Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro

O método de manchas gigantes combinadas com microeletrodos seletivos de íons é um método versátil usado para detectar e quantificar fluxos de íons. Especificamente, é usado para medir os fluxos de prótons gerados pela atividade do transportador de íons eletroneutros, o trocador de sódio-hidrogênio ou NHE, que é expresso na membrana celular. O trocador de sódio-hidrogênio gera um gradiente de prótons nas proximidades da membrana plasmática, indicado aqui como um anel laranja.

Esse gradiente de prótons através da membrana celular é medido pelo registro de patch clamp de célula inteira combinado com uma técnica que usa um microeletrodo seletivo de prótons. O microeletrodo seletivo de prótons é movido para perto da superfície celular, onde registra o fluxo de prótons saindo das células, mostrado aqui na posição A.E para longe da superfície celular, onde registra a concentração de prótons livres presente na solução indicada pela posição B.E então, de volta à posição A, perto da membrana celular, em um movimento repetitivo e oscilatório. A diferença de tensão de A para B é registrada e depende do representante da atividade do NHE.

Íons transportadores, como prótons através da membrana celular, afetam o processo essencial para a vida. Portanto, as mudanças no pH são rigidamente reguladas por uma série de moléculas, incluindo o trocador de sódio-prótons, um sistema de exclusão de prótons da membrana plasmática. O microeletrodo de pH oscilante combinado com o patch clamping de células inteiras é uma nova abordagem para estudar o fluxo de prótons mediado pela atividade do trocador de sódio-prótons.

A aplicação desses métodos supera algumas das principais limitações das técnicas normalmente usadas para medir a atividade do trocador de sódio-prótons, como sensibilidade moderada e resolução de tempo e outro bom controle do ambiente intracelular. Vou fazer uma demonstração dos métodos junto com meu colaborador, Dr. Victor Babich. O Dr. Matthew Henry será o narrador.

Vamos demonstrar uma aplicação deste método medindo a atividade da isoforma três do trocador de sódio-prótons, que é um importante regulador da absorção de sal na água através do intestino e do epitílio renal. Os microeletrodos seletivos de prótons para a medição da concentração de prótons são fabricados a partir de tubos de vidro borossilicatado padrão. Os eletrodos de vidro borossilicato com diâmetro externo de 1,2 milímetro e sem filamento são puxados com um extrator vertical, usando um protocolo convencional de tração dupla.

Obtém-se uma ponta de pipeta de dois a três micrômetros de diâmetro. As pipetas são colocadas em um suporte de frasco com a ponta da pipeta voltada para cima. Em seguida, uma mistura é preparada para siliconizar as pipetas.

É colocado em uma jarra e a tampa é bem fechada. As pipetas são incubadas com a mistura de siliconização por 24 a 48 horas. Tenha cuidado, certifique-se de preparar a mistura e siliconizar as pipetas em temperatura ambiente em uma capela química bem ventilada.

Encha novamente a pipeta com a resina seletiva de íons apropriada e coloque-a cuidadosamente verticalmente em um porta-frasco com a ponta da pipeta voltada para baixo. Para se preparar para o patch clamping, comece puxando pipetas de patch clamping de vidro borossilicato de paredes finas com diâmetro externo de dois milímetros e diâmetro interno de 1,4 milímetros em um extrator vertical usando o protocolo convencional de tração dupla. Use uma microforja montada em um estágio de um microscópio invertido para fazer uma ponta de pipeta larga.

Posicione a pipeta perto do fio de platina grosso da microforja. Ligue o aquecimento usando um pedal que controla a corrente ligada e desligada. Aqueça o vidro de baixo ponto de fusão que cobre o meio do fio de platina grosso da microforja e, em seguida, mova a ponta da pipeta para perto do vidro macio derretido.

O aquecimento move o fio de platina ligeiramente para o centro. O fio de platina retorna à posição inicial e a ponta da pipeta se rompe. Repita o procedimento até obter o diâmetro desejado da ponta e, por fim, aplique calor para alisar a ponta.

As pontas da pipeta têm 10 micrômetros de diâmetro após o polimento com a microforja. Usar o fio de platina grosso é um benefício, pois há pouca expansão após ligar a eletricidade e menos possibilidade de superaquecer o fio e a pipeta com corrente excessiva. Depois que as células são dissociadas usando tripsina e a tripsinização é bloqueada, as células são mantidas em um agitador com balanço para evitar a formação de aglomerados.

Isso é feito por até duas horas após a tripsinização. A configuração da eletrofisiologia consiste em um controlador de temperatura para regular a temperatura da solução no sistema de perfusão. Todos os experimentos são realizados a cerca de 37 graus Celsius.

E um comutador de filtro óptico para controlar a roda do filtro para imagens de fluorescência. Um controlador de válvula do sistema de perfusão para regular a abertura e o fechamento das válvulas do sistema de perfusão. E o controlador de temperatura para regular a temperatura da câmara de gravação.

Um osciloscópio para observar formas de onda e um amplificador patch clamp. Um computador executando este software Capmeter. E um eletrômetro para registrar o sinal de microeletrodo seletivo de íons.

E um amplificador diferencial para amplificar o sinal do eletrômetro. A configuração de eletrofisiologia é equipada também com um microscópio invertido com controlador de estágio, dois micromanipuladores com controladores posicionados nos locais esquerdo e direito do microscópio, o sistema de perfusão com aquecedor de solução em linha. Depois que a pipeta de microeletrodo seletivo de íons for montada no micromanipulador, preencha novamente a pipeta de fixação de remendo com a solução intracelular.

Certifique-se de que a solução atinge a ponta da pipeta. Pode ser necessário vários toques suaves para eliminar bolhas na ponta da pipeta. Em seguida, monte a pipeta de fixação de remendo no estágio principal da configuração de eletrofisiologia.

Transfira suavemente as células de aparência saudável para a câmara de registro preenchida com um volume definido de solução de banho. É importante manter o estágio principal em um ângulo de 45 graus em relação ao eixo horizontal. Isso garante um ângulo de entrada para a pipeta adequado para a formação de uma vedação altamente resistente.

Enquanto a pipeta de grampo de remendo é abaixada na solução de banho, aplique uma pequena quantidade de pressão positiva na pipeta para reduzir a chance de bloquear a ponta. Selecione uma célula e aproxime-se dela com uma pequena quantidade de pressão positiva. Pare de mover a pipeta patch clamp quando a ponta estiver perto da célula.

Abaixe o microeletrodo seletivo de íons na solução do banho até que esteja no mesmo plano focal da ponta da pipeta do patch clamp. Quando a pipeta estiver posicionada centralmente sobre a célula, inicie a vedação aplicando uma pequena quantidade de pressão negativa. Um selo de mega-ohm é obtido em poucos segundos.

Certifique-se de que o potencial de retenção seja mantido pelo amplificador em zero milivolts. Por fim, rompa a membrana celular com uma série de pulsos curtos de sucção e inicie a gravação. Usando o método de registro de adesivos gigantes, é possível perfundir soluções rapidamente na pipeta de vidro por meio de um sistema de perfusão intrapipeta para modificar o conteúdo intracelular de íons, lipídios e proteínas.

Posicione a pipeta de microeletrodo seletivo de íons perto da célula presa pela pipeta de grampo de remendo e inicie a oscilação da pipeta de microeletrodo seletivo de íons movendo-a de e para a célula. A aplicação desta técnica permite estudar a regulação molecular do trocador de sódio-hidrogênio. Aproveitando o método dos adesivos gigantes, a composição intracelular de ATP e lipídios foi modificada por um sistema de perfusão intrapipeta.

A perfusão intracelular da apirase, que hidrolisa o ATP intracelular e diminui o conteúdo de fosfoinositídeos, causou uma diminuição de 50% na atividade da isoforma três do NHE. O efeito da apirase na atividade do NHE3 não foi revertido pela perfusão intracelular do fosfoinositídeo, PIP2. No entanto, foi revertida pela perfusão intracelular do fofoinositídeo, PIP3.

A medição da atividade do NHE aproveita a combinação dos métodos de microeletrodo seletivo de prótons e patch clamping. Isso permite o estudo da base molecular por trás da regulação diferencial do NHE por fosfoinositídeos e cascatas de sinais a jusante. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como medir a atividade do trocador de sódio-prótons usando um microeletrodo de pH oscilante combinado com todo o clampeamento de remendo celular.

E um exemplo de possível aplicação dos métodos.