanto sabemos. As nanopartículas de ouro ou anticorpos pode ser utilizada para visualizar as proteínas de ligação a lipossomas ou vesículas usar o sistema 19. Mesmo que estas sondas são muito específicos, eles podem interferir com as proteínas de ligação membrana velando o local de ligação da membrana ou mascarando áreas de interesse com as partes flexíveis. Ouro-marcado ou proteínas complexado com anticorpo poderia provavelmente ser analisados ​​num gel, mas isto iria aumentar o custo do experimento. Embora lipossomas são uma excelente plataforma, não se pode ter certeza de que o popmento tem uma razão particular de proteína por lipossoma, uma característica que pode ser explorado pela utilização de nanodiscs 20. Em um lipossoma, cofactores e substratos pode ser preso no interior solúvel. Substâncias que são membrana solúvel irá compartilhar o mesmo destino para os dois tipos de miméticos de membranas. No entanto, como a área de bicamada é menor em nanodiscs, uma quantidade menor de substância é necessária para saturar as membranas nanodisc. a função da proteína compreensão através da determinação da estrutura atômica tem sido essencial para muitos campos de pesquisa. Os métodos para determinação de estruturas de proteínas incluem raios X 21; ressonância magnética nuclear (RMN) de 22, 23; e microscopia eletrônica de transmissão (TEM) 24 em temperaturas criogênicas, cryoEM. A resolução por cryoEM ultimamente tem sido muito melhorada, principalmente devido ao uso de elétrons de diretaTectors 25, 26. As macromoléculas são gravadas em fina, gelo vítreo 27 em um estado quase nativo. No entanto, devido ao baixo contraste de moléculas biológicas, tornam-se difíceis de detectar na gama de tamanhos de 100-200 kDa. Para as amostras de tamanho adequado, recolha de dados pode ser feita, e o método de reconstrução única partícula pode ser aplicado para se obter uma estrutura 28. No entanto, a determinação da estrutura da proteína por MET é um processo de múltiplos passos. Geralmente começa com a avaliação de monodispersity amostra por-coloração negativa TEM 29 usando sais de metais pesados como phosphotungsten (PT) 30 ou urânio 31. Reconstrução de um modelo de baixa resolução da macromolécula negativamente corada é geralmente feito e pode fornecer informações importantes sobre a estrutura molecular 29. Em paralelo,recolha de dados usando cryoEM pode começar. Cuidados devem ser tomados quando se avaliam dados TEM-mancha negativa para evitar a má interpretação da formação de artefato. Um artefacto particular é o efeito da mancha PT em fosfolípidos e lipos somas de 32, resultando na formação de longas hastes que se assemelham a pilhas de moedas visto de lado 33. Tal &quot;rouleau&quot; ou &quot;pilhas&quot; (doravante denominada como &quot;pilhas&quot;) foram observados no início de HDL 34, e mais tarde também para nanodiscs 35. O empilhamento e reformulação das membranas pode ocorrer por várias razões. Por exemplo, pode ser induzida por co-factores, como o cobre, mostrado por imagem TEM de uma mancha de molibdato de amónio 36. Uma fracção dos lípidos de membrana em liposomas continha um grupo de cabeça de ácido iminodiacético imitando complexação de metais por EDTA, empilhamento, portanto, os lipossomas após a adição de iões de cobre <s-se class = &quot;xref&quot;&gt; 36. Empilhamento também poderia ser devido a uma interacção proteína-proteína através de uma proteína dentro ou sobre as bicamadas lipídicas (a mancha utilizado não é mencionado) 37. A formação da pilha de fosfolípidos por PT foi observada desde o início; no entanto, trabalho posterior tem incidido sobre a remoção ou abolir esta formação artefato 38. Aqui, propõe-se um método para aproveitar a nanodisc induzida napt empilhamento para o estudo de proteínas de ligação de membrana por TEM. Em suma, obrigatória para as nanodiscs proteína impediria os nanodiscs de empilhamento. Embora as razões para o empilhamento não são claros, foi proposto que 39 existe uma interacção electrostática entre os fosfolípidos e o grupo fosforilo da PT, fazendo com que os discos adiram uns aos outros (Figura 1A). A hipótese atrás nosso protocolo é que quando uma proteína se liga a um nanodisc, a maior parte da superfície de fosfolípido não é disponí<html> ble para a interacção com o PT devido a impedimento estérico da proteína. Isto iria evitar a formação da pilha (Figura 1B). Duas conclusões podem ser tiradas. Em primeiro lugar, a prevenção de empilhamento significa que a proteína de interesse está ligado à membrana. Em segundo lugar, o complexo proteína-ND pode ser tratado com os métodos de processamento de uma única partícula padrão 24, 40 para obter uma morfologia grosseira do complexo. Além disso, as análises por métodos tais como a electroforese em gel não desnaturante ou dispersão dinâmica da luz pode ser realizado. Para demonstrar esta hipótese, utilizou-se a proteína de ligação à membrana de 5-lipoxigenase (5LO), que está envolvida em muitas doenças inflamatórias, 41 42. Esta proteína de 78 kDa requer iões de cálcio para se ligar à sua membrana 43. Embora esta associação membrana tem sido estudada extensivamente utilizando lipossomass = &quot;refex&quot;&gt; 44, 45, 46 e 47 fracções de membrana, estes não podem ser utilizados para a análise TEM e determinação da estrutura. A preparação de nanodiscs começa por mistura com lípidos MSP ressuspensas no detergente colato de sódio. Após incubação em gelo durante 1 h, o detergente é lentamente removido da mistura reconstituição utilizando uma resina adsorvente. Este tipo de material é frequentemente feito de poliestireno moldado em pequenos grânulos. Eles são relativamente hidrofóbico e têm uma forte preferência para o detergente de ligação em comparação com lipídeos 48. Depois de remover as pérolas hidrofóbicas e realizando clarificação com centrifugação, os nanodiscs são purificados por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC). Os nanodiscs purificadas são misturados com uma proteína de membrana monotópico (e possíveis cofactores) em uma proporção equimolar (ou várias proporções para uma titulação) e são deixados a react (15 min). A análise por TEM é levada a cabo aplicando-ul quantidades de amostra em, grelhas revestidas de carbono têm um brilho descarregada e, em seguida, através da realização de coloração negativa com napt. A mesma amostra de quando as alíquotas foram aplicadas às grades de MET pode ser utilizado para análise por não desnaturante ou SDS-PAGE electroforese em gel, bem como por vários tipos de medições da actividade, sem grandes alterações.

<table><tbody><tr><td>Microscópio eletrônico de transmissão: JEOL2100F</td> câmera <td>JEOL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCD</td><td>Tiez Video and Imaging Processing System GmbH, Alemanha</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Descarregador incandescente</td><td>Baltec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM grade: 400 mesh</td><td>TAAB</td><td>GM016/C</td><td></td></tr><tr><td>Cromatografia de exclusão de tamanho: Agilent SEC-5</td><td>Agilent Technologies</td><td>5190-2526</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>Plasmídeo: MSP1E3D1</td><td>Addgene</td><td>20066</td><td></td></tr><tr><td>Bactérias: BL21DE3</td><td>NEB</td><td>C2527H</td><td></td></tr><tr><td>Bactérias: BL21 (DE3) T1R pRARE2</td><td>Protein Science Facility, KI, Solna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Purificação: ATP agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2767</td><td></td></tr><tr><td>Matriz de Purificação: HisTrap HP-5 mL</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Lipídio: POPC</td><td>Lipídios polares Avanti</td><td>850457C</td><td>25 mg/mL em clorofórmio</td></tr><tr><td>Grânulos hidrofóbicos: Bio-Beads, SM-2 Resina</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>filtro de seringa de 13 mm: 0,2 &mu; m</td><td>Pall life sciences</td><td>PN 4554T</td><td></td></tr><tr><td>Mancha: Hidrato tribásico de fosfotungstato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31648</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-250ML</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0301</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidor de protease</td><td>Sigma Aldrich</td><td>4693132001</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Detergente: Hidrato de colato de sódio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6445-10G</td><td></td></tr><tr><td>Colato</td><td></td><td></td> de sódio <td>500 mM Colato de sódio. Ressuspenda em água miliQ e armazene a -20 ° C.</td></tr><tr><td>Estoque de</td><td></td><td></td><td>lipídios 50 mM POPC, 100 mM de colato de sódio, 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl. <bt />Armazene a 4 &deg; C por uma semana; ou Loja -80 &deg; C durante um mês, depois de purgar a solução com azoto.</td></tr><tr><td>Tampão</td><td></td><td></td> padrão MSP <td>20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,5 mM EDTA. Armazene a 4 °C.</td></tr><tr><td>Tampão de ânodo de eletroforese não desnaturante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2001</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricina, pH 6.8</td></tr><tr><td>Tampão catódico de eletroforese não desnaturante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2002</td><td>50 mM Bis-Tris, 50 mM Tricina, pH 6.8, 0.002% Coomassie G-250</td></tr><tr><td>Eletroforese não desnaturante 4x Tampão de carregamento de amostra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BN2003</td><td>50 mM Bis-Tris, pH 7,2, 6 N HCl, 50 mM NaCl, 10% (p/v) de glicerol, 0,001% Ponceau S</td></tr><tr><td>Eletroforese Desnaturante Tampão</td><td></td><td></td><td>de Execução Receita interna: 25 mM Tris-HCl, pH 6,8, 200 mM de Glicina, 0,1% (p/v) SDS</td></tr><tr><td>Eletroforese Desnaturante 5x Carregamento de amostras Tampão</td><td></td><td></td><td>Receita interna: 0,05% (p/v) Bromofenolazul, 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, 20% (v/v) de glicerol, 10% (p / v) SDS, 10 mM 2-mercaptoetanol</td></tr><tr><td>Caldo</td><td></td><td></td> fantástico <td>Triptona - 12,0 g, Extrato de levedura - 24,0 g, 100 mL 0,17 M KH2PO4 e 0,72 M K 2HPO 4, Glicerol - 4 mL. Triptona, extrato de levedura e glicerol foram preparados a 900 mL e autoclavados separadamente. KH2PO4 e K2HPO4 foram preparados e autoclavados separadamente. Ambos foram misturados antes de usar o meio.</td></tr></tbody></table>

método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por microscopia eletrônica de transmissão

Method to Visualize and Analyze Membrane Interacting Proteins by Transmission Electron Microscopy

As proteínas monotópicas exercem sua função quando ligadas a uma superfície de membrana, e tais interações dependem da composição lipídica específica e da disponibilidade de área suficiente para desempenhar a função. Os nanodiscos são usados para fornecer uma superfície de membrana de tamanho e conteúdo lipídico controlados. Na ausência de proteínas extrínsecas ligadas, os nanodiscos corados com fosfotungstato de sódio aparecem como pilhas de moedas quando vistos de lado por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Este protocolo é, portanto, projetado para promover intencionalmente o empilhamento; Consequentemente, a prevenção do empilhamento pode ser interpretada como a ligação da proteína de ligação à membrana ao nanodisco. Em uma etapa posterior, as imagens TEM dos complexos proteína-nanodisco podem ser processadas com métodos padrão de partícula única para produzir estruturas de baixa resolução como base para o trabalho de crioEM de alta resolução. Além disso, os nanodiscos fornecem amostras adequadas para eletroforese em gel TEM ou não desnaturante. Para ilustrar o método, é apresentada a ligação induzida por Ca2+ da 5-lipoxigenase em nanodiscos.

O método é proposto depende da preparação de nanodiscs para proporcionar a superfície da membrana para a ligação monotópico membrana-proteína. Como não há nenhuma proteína transmembranar incorporado na bicamada lipídica nanodisc, os nanodiscs são aqui indicadas como &quot;nanodiscs vazias&quot; (Figura 2A). Estes têm um peso molecular calculado de 256 kDa para uma composição de duas proteínas MSP1E3D1 andaimes e cerca de 260 moléculas de POPC 8. U...

Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Monotopic proteins exert their function when attached to a membrane surface, and such interactions depend on the specific lipid composition and on the ...

O objetivo geral deste procedimento é visualizar a ligação de uma proteína de membrana extrínseca à superfície de uma membrana em nanodisco por meio de microscopia eletrônica de transmissão com contraste negativo, como um primeiro passo rumo à determinação da estrutura de alta resolução da proteína. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais em diversas áreas de pesquisa, pois envolve atividades proteicas que ocorrem nas membranas celulares e sobre elas. A principal vantagem desta técnica é a formação característica de pilhas de nanodiscos quando a proteína não consegue se ligar às membranas.Essas pilhas são claramente visíveis por microscopia eletrônica de transmissão. A implicação desta técnica estende-se ao desenvolvimento de fármacos, pois compostos podem ser facilmente triados quanto à capacidade de bloquear ou permitir interações de proteínas de membrana. Embora este método possa fornecer informações sobre as condições ideais para a ligação de proteínas monotópicas à sua membrana, ele também fornece uma estrutura de baixa resolução do complexo de proteína em nanodiscos.Para iniciar o procedimento, expresse e purifique a proteína de sustentação da membrana, como MSP1E3D1. Em seguida, utilizando uma seringa de vidro com agulha metálica, distribua 305 microlitros de 25 miligramas por mililitro de POPC em clorofórmio em um frasco de fundo redondo de vidro. Evapore o clorofórmio sob um fluxo suave de gás nitrogênio em uma câmara de exaustão.Seque os lipídios remanescentes durante a noite em um dessecador a vácuo. Em seguida, dissolva o lipídio seco em 200 microlitros de tampão padrão MSP enriquecido com colato de sódio 100 milimolar como detergente. Agite a mistura em vórtex até ficar transparente para obter uma suspensão de POPC 50 milimolar em tampão.Em seguida, lave cinco gramas de esferas hidrofóbicas com 30 mililitros de metanol a 100%, depois com 40 mililitros de água ultrapura e, finalmente, com 10 mililitros de tampão padrão MSP. Armazene as esferas sob 15 mililitros de tampão padrão a quatro graus Celsius. Em seguida, combine 190 microlitros de uma solução de 0,124 milimolar de MSP1E3D1 e 61,5 microlitros de uma suspensão de 50 milimolar de POPC em tampão, resultando em uma proporção molar de um para 130 de MSP para POPC e uma concentração de colato de sódio de 25 milimolar.A proporção ideal de lipídio por MSP varia conforme o tipo de lipídio e o MSP escolhidos, devendo ser otimizada para obter uma preparação homogênea de nanodiscos. Incube a mistura em gelo úmido por uma hora. Em seguida, adicione a solução a um tubo contendo 0,5 gramas de grânulos hidrofóbicos lavados por mililitro da mistura de reconstituição para iniciar a autoagregação dos nanodiscos.Incube a mistura a quatro graus Celsius por 16 horas, com sete a oito rotações por minuto. Após a incubação, deixe os grânulos sedimentarem por gravidade. Remova e armazene o sobrenadante a quatro graus Celsius até o momento de realizar a cromatografia de exclusão por tamanho.Antes da cromatografia de exclusão por tamanho, centrifugue a mistura a 13.000 g durante 10 minutos a quatro graus Celsius. Decante o sobrenadante e descarte o precipitado. Equilibre uma coluna de cromatografia de exclusão por tamanho com tampão padrão MSP até que a linha de base em 280 nanômetros esteja estável.Injete o sobrenatante na coluna e colete o produto em frações de 0,5 mililitro. Meça a absorbância das frações a 280 nanômetros com um espectrofotômetro UV-vis. Calcule a concentração dos nanodiscos utilizando o coeficiente de extinção molar para a MSP escolhida.Para realizar a eletroforese em gel não desnaturante, primeiro misture 15 microlitros da amostra com cinco microlitros do tampão de carga apropriado. Encha o tanque catódico com tampão catódico leve e o tanque anódico com tampão de corrida. Carregue a amostra em um gel Bis-Tris de 4 a 16% e inicie a corrida.Manche o gel de acordo com as instruções do fabricante do gel. Para iniciar a preparação de um complexo proteico monotópico em nanodisco com cinco lipoxigenase como proteína, prepare um lote de tampão padrão MSP enriquecido com cloreto de cálcio 1,5 milimolar. Expresse e purifique a proteína 5LO.Prepare imediatamente uma mistura de 100 microlitros contendo 0,8 micromolar de 5LO e 0,8 micromolar de nanodiscos em tampão padrão MSP enriquecido com cálcio. Nosso exemplo de uma protease monotópica, a cinco lipoxigenase, depende das quantidades de cálcio para se ligar à membrana. A 5LO é altamente sensível e deve ser usada dentro de algumas horas após a preparação.Incube a mistura em gelo por 10 minutos. Armazene a amostra resultante do complexo proteico em nanodiscos a quatro graus Celsius por até um mês. Para iniciar o preparo para a análise por MET, dissolva um grama de sal de fosfotungstato de sódio em 50 mililitros de água ultrapura à temperatura ambiente.Ajuste o pH da solução para 7,4 com uma solução molar de hidróxido de sódio. Filtre a solução de fosfotungstato de sódio através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetro e armazene a solução em temperatura ambiente. Em seguida, realize uma descarga de brilho em uma grade de cobre revestida com carbono de 400 mesh por 20 segundos a 30 miliampères para tornar a superfície da grade hidrofílica.Coloque entre 2,5 e cinco microlitros da amostra do complexo proteico monotópico em nanodisco sobre a grade e deixe a amostra repousar por 30 segundos. Em seguida, use papel filtro para remover a solução em excesso da grade. Aplique imediatamente uma gota de solução de fosfotungstato de sódio e deixe a solução repousar por 30 segundos.Remova a solução em excesso e deixe a grade secar ao ar. Realize microscopia eletrônica de transmissão com uma voltagem acelerada de 120 a 200 quilovolts. Exclua imagens que mostrem pilhas longas do processamento subsequente de imagens.Para as imagens selecionadas, utilize métodos padrão de processamento para determinar as médias das classes e gerar um modelo tridimensional de baixa resolução da proteína monotópica em nanodisco. Utilizando este método, nanodiscos vazios foram preparados numa proporção de um para 130 de proteínas de sustentação da membrana em relação aos lipídios. Apenas um pico principal foi observado durante a cromatografia de exclusão por tamanho e apenas uma banda foi observada na eletroforese em gel nativo azul.Quando os nanodiscos vazios são tratados com uma solução de sal de fosfotungstato de sódio, ocorre a formação de pilhas. Essas pilhas longas podem então ser observadas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). A formação de pilhas não foi interrompida pela inclusão de íons cálcio na solução de nanodiscos antes da aplicação da solução de fosfotungstato de sódio.Quando uma proteína monotópica, como a 5-lipoxigenase, está ligada à superfície do nanodisco, o empilhamento é impedido pela obstrução estérica causada pela proteína. Ambos os lados do nanodisco estão disponíveis para ligação, permitindo a formação de complexos de nanodisco 5LO na proporção de um para um e dois para um. A amostra de complexos de nanodisco 5LO na proporção dois para um exibiu menos empilhamento do que a amostra na proporção um para um.A ligação da 5LO requer a presença de íons cálcio. Isso foi confirmado pela observação de empilhamento em uma mistura de 5LO e nanodiscos sem cálcio, o que indicou que a 5LO não havia se ligado às superfícies da membrana. Uma vez que a proteína monotópica e os nanodiscos forem preparados, a avaliação da ligação da proteína à sua membrana pode ser realizada em uma tarde, desde que seja feita corretamente.Ao realizar este procedimento, é importante estimar a área da proteína no nanodisco para escolher o comprimento correto da MSP. Para tamanhos bem compatíveis, no máximo duas proteínas extrínsecas podem se ligar, uma em cada lado do disco. Também é importante que o sal de sódio do fosfotungstato seja usado para o contraste negativo, garantindo empilhamento máximo, já que a ligação é confirmada pela comparação da ausência de empilhamentos com os longos empilhamentos de uma amostra sem uma proteína monotópica.O uso de nanodiscos em vez de lipossomos permite a utilização de espalhamento dinâmico de luz e espalhamento de raios X em ângulo pequeno para responder perguntas adicionais sobre a homogeneidade da amostra, tamanho ou estrutura molecular. A estrutura tridimensional de baixa resolução de uma proteína de membrana monotópica ligada a um nanodisco poderia ser um primeiro passo facilmente acessível no caminho para a estrutura de alta resolução dessas proteínas ligadas.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Aprenda a visualizar proteínas de membrana extrínsecas em nanodiscos por microscopia eletrônica de transmissão com coloração negativa. Esta técnica revela interações proteína-membrana e auxilia no desenvolvimento de fármacos.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

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