Name: Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Aprenda a medir fluxos de prótons gerados pelo trocador sódio-hidrogênio (NHE) usando microeletrodos seletivos de prótons combinados com patch clamp de célula inteira. Este método oferece maior sensibilidade e controle do ambiente intracelular.

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Os autores gostaria de agradecer Eric Fishback (Universidade de Des Moines, Des Moines, Iowa, EUA) pela ajuda com gravação e edição de vídeo. As células de fibroblastos, como PS120 estàvel expressando NHE3-wt ou NHE3-YRK foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, EUA).

Nota: Dois amplificadores são necessárias para gravar a atividade dos transportadores de electroneutral por uma auto-referência ISE em conjunto com o patch de aperto, um amplificador de braçadeira do remendo para manter a célula em uma configuração de células inteiras e um (amplificador de alta impedância eletrômetro) para registrar a atividade de transporte através do ISE (ver tabela de materiais). O amplificador de braçadeira do remendo está directamente ligado ao terminal da placa de aquisição. O eletrômetro é ligado ao amplificador diferencial utilizado para filtrar e amplificar o sinal. O amplificador diferencial é conectado ao terminal da placa de aquisição. Capmeter, software de braçadeira do remendo que monitora a capacidade da pilha, tem sido utilizado em anteriores estudos20 (consulte a tabela de materiais). As soluções de câmara e perfusão de gravação são mantidas a 37 ° C.
1. preparação de pipetas para ISEs
<ol><li>Puxe as pipetas de vidro de borosilicato capilares para um diâmetro exterior de 1,2 mm (ver Tabela de materiais) usando a pipeta extrator2 .</li>
	<li>Polir a pipeta usando o microforge. O diâmetro da ponta da pipeta deve ser 2-3 µm.</li>
	<li>Coloque as pipetas em um suporte de frasco para pipetas com a ponta da pipeta virada para cima (veja a Tabela de materiais). Atenção: Execute etapas 1.4-1.6 em uma coifa química bem ventilada.</li>
	<li>Misture a mistura de siliconização que é composta de 1 gota (~ 150 µ l) de bis (dimetilamino) dimetil silano e 10 gotas de tetracloreto de carbono (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Despeje a mistura de siliconização dentro do frasco e feche a tampa firmemente.</li>
	<li>Incube o frasco com a mistura de siliconização por 24-48 h em uma coifa química à temperatura ambiente até que a mistura é completamente evaporada.</li>
	<li>Aterramento a pipeta com a resina de íon seletivo apropriada para criar uma coluna de aproximadamente 2-4 mm. Nota: Ionóforo de hidrogênio eu cocktail B pode ser atividade de gravação usedfor NHE (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Toque a ponta da pipeta para distribuir a resina íon-seletivo para a ponta e coloque a pipeta verticalmente no suporte do frasco com a ponta da pipeta para baixo.</li>
	<li>Pronto o dissecação microscópio que o coquetel de resina atingiu o fim da ponta. Se necessário, aplica uma pressão positiva para empurrar a resina para o efeito.</li>
	<li>Aterramento da metade-pipeta com a solução apropriada (~ 100 μL). Aqui, use 100 mM KCl e 10 mM HEPES pH 7.0 se usando ionóforo eu b cocktail.</li>
	<li>Conectem o ISE no eletrômetro e colocar a ponta do ISE na solução de banho usada para gravação. O eletrômetro de zero.</li>
	<li>Testar o H+-resposta seletiva de ISE, alterando o pH da solução de banho. O médio H+-seletivo ISE resposta é ~ 58 mV por unidade de pH.</li>
	<li>Avalie periodicamente a resposta ISE para calibração.</li>
</ol>2. preparação de Patch Clamp pipetas para gravação
Nota: Recomenda-se o método descrito por Donald Hilgemann, em seu artigo na gravação do Single-Channel21 .
<ol><li>Puxe as pipetas para patch gigante de capilares de vidro de borosilicato (mmOD 2.0 / 1.5 mm ID) em pipeta extrator2,22,23.</li>
	<li>Use uma microforge montada no palco de um microscópio invertido para fazer uma ampla pipeta ponta (22-10 μm)23. Derreter um grânulo (~ 0,5 mL) de vidro macio sobre o arame grosso de platina do microforge. Nota: Um fio de platina relativamente grosso é necessário (~0.5 mm), para fabricar pipetas remendo gigante.</li>
	<li>Posicione a pipeta de remendo perto do grânulo de vidro macio e aplique calor cheio até a ponta começa a diminuir. O fio de platina se moverá ligeiramente em direção a centerduring de aquecimento.</li>
	<li>Desligue o fogo e empurre a ponta da pipeta dentro do grânulo de vidro amolecida. O fio de refrigeração vai retrair e quebrar a ponta da pipeta.</li>
	<li>Reaplica o calor para suavizar a ponta da pipeta e criar uma ponta de pipeta do diâmetro desejado. O diâmetro da ponta é dependente do tamanho da célula para ser remendado (8-10 μm neste estudo).</li>
</ol>3. preparação de células
<ol><li>Aquecer a solução salina de tampão de fosfato (PBS) sem Ca2 + e Mg2 +, solução de tripsina-EDTA e meio de crescimento para a 37 ° C.</li>
	<li>Células lave duas vezes com PBS. Use 1 mL de tampão de para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm.</li>
	<li>Adicione 0,5 mL de tripsina às células para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm. Nota: Quando as células começam a reunir, agitar a placa para de anexar as células.</li>
	<li>Pare a ação da tripsina pela adição de 5 mL (quantidade para placa de cultura de células de diâmetro de 35 mm) de meio de cultura completo suplementado com 10% de soro fetal bovino. Nota: O tempo de reação em tripsina é o tipo de célula dependente.</li>
	<li>Coloca as células em um shaker com rock para evitar a formação de aglomerados.</li>
	<li>Use as células para até 2 h após tripsinização. Nota: O tempo pode variar conforme a linha celular.</li>
</ol>4. preparação de um sistema de perfusão Intrapipeta
<ol><li>Cortar um tamanho apropriado do tubo de quartzo (150 µm OD / 75 µm ID) para preparar a linha de perfusão intrapipeta.</li>
	<li>Inserir um lado do tubo de quartzo em uma ponta da pipeta 200 µ l. Cole o tubo de quartzo para a ponta e corte a extremidade da ponta com uma lâmina afiada.</li>
	<li>Conecte a linha de perfusão (tubo de quartzo colado à ponta) para um pequeno pedaço de tubo de silicone que serviria como um reservatório para a solução de perfusão intrapipeta.</li>
	<li>Conecte o tubo de silicone com uma seringa para criar pressão positiva.</li>
	<li>Inserir a extremidade livre do tubo de quartzo através do tubo de polietileno do titular da pipeta da perfusão de porta (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Avalie a linha de perfusão com a solução da pipeta.</li>
</ol>5. preparação de soluções
<ol><li>Prepare uma solução fortemente a tamponada pipeta para gravação NHE (aspartato de potássio 115 mM (KAsp), 1mm EGTA, 0.5 mM MgCl2, 10mm Mg-ATP, 12,5 mM HEPES, tubos de 12,5 mM, 12,5 mM MOPS e 12,5 mM MES, pH 6.0 ajustado com ácido aspártico). Nota: Prepare a solução de estoque pipeta e filtro. Adicione Mg-ATP antes da gravação.</li>
	<li>Prepare uma solução de banho fresco cada vez (140 mM de NaCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2e 0,1 mM Tris-HCl pH 8,2).</li>
</ol>6. gravação da actividade de transportador
<ol><li>Manter a câmara de gravação e todas as soluções a 37 ° C, porque a atividade de transporte é dependente da temperatura.</li>
	<li>Coloque as pilhas dentro da câmara de gravação. Espere até cair para o fundo da câmara, mas não deixe que eles anexar à câmara.</li>
	<li>Escolha uma célula apropriada. Medir o diâmetro da célula com o micrômetro ocular. Escolha células com diâmetros semelhantes. Nota: Geralmente, terá uma grande célula superfície mais celular e possivelmente mais transportadores expressos em sua membrana plasmática, assim também com mais actividade de transportador. No entanto, isto não é necessariamente correto, como atividade de transporte depende do transportador específico e o tipo de célula em estudo.</li>
	<li>Montar a pipeta de microeletrodos íon-seletivo para o micromanipulador, aterre a remendo-aperto pipeta com a solução intracelular, certifique-se de que a solução atinja a ponta da pipeta2. Nota: Ele pode requerer várias torneiras suaves para eliminar bolhas na ponta da pipeta.</li>
	<li>Monte a pipeta remendo-aperto para a fase principal da eletrofisiologia configurar2,22,23. Nota: É importante manter o palco principal no sobre um ângulo de 45 graus para o eixo horizontal, como isso garante um ângulo de entrada para a pipeta que é adequado para a formação de um selo altamente resistente.</li>
	<li>Aplicar uma pequena pressão positiva (~ 5 cm H2O) para a pipeta de remendo para reduzir a possibilidade de bloquear a ponta e colocá-lo na solução de banho.</li>
	<li>Pare de mexer a pipeta de braçadeira do remendo, uma vez que a ponta está perto da célula.</li>
	<li>Aliviar a pressão positiva enquanto pipeta toca o celular e aplique uma ligeira pressão negativa (~ 5 cm H2O) para obter um &gt; 1000 pipeta de selo MΩ (um Giga-ohm) na membrana celular, com o patch23.</li>
	<li>Coloque a pipeta de remendo com a célula no mesmo plano focal como o ISE, e desloque a pipeta de remendo com a célula em proximidade com o ISE (~ 5-10 µm)2,5 evitar mas permitindo que a célula para entrar em contato com o ISE (figura 1A).</li>
	<li>Assegurar-se de que o potencial de exploração seja 0 mV.</li>
	<li>Rompa o selo com uma série de condutas curtas para obter a configuração de células inteiras.</li>
	<li>Mova o ISE (ou pipeta de braçadeira do remendo) lentamente, esquerda-direita ou acima-abaixo para registrar a atividade do transportador (figura 1B).</li>
	<li>Registrar picos de pelo menos 5-8 (Figura 1, de A para B).</li>
	<li>Aplicam-se as perturbações da onda quadrada durante a gravação para monitorar a qualidade do selo e a capacitância de membrana celular (Figura 1).</li>
	<li>Estimar o fluxo de H+ (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">) da diferença na concentração de H+ livre entre a superfície da pilha e a solução em massa (ΔH+) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq3v2.jpg"> Nota: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq4.jpg"> e <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq5.jpg"> h+ e coeficientes de difusão de buffer, respectivamente, BT é a concentração total do amortecedor, KD é a constante de dissociação do buffer, r é a célula raio, e <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq6.jpg"> determina a mudança de estado estacionário da concentração de limite H+ para uma pequena mudança na enciclopédia H+. H+ indica um próton livre na solução. Para ser consistente com estudos anteriores, H+ fluxos são convertidos em unidades de fluxo eletrofisiológicos calculando os equivalentes atuais dos fluxos luminosos (<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56630/56630eq1.jpg">/faraday) em pA3,5].</li>
	<li>Normalize o fluxo de prótons à superfície da célula que pode ser calculada a partir do tamanho da célula ou para a capacitância de membrana.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.

Apesar das funções cruciais de transportadores, os métodos disponíveis para estudar sua atividade são inadequado e ineficaz. Uma limitação é que os métodos disponíveis medem o movimento de iões mediado pela atividade de transporte, sem considerar as flutuações na composição iônica intracelular durante o experimento4. O método apresentado garante um controle preciso de composições de íon extracelular e intracelular e oferece uma poderosa ferramenta para modificar intracelular de iões, proteínas e l...

Transporte de íons e solutos através da membrana de plasma é essencial para a sobrevivência das células e, portanto, de organismos1. Transporte seletivo de íons e solutos é alcançado por uma matriz de canal especializado e proteínas de transporte. Mutações nestas proteínas geralmente resultam em uma variedade de condições clínicas, canal e transportador proteínas alvos em potencial para o tratamento farmacológico1de renderização. Infelizmente, compreender os mecanismos subjacentes a função canal e transportador e regulamento é muitas vezes limitada pelas abordagens disponíveis para estudar sua atividade2,3,4.
Especificamente, os transportadores podem ser mais ou menos sub divididos em dois grandes grupos, dependendo se eles alterar o potencial transmembrana da célula durante o transporte de solutos: os transportadores de íons electrogenic alterando [por exemplo, fosfato de sódio- co-transportador 2a (NaPi2a), trocador de sódio-cálcio (NCX), etc.] ou os transportadores não alteram de íon electroneutral [por exemplo, o trocador de sódio-próton (NHE), co transportador de cloreto de sódio, NaPi2c, etc.]. As atividades de ambas as classes de transportadores têm sido estudadas extensivamente usando captação de isótopos radioativos e membrana-permeant fluorescente tinja2. Ambas as abordagens estimam a atividade dos transportadores medindo mudanças na concentração de íons citoplasmáticos específicos em massa, e os dois métodos têm limitações, como moderada sensibilidade e resolução de tempo e controle inadequado do intracelular Milieu. Com efeito, a atividade de muitos transportadores é dependente da concentração citoplasmática dos íons realizadas (por exemplo, NHE3, NCX), e alterações nas concentrações desses íons são esperadas para desempenhar um papel significativo na regulação da atividade de transporte2 , 3 , 5. medição precisa destes mecanismos regulador é limitada usando métodos clássicos.
Para superar essas limitações, métodos de braçadeira do remendo são utilizados para estudar a atividade de transportador2,6. Especificamente, a auto-referência eletrodos íon-seletivos (ISEs)7,8 combinada com o sistema de fixação de patch foi recentemente autorizado a medição da actividade de transporte de electroneutral3,4 , 5. ISEs são baseada no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. Um ISE movendo-se para e longe da membrana celular em um repetitivo, moda oscilatória registra uma diferença de tensão (MV). Diferenças de voltagem podem ser convertidas em valores de fluxo de iões utilizando um método de calibração que se aplica a primeira lei de Fick da difusão2,9. Enquanto ISEs são usados detectar o fluxo de íons em movimento de células, o método de braçadeira do remendo em ambas as células inteiras ou configurações de dentro para fora é usado para controlar a composição iônica intracelular e potenciais de membrana. Além disso, a aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lipídios e proteínas de3,5.
Em resumo, a versatilidade do método braçadeira remendo comparado com que outros métodos para estudar atividade de transporte fez remendo aperto apropriado para superar as limitações comuns destes outros métodos. A combinação de auto-referência ISEs e técnicas de braçadeira do remendo oferece a possibilidade única para medir a atividade dos transportadores de electroneutral em um ambiente experimental rigidamente controlado e descobrir romance biofísico e molecular Propriedades da membrana celular de transporte3,4,5. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para estudar a atividade do NHE. A família de proteínas mamífera NHE catalisa o intercâmbio líquido de electroneutral de sódio extracelular (Na+) para intracelular próton (H+)10,11 , utilizando um gradiente at+ para dentro. Nos mamíferos, a família de proteínas NHE inclui 11 proteínas relacionadas (NHE1-9 e NHA1-2) e um esperma específico NHE10,12,13.
Laiane (família SLC9a) é encontrados ubiquitously na maioria dos organismos vivos de simples procariontes para eucariontes superiores e está envolvidos em uma variedade de células vitais funções10,11, inclusive controlando a defesa de salinidade de célula em procariontes, mantendo o volume de homeostase e célula de ácido-base e regula a absorção de água e sal em vários epitélios especializados10,12,14,15. As funções biológicas chaves de laiane e a importância das suas funções foram determinados através de vários estudos; no entanto, alguns estudos têm investigado as propriedades biofísicas e moleculares de mamíferos laiane devido a limitações metodológicas4. Recentemente, a aplicação de auto-referência ISEs durante o aperto de células inteiras remendo revelou novos mecanismos moleculares de isoformas NHE regulamentadas por alterações nas concentrações intracelulares de íons, proteínas e fosfolipídios3, 4.
Especificamente, o protocolo fornecido neste manuscrito descreve os métodos e abordagens para estudar a atividade e o Regulamento de NHE isoform 3 (NHE3), um jogador importante na absorção de Na+, Cl–, HCO3– e fluido na membrana de fronteira escova do epitélio intestinal e renal14,16. Nova visão nas diferenças de sensibilidade do NHE3 atividade de remodelamento intracelular (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfato [PI (4,5) P2] e phosphatidylinositide 3, 4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) é relatado. Proteínas de transporte celular, tais como canais e transportadores, são regulamentadas pelo remodelamento17e NHE3 vincula diretamente tanto PI (4,5) P2 e P3 PI (3, 4,5)18. Com base na literatura atual, qualquer phosphoinositide pode ser relevante para a regulação fisiológica ou fisiopatológico da NHE35,18,19. Nossos resultados suportam funções separadas para PI (4,5) P2 e P3 de PI (3, 4,5) na regulação da atividade NHE3. Esta distinção foi possível graças à aplicação de técnicas ISE em combinação com gravação de braçadeira do remendo de células inteiras. Esta técnica também permite o controle do phosphoinositide conteúdo celular através da perfusão intracelular de remodelamento diferentes durante a medição da actividade NHE3.

<table><tbody><tr><td>Amplificador de grampo de remendo Molecular</td><td>Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eletrômetro diferencial de canal duplo (HiZ-223)</td><td>Amplificador diferencial Warner Instruments</td><td>64-1650</td><td></td></tr><tr><td>(DP-301)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0044</td><td></td></tr><tr><td>Software de grampo de remendo baseado em MatLab</td><td>MatLab com caixa</td><td></td> de ferramentas de aquisição <td>O software capmeter é recomendado</td></tr><tr><td>Sistema de Controle de Temperatura ThermoClamp-1</td><td> Controlador</td> de Temperatura de Canal Único para <td>Aquecedor em Linha</td><td>AutoMate Scientific 03-11-LL</td></tr><tr><td>(TC-324C)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2400</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de Vidro Borosilicato Padrão de Barril Único</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B120F-3&nbsp; &nbsp;</td><td>Usado para eletrodos seletivos de íons</td></tr><tr><td>Frasco de Armazenamento de Micropipetas</td><td>World Precision Instruments</td><td>E212</td><td></td></tr><tr><td>Bis(dimetilamino)dimetilsilano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14755-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tetracloreto de carbono</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>319961-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Ionóforo de hidrogênio I - coquetel B</td> Tubo de Borosilicato de Parede Fina <td>Sigma-Aldrich</td><td>95293</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; Instrumento Sutter</td><td>B200-156-15</td><td>Usado para pipeta de patch clamp&nbsp;</td></tr><tr><td>Vidro macio (Corning 8161 Patch Glass)</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0815</td><td></td></tr><tr><td>Tubo Capilar de Sílica (150um OD/75um ID)</td><td>Molex (Polymicro Technologies)</td><td>106815-0018</td><td>Usado para sistema de perfusão intra-pipeta</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Aspartato de potássio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4880</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Apirase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol (4,5) bifosfato diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-4508</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidilinositol 3,4,5-trisfosfato diC8</td><td>Echelon Biosciences</td><td>P-3908</td><td></td></tr></tbody></table>

aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de electro-neutro

Application of Electrophysiology Measurement to Study the Activity of Electro-Neutral Transporters

O transporte de íons através das membranas celulares garante o controle fino de ião dentro e fora da célula que é indispensável para a sobrevivência da pilha. Estes mecanismos de transporte são mediados pela actividade de proteínas de transporte especializado. Especificamente, dinâmica de pH é finamente controlada por sistemas de extrusão de prótons (H+) de membrana plasmática, tais como o at+/h+ família de proteínas de cambista (NHE). Apesar de extensos esforços para estudar os mecanismos subjacentes Regulamento NHE, nossa compreensão atual das propriedades biofísicas e moleculares da família NHE é inadequada, devido à limitada disponibilidade de métodos para medir efetivamente a atividade NHE . Neste manuscrito, usamos H+-eletrodos seletivos durante a célula inteira remendo gravação aperto para medir o fluxo induzido por NHE H+ . Propusemos que esta abordagem para superar algumas limitações do normalmente usado métodos para medir atividade NHE, como absorção radioativa e fluorescente membrana permeants. Medição de atividade NHE, usando o método descrito permite alta sensibilidade e resolução de tempo e controle mais eficiente das concentrações intracelulares de H+ . H+-eletrodos seletivos são baseado no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. H+-elétrodo seletivo do movimento até e fora da membrana celular, de forma repetitiva, oscilatória registra uma diferença de tensão que é dependente do fluxo de H+ . Enquanto H+-eletrodos seletivos são usados para detectar o fluxo de H+ , movendo-se fora da célula, o método de braçadeira do remendo na configuração da célula inteira é utilizado para controlar a composição iônica intracelular. Além disso, aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lípidos. A atividade de transportador de NHE isoform 3 (NHE3) foi medida usando esta abordagem técnica para estudar a base molecular do Regulamento NHE3 pelo remodelamento.

Uma auto-referência ISE durante a gravação de braçadeira do remendo de célula inteira foi aplicado para estudar a regulamentação da atividade de NHE3 pelo remodelamento. PS120 células de fibroblastos,24, que falta a expressão da membrana plasmática endógena laiane, foram usados. NHE3 selvagem-tipo (NHE3-wt) ou NHE3 mutantes que não vincular remodelamento [tirosina 501, 503 de arginina e lisina 505 foram substituídos com alanina, Y501A/R503A/K505A (NHE3-YRK)] estàve...

Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

The transport of ions through cell membranes ensures the fine control of ion content within and outside the cell that is indispensable for cell survival. ...

O método de manchas gigantes combinadas com microeletrodos seletivos de íons é um método versátil usado para detectar e quantificar fluxos de íons. Especificamente, é usado para medir os fluxos de prótons gerados pela atividade do transportador de íons eletroneutros, o trocador de sódio-hidrogênio ou NHE, que é expresso na membrana celular. O trocador de sódio-hidrogênio gera um gradiente de prótons nas proximidades da membrana plasmática, indicado aqui como um anel laranja.Esse gradiente de prótons através da membrana celular é medido pelo registro de patch clamp de célula inteira combinado com uma técnica que usa um microeletrodo seletivo de prótons. O microeletrodo seletivo de prótons é movido para perto da superfície celular, onde registra o fluxo de prótons saindo das células, mostrado aqui na posição A.E para longe da superfície celular, onde registra a concentração de prótons livres presente na solução indicada pela posição B.E então, de volta à posição A, perto da membrana celular, em um movimento repetitivo e oscilatório. A diferença de tensão de A para B é registrada e depende do representante da atividade do NHE.Íons transportadores, como prótons através da membrana celu

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Biologia

Existem obstáculos técnicos para a medição do fluxo de corrente através de canais iónicos simultaneamente, e mais tarde discernir o que parte da corrente transmembrana é devido a cada tipo de canal. Para atender a essa necessidade, este método apresenta uma forma para gerar a curva IV de tipos de canais individuais usando componentes de freqüência específica.

Recapitulação de um Curve Ion IV Canal Usando componentes de freqüência

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Caracterização funcional de Na<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Trocadores de intracelular compartimentos usando a Seleção Proton-matança de expressá-las na membrana plasmática

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