De alta capacidade Análise de Imagem de esferóides tumorais: uma aplicação de software de fácil utilização para medir o tamanho de esferóides automaticamente e com precisão

O objetivo geral do seguinte experimento é utilizar um software de análise de imagem em alto rendimento para medir o tamanho de tumores tridimensionais S, obtidos por microscopia de campo claro. Isso é alcançado primeiramente organizando todas as imagens com o tumor tridimensional em estrutura de diretórios e nomes de arquivos corretos para o programa steroid sizer. Em um segundo passo, o steroid sizer calcula automaticamente o contorno do tumor com base no algoritmo de contorno ativo e mede o seu tamanho.

Em seguida, realiza-se uma varredura bem projetada de controle de qualidade para garantir resultados ideais em cada imagem. Após analisar o resultado nos dados, pode-se elucidar o crescimento do esteroide tridimensional sob tratamento experimental. A principal vantagem deste programa de computador é que ele integra um poderoso algoritmo automatizado de análise de imagens e um fluxo de trabalho de controle de qualidade para apoiar a análise de alto rendimento de imagens.

O software tolera fundo de imagem irregular ou com ruído. Ele reduz significativamente o trabalho manual e acelera o processo de análise. A implementação do software é benéfica para que os modelos tridimensionais de tumores se tornem um modelo in vitro rotineiro para triagens de fármacos tanto na indústria quanto na academia.

O Sphe sizer requer o MATLAB com as ferramentas de processamento de sinais e processamento de imagens. Uma ferramenta opcional para uso é o processamento paralelo. Baixe o OID sizer do servidor da Rutgers e descompacte-o em um diretório de instalação, que será necessário nas etapas subsequentes. Agora, prepare suas imagens.

Primeiro, determine a resolução da imagem do sistema de aquisição e a escala absoluta da imagem em mícrons por pixel. Em última análise, a escala de cada imagem no experimento deve ser a mesma. Certifique-se de converter quaisquer formatos de arquivo de imagem proprietários para um formato de arquivo aceito, como TIFF ou JPEG.

Agora, salve os arquivos usando nomes de arquivos e estrutura de diretórios específicos exigidos pelo software; os nomes dos arquivos devem ser nomeados por placa, linha e coluna; os diretórios de arquivos devem ser organizados como um experimento por diretório, com um único subdiretório para cada ponto de tempo do experimento. Toda imagem de cada placa em um ponto de tempo deve compartilhar um subdiretório. Comece abrindo o MATLAB e, na janela de comando, navegue até o diretório de instalação do sphe sizer.

Em seguida, digite Sphe sizer one zero e pressione enter para iniciar este programa OID sizer. Agora, clique no botão procurar na nova janela e selecione o diretório preparado com todas as imagens do experimento. Depois, no campo de texto da pasta, selecione as alternâncias incluir subpastas para controle de qualidade.

Selecione a opção de exibição on the fly. O próximo passo é especificar a resolução das imagens, o que deve ser feito para que o programa converta corretamente pixels em milímetros. Neste momento, o usuário pode acessar o menu avançado para obter mais configurações nesta caixa de cores especial.

Deixe em nenhum para imagens de oito ou 16 bits. Se as imagens forem capturadas em 12 bits, escolha 12 bits.

Após todas as configurações serem corretamente definidas, inicie o cálculo clicando em "compute", já que o cálculo será realizado para todo o conjunto de imagens. Os resultados individuais de segmentação são exibidos no software em tempo real quando o cálculo é concluído, e a tabela de resultados exibe a pasta, o arquivo, o volume, o comprimento, a largura e um indicador de validade para todas as esferas analisadas. O indicador de validade serve para controle de qualidade.

Quando o usuário clicar em qualquer célula da tabela de resultados, as imagens originais e de controle de qualidade serão exibidas no lado direito para revisão; examine todas as imagens sequencialmente usando a seta para baixo no teclado. Quando uma borda suspeita do esferoide for encontrada, refine-a clicando em inicialização manual na imagem original. Arraste a ferramenta de elipse para cobrir o esferoide de forma mais precisa.

A tabela de resultados atualizará as medições de forma correspondente. Se a inicialização manual não conseguir encontrar o limite ideal do esteroide desejado, utilize o botão de desenho manual para exibir a imagem original e traçar o contorno do esteroide. Se a imagem não contiver um esteroide válido, basta desmarcar o alternador de validade para essa imagem.

Quando o controle de qualidade for concluído, clique na caixa de resultados de formato para salvar os resultados. Os nomes dos arquivos exportados podem ser configurados na janela de opção avançada. O arquivo de saída em lista é uma tabela delimitada por tabulações que pode conter todas as medições.

O arquivo de saída no formato é uma tabela delimitada por tabulação e organiza os valores de volume no formato original da placa para facilitar a análise visual e subsequente dos dados. O Sphe sizer pode detectar o contorno das esferas nas imagens com robustez, mesmo em diversas condições desfavoráveis de imagem. Ocasionalmente, pode ocorrer uma detecção inadequada desse OID, e nesse caso a ferramenta de inicialização manual funciona permitindo ao usuário definir corretamente a localização e o tamanho desse esteroide manualmente.

Em casos extremos, o esteroide pode não ser corretamente segmentado do fundo ruidoso e distrativo automaticamente ou com a ferramenta inicializada manualmente. Nesses casos, o programa permite ao usuário desenhar manualmente o contorno do esteroide para gerar medições longitudinais e volumétricas precisas. A eficiência do software é validada analisando o mesmo conjunto de 288 imagens por meio de análise manual versus computadores de núcleo único e múltiplos núcleos.

A análise de imagem é mais de 18 vezes mais rápida por imagem utilizando o steroid sizer do que com medições manuais, demonstrando a reprodutibilidade do software. Um conjunto de 24 esteroides foi analisado três vezes por cada método. O steroid sizer, mostrado em verde, apresentou menor desvio padrão nas medições do que a análise manual.

Em um experimento viabilizado com a ajuda do sizer de esteroides, o crescimento tumoral considerado como esteroide foi testado com tratamentos do inibidor da HSP 90 e da cladribina. Os resultados mostraram que um tratamento combinado pode ter um efeito antitumoral in vivo. Este estudo apresenta um programa rápido, flexível e eficaz para a determinação precisa do tamanho de esteroides tumorais tridimensionais.

O programa de tamanho de esteróides é fácil de usar e requer entrada mínima do usuário. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar que os esteroides devem ser visualizados no centro do campo, sem tocar na borda da parede. Todas as imagens devem ser capturadas com o mesmo objetivo e todos os arquivos devem ser nomeados corretamente e organizados conforme indicado no protocolo.