Quantificação da Distribuição de Glicogênio Subcelular em Fibras Musculares Esqueléticas usando Microscopia eletrônica de transmissão
7 de fevereiro de 2022
Um procedimento pós-fixação modificado aumenta o contraste das partículas de glicogênio no tecido. Este artigo fornece um protocolo passo-a-passo descrevendo como lidar com o tecido, conduzir a imagem e usar métodos esterológicos para obter dados imparciales e quantitativos sobre a distribuição de glicogênio subcelular específico do tipo de fibra no músculo esquelético.
A medida do teor de glicogênio em células únicas e organizações subcelulares é importante porque, na maioria dos tipos de células, as células únicas se adaptam de forma diferente às mudanças nas condições fisiológicas e doenças. Então, a principal vantagem desta técnica é a resolução muito alta no microscópio eletrônico de transmissão. Isso melhora a possibilidade de ter estruturas subcelulares localizadas e também neste conteúdo nesta técnica aqui, é importante que a coloração de glicogênio seja livre de anticorpos.
Então, não temos nenhuma especificidade para nos preocuparmos. Para obter um melhor contraste sobre o glicogênio, basta usar ferrocidato de potássio 1,5% em vez de ferrocianida de potássio. Prepare 1,6 mililitros da solução fixa primária adicionando 2,5% de glutaraldeído em 0,1 amortecedor de cacodilato de sódio molar em um tubo de microcentrificação de dois mililitros.
Guarde-o a 5 graus Celsius por um máximo de 14 dias. Isole uma pequena amostra da biópsia muscular ou músculo inteiro que tenha um diâmetro máximo de um milímetro em qualquer direção e seja mais longo do que transversalmente. Coloque a amostra no tubo contendo a solução de fixação primária fria.
Guarde-o a 5 graus Celsius por 24 horas. Em seguida, lave a amostra quatro vezes em 0,1 amortecedor de cacodilato de sódio molar. Usando pipetas de transferência, remova o tampão usado do tubo deixando a amostra intocada e adicione o tampão fresco.
Pós-fixar a amostra com 1%de tetroxida de ósmio e ferrocianida de potássio de 1,5% em 0,1 tampão de cacodilato de sódio molar por 120 minutos a quatro graus Celsius. Enxágüe o espécime duas vezes em água dupla destilada à temperatura ambiente. Desidratar submergindo em uma série de etanol classificado à temperatura ambiente.
Infiltrar-se no espécime com óxido de propileno e misturas epósdicas de resina a temperatura ambiente usando as razões de volume mencionadas. No dia seguinte, incorpore espécimes em resina esídica 100% fresca em moldes e polimerize a 60 graus Celsius por 48 horas. Monte o bloco de um espécime no suporte ultramicroome.
Corte o bloco na superfície com uma lâmina de barbear para atingir o nível do tecido. Monte uma faca de diamante na frente da amostra e alinhe a superfície da amostra paralelamente à faca. Produza uma seção semifina de uma espessura de micrômetro com a faca de diamante para verificar a orientação da amostra.
Colora a seção semifina com azul toluidina para observação com microscopia leve. Em seguida, corte ainda mais o bloco para reduzir a área de interesse para obter seções ultrathin adequadas. Corte de 60 a 70 seções de ultrathina de espessura de 60 a 70 nanômetros com uma segunda faca de diamante.
Colete de uma a duas seções em uma grade de cobre inteira usando um loop perfeito. Para contrastar as seções, mergulhe as grades em solução de acetato deuranyl por 20 minutos e lave as grades em água dupla destilada e, em seguida, mergulhe as grades em citrato de chumbo por 15 minutos e relave as grades em água dupla destilada. Ligue o computador de microscópio eletrônico de transmissão e o software de gravação de imagens, grave imagens digitais com uma câmera CCD de varredura lenta digital e o software de imagem associado.
Depois de inserir a grade com várias seções no estágio do microscópio, trive a grade inicialmente em baixa ampliação para escolher as seções de melhor qualidade e determinar a direção das fibras musculares. Em seguida, a imagem na ampliação acima de 30.000 com o feixe centrado em uma fibra periférica na seção e registra imagens com um segundo tempo de exposição na ampliação desejada. Certifique-se de que as imagens estão distribuídas através do comprimento e largura da fibra em uma ordem sistemática de bot randomizada para obter resultados imparciales e repetir a imagem até que seis a 10 fibras sejam imagens.
Importe imagens para a imagem J clicando no arquivo seguido de abertura. Defina escala global para corresponder ao tamanho original da imagem clicando em analisar e, em seguida, definir escala. Para ampliar 100% clique na imagem, vá para zoom e clique em dentro.
Meça a espessura de um disco Z por imagem do espaço miofibrilar usando a ferramenta de linha reta do menu de ferramentas e calcule a espessura média do disco Z de cada uma das seis a 10 fibras. Use a ferramenta de linha segmentada para medir o comprimento do myofibril externo mais visível logo abaixo da região subsarcolemmal. Para inserir uma grade, clique em analisar, selecione ferramentas e selecione grade.
Agora coloque a área por ponto em 32.400 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos dentro do comprimento disponível nas 12 imagens subsarcolemmal onde uma cruz atinge o glicogênio subsarcolemmal. Insira uma grade clicando em analisar, em seguida, selecione ferramentas, seguidas por grade e área de configuração por ponto em 160.000 nanômetros quadrados.
Conte o número de acessos nas imagens miofibrilares 12 onde um cruzamento atinge o espaço intramyofibrilar. Em seguida, novamente, para inserir uma grade, clique em analisar, selecione ferramentas e selecione grade. Agora coloque a área por ponto em 3.600 nanômetros quadrados.
Conte o número de acertos nas imagens de miofibrilar 12 onde um cruzamento atinge o glicogênio intramyofibrilar. Insira uma grade clicando em analisar, em seguida, selecione ferramentas, seguido de grade e definir área por ponto em 32,400 nanômetros quadrados. Conte o número de acertos nas imagens de 12º miofibrilar onde um cruzamento atinge o glicogênio intermyofibrilar.
Usando a grade de 32.400 nanômetros quadrados para escolher aleatoriamente as partículas de glicogênio, comece com o quadrado superior esquerdo e mova-se para a esquerda, se necessário. Utilizando a ferramenta de linha reta, meça o diâmetro de cinco partículas de glicogênio escolhidas aleatoriamente de cada piscina para cada uma das 12 imagens para obter uma média de 60 partículas por piscina por fibra. Esta figura mostra os valores normais das três piscinas de glicogênio.
Observa-se que os valores de glicogênio intermyofibrilar são distribuídos perto do normal, enquanto tanto o glicogênio intramyofibrilar quanto o glicógeno subsarcolêmal apresentam distribuição distorcida onde as fibras às vezes têm uma quantidade excessiva de glicogênio. Entre todas as etapas é muito importante usar ferrocidaide de potássio. A análise do glicogênio pode ser combinada com a análise de mitocôndrias e gotículas lipídicas que podem melhorar nossa compreensão de como outros componentes metabólicos chave se correlacionam com a saúde glicogênio e muscular.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um procedimento pós-fixação modificado que melhora o contraste das partículas de glicogênio no tecido. O protocolo detalha o manuseio do tecido, técnicas de imagem e métodos estereológios para quantificar a distribuição do glicogênio no músculo esquelético.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Histologia
Contexto
- A medição do conteúdo de glicogênio é crucial para entender as respostas celulares às mudanças fisiológicas.
- Células individuais exibem adaptações variadas às condições e doenças.
- Imagens de alta resolução são essenciais para observar estruturas subcelulares.
- A técnica evita problemas de especificidade usando coloração de glicogênio sem anticorpos.
Propósito do Estudo
- Melhorar o contraste das partículas de glicogênio em amostras de tecido.
- Fornecer um protocolo detalhado para imagem e análise.
- Obter dados imparciais sobre a distribuição de glicogênio no músculo esquelético.
Métodos Utilizados
- Procedimento pós-fixação modificado com ferrocianeto de potássio.
- Preparação da solução fixadora usando glutaraldeído e tampão de cacodilato de sódio.
- Microscopia eletrônica de transmissão para imagem de alta resolução.
- Métodos estereológios para análise quantitativa.
Principais Resultados
- Contraste melhorado das partículas de glicogênio foi alcançado.
- Protocolo permite a imagem precisa de estruturas subcelulares.
- Quantificação imparcial da distribuição de glicogênio foi demonstrada.
- Técnica é aplicável a vários tipos de tecido.
Conclusões
- O procedimento modificado melhora significativamente a visualização do glicogênio.
- Fornece um método confiável para estudar o glicogênio no músculo esquelético.
- Facilita uma melhor compreensão das adaptações celulares.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This TEM-based glycogen quantification method enables high-resolution subcellular analysis critical for de-risking metabolic target hypotheses in skeletal muscle. By resolving glycogen distribution across distinct subcellular compartments, it provides mechanistic insights that improve predictive confidence in preclinical models of metabolic disease. The approach supports early discovery workflows requiring subcellular phenotyping and biomarker alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of glycogen storage patterns to clarify metabolic pathway involvement in disease models.
- Operational Value: Provides subcellular resolution to distinguish artifactual from biologically relevant glycogen accumulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative ultrastructural data (volume fraction, particle diameter) for assay standardization across subcellular glycogen pools.
- Operational Value: Supports development of reproducible, antibody-free staining protocols compatible with high-throughput EM imaging.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links subcellular glycogen distribution to mitochondrial and lipid droplet morphology for integrated metabolic phenotyping.
- Operational Value: Enables cross-comparison of glycogen dynamics in disease-relevant skeletal muscle models prior to preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows where subcellular metabolic phenotyping informs target validation and lead identification decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing non-uniform glycogen storage that challenges homogeneous assumptions in metabolic modeling.
- Screening: Delivers quantitative glycogen readouts (volume fraction, particle size) enabling comparison across genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Employs stereological grid-based counting to generate unbiased, statistically robust estimates of glycogen distribution.
- Translational Research: Connects glycogen ultrastructure to organelle morphology, supporting biomarker alignment in metabolic disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized TEM workflow for subcellular glycogen quantification applicable across multiple skeletal muscle studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by resolving glycogen heterogeneity at the subcellular level.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized fixation, staining, and stereological analysis protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing subcellular metabolic context that complements bulk biochemical assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on subcellular glycogen phenotypes in disease models.
Implementation Considerations
- Expertise in TEM sample preparation, ultramicrotomy, and stereological analysis is required.
- Access to transmission electron microscopy with digital imaging capabilities and image analysis software (e.g., ImageJ) is essential.
- Standardization across teams requires adherence to fixed staining concentrations (e.g., potassium ferrocyanide 1.5%) and grid-based counting parameters.
- Adaptation to other muscle fiber types or tissue systems may require optimization of sectioning and staining protocols.
- Methodological limitations include sampling bias if fiber orientation or section distribution is not randomized, as noted in the protocol.
