Avaliação da Viabilidade Neuronal Utilizando Coloração Dupla de Iodeto de Diacetate-Propidium de Fluoresceína em Cultura de Neurônio de Granulado Cerebelar

O objetivo geral deste procedimento é medir com precisão a viabilidade celular em uma cultura de neurônios de grânulos cerebelares. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neurociência e neurofarmacologia. A principal vantagem dessa técnica é que podemos distinguir células gliais indesejadas de neurônios em culturas de células MISTA.

Demonstrando os procedimentos estarão Lin Jiajia, Wang Jialing, Xu Dilin, três alunos de graduação do meu laboratório. Comece a dissecar as cabeças de filhotes de ratos de oito dias inserindo primeiro uma tesoura no forame magno e cortando os dois lados do crânio, das orelhas aos olhos. Em seguida, use uma pinça para levantar o crânio.

Use uma pinça para isolar o cerebelo e coloque-o em um prato de 35 milímetros contendo solução de dissecação. Transfira a placa para o estágio do microscópio de dissecação e use dois pares de pinças para remover as meninges e vasos sanguíneos. Use uma lâmina para cortar os tecidos e, em seguida, transfira o tecido para um tubo de centrífuga contendo 30 mililitros de solução de dissecação.

Centrifugar durante cinco minutos à temperatura ambiente a 1 500 x g. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e guardar o sedimento. Em seguida, adicione a solução de tripsina ao pellet e ressuspenda agitando suavemente.

Em seguida, coloque o tubo em banho-maria a 37 graus Celsius por 15 minutos. Após 15 minutos, adicione uma solução de DNase One, inibidor de tripsina de soja e sulfato de magnésio e agite. Em seguida, centrifugue durante cinco minutos à temperatura ambiente a 1 500 x g.

Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em uma solução menos diluída de DNase One, inibidor de tripsina de soja e sulfato de magnésio. Em seguida, prepare dois tubos de 15 mililitros. Coloque metade das células em cada tubo e pipete para cima e para baixo 60 a 70 vezes usando uma pipeta Pasteur com algodão para homogeneizar as células.

Após a homogeneização, adicione três mililitros de solução de sulfato de magnésio e cloreto de cálcio a cada tubo de 15 mililitros. Deixe os tubos descansarem em temperatura ambiente por 10 minutos. Decorrido o tempo, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta Pasteur com algodão e transfira para novos tubos de 15 mililitros.

Centrifugue durante cinco minutos à temperatura ambiente e 1 500 x g. Adicionar meio de cultura ao pellet para diluir até uma densidade celular de cerca de 1,5 x 10 elevado às sextas células por mililitro. Pipete as células em uma placa de 6 poços e cultive na incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Após 24 horas, adicionar a solução-mãe de AraC a uma concentração final de um milimolar para inibir o crescimento das células gliais antes de retornar as placas à incubadora. Então, no sétimo dia, adicione 50 microlitros à solução estoque de D-glicose até uma concentração final de um milimolar. Comece a coloração misturando diacetato de fluoresceína a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e iodeto de propídio a uma concentração final de 50 microgramas por mililitro e 10 mililitros de PBS.

Misture a solução FDA / PI por vórtice e coloque no gelo. Coloque a placa de cultura no gelo. Aspire cuidadosamente o meio de cultura sem tocar nas células com a ponta da pipeta e, em seguida, adicione lentamente o PBS frio.

Aspire o PBS e, em seguida, adicione a solução de trabalho Fria FDA/PI ou FDA/PI Hoechst. Coloque o prato no gelo por cinco minutos. Em seguida, depois de aspirar a solução de trabalho FDA/PI ou FDA/PI/Hoechst, adicione PBS frio a cada poço.

Certifique-se de que o microscópio fluorescente esteja configurado corretamente. Detecte as emissões fluorescentes para FDA, PI e Hoechst em 520, 620 e 460 nanômetros, respectivamente, usando um tempo de exposição entre 100 e 300 milissegundos e um ganho analógico de 2,8 x. Depois de coletar imagens de fluorescência, tire uma imagem sob luz normal usando o modo de contraste de fase.

Para coloração dupla FDA/PI, sobreponha as imagens das células arrastando a camada positiva da FDA sobre a camada positiva do PI no software de edição de gráficos. Ajuste a opacidade da camada positiva da FDA inserindo 50% no campo Opacidade do painel Camadas. Mescle duas camadas abrindo o menu Camada e clicando no botão Mesclar visível.

Defina o contraste das imagens sobrepostas inserindo 50 no campo Contraste em Imagem, Ajustes, Brilho/Contraste. Verifique se não há células duplamente positivas FDA e PI nas imagens de sobreposição. Para a coloração tripla FDA/PI/Hoechst, sobreponha as imagens das células arrastando novamente a camada positiva da FDA sobre a camada positiva do PI, ajustando a opacidade da camada positiva da FDA e mesclando as imagens como antes.

Em seguida, arraste a camada positiva de Hoechst na camada mesclada. Ajuste a opacidade da camada positiva Hoechst inserindo 50% no campo Opacidade do painel Camadas e mescle as duas camadas abrindo o menu Camada e clicando no botão Mesclar visível. Distinguir visualmente células gliais grandes e irregulares de neurônios granulares cerebelares, comparando as imagens tiradas no modo fluorescente com aquelas tiradas no modo de contraste de fase.

As imagens a seguir mostram que tanto os neurônios pequenos quanto as células gliais grandes e irregulares estão presentes na cultura de CGN. Esta imagem mostra a coloração amino GAP-43 de uma cultura de CGN em oito dias in vitro. As setas azuis indicam neurônios.

Aqui, a coloração GFAP amino das células gliais é mostrada. A seta branca indica uma célula glial. Esta imagem de contraste de fase mostra a morfologia das células.

A coloração com gancho FDA / PI, que pode distinguir células gliais de neurônios, é vantajosa para a avaliação precisa da viabilidade neuronal na cultura de CGN. Esta é uma imagem mesclada de células coradas triplamente cultivadas em meio de crescimento normal. A seta mostra uma célula glial típica.

Aqui, uma cultura semelhante foi tratada com meio contendo baixo teor de potássio, e a seta novamente indica uma célula glial típica. Além disso, observe o aparecimento de coloração de iodeto de propídio vermelho. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em duas horas se for executada corretamente.

Uma estratégia semelhante pode ser aplicada a outras culturas de células mistas, como culturas corticais primárias e culturas primárias do hipocampo para analisar com precisão a viabilidade neuronal.