Name: O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a medir a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos usando o ensaio de lactato desidrogenase. Este método confiável quantifica LDH endógeno sem necessidade de sondas artificiais.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Conselho de pesquisa da Noruega, da Universidade de Oslo, o Anders Jahre Foundation, Fundação Nansen e o legado na memória do Henrik Homan. Agradecemos o Dr. Noboru Mizushima para o ATG5 + / + MEFs e ATG5-/-MEFs, Dr. Masaaki Komatsu para o ATG7 + / + MEFs e ATG7-/-MEFs e Dr. Shizuo Akira para o ATG9A + / + MEFs e ATG9A-/-MEFs. Agradecemos Frank Sætre para assistência técnica e Dr. Per O. Seglen discussões construtivas metodológicas.

1. célula semeadura e tratamento
<ol><li>
Células aderentes de cultura em frascos de cultura de tecidos de2 75 cm numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C, usando o meio de cultura preferido para o tipo de célula em questão. Permitir que as células a crescer até atingir uma camada de célula perto confluente. Nota: Use RPMI 1640 suplementado com 10% soro bovino fetal (FBS) para LNCaP, HEK293, rato embrionários fibroblastos (MEFs), BJ, MCF-7 e as células de RPE-1.<ol>
<li>Lave as células com 3ml 37 ° C fosfato salino (PBS), pH 7,4. Substitua a PBS 3 mL 0,25% (p/v) tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar o frasco numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C, até que as células desanexar (2 – 5 min).</li>
		<li>Ressuspender as células isoladas com 7 mL de meio de cultura contendo 10% FBS. Misture uma alíquota de suspensão de células de 10 µ l com 10 µ l 0.4% Trypan azul em um tubo de microcentrifugadora, usando a ponta da pipeta 0,5 – 20 µ l. Use a ponta da pipeta mesmo para encher imediatamente um slide de câmara a contagem e contar as células em um contador automatizado de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar um adequado (ver nota abaixo) diluição da suspensão de célula de etapa 1.1.2 usando cultura médio contendo 10% FBS, sementes e 1 mL da suspensão celular diluídos em cada poço de uma placa (área de superfície ~3.8 cm2) de cultura de tecidos de 12-poços de asséptico técnica. Permita o crescimento em uma incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 ° C até a densidade da célula desejada tenha sido atingida, por exemplo, 60 – 90% confluência na colheita. Nota: A diluição adequada da suspensão celular que dará a confluência da célula desejada na colheita pode variar do tipo de célula para o tipo de célula, bem como de acordo com a duração e o tipo de tratamentos experimentais. Assim, isto deve ser avaliado empiricamente em cada caso.<ol>
<li>Para experiências que devem ser ambos trataram e colhidas 2 dias após a semeadura, semente 2,5 x 105 LNCaP, HEK293, ou MCF-7 células, 5 x 104 MEFs, 4 x 105 BJ ou 1,5 x 105 RPE-1 células em cada poço da placa 12-bem.</li>
		<li>Para as células que aderem frouxamente, revesti as placas com o tipo de revestimento recomendado para o tipo de célula em questão. Para células LNCaP (e HEK293) usar placas revestidas com poli-D-lisina (PDL).</li>
		<li>Para o efeito, adicionar 500 µ l PDL em 2,5 µ g/mL em estéril H2O para cada poço e incubar as placas em um ambiente estéril por 30 min à temperatura ambiente (20-25 ° C). Remover o PDL por sucção e lavar cada um bem brevemente com 1ml estéril H2O. Nota: Geralmente, passo 1.2.1 é feito sem quaisquer tratamentos experimentais. No entanto, se executar RNAi, pode ser conveniente iniciar uma transfecção inversa com a semeadura9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Realize tratamentos experimentais em duplicado ou triplicados poços por condição.
	<ol>
<li>Por exemplo, tratar as células com 50 nM do inibidor de mTOR Torin1, que geralmente é um eficiente indutor de sequestro de autophagic, ou submeter as células a inanição aguda do soro - e ácido aminado lavando as células com 1 mL de aminoácidos livres Earle é equilibrado Sal médio de solução (EBSS) e posteriormente, incubar as células em 1 mL de EBSS numa incubadora umidificado com 5% CO2 a 37 ° C.</li>
		<li>Deixe um conjunto de poços não for tratada, a fim de definir níveis de sedimentáveis LDH.</li>
		<li>Adicionar uma quantidade saturante do pós-sequestro inibidor bafilomycin A1 (Baf)3,13,16,18 na ausência ou presença dos tratamentos experimentais, 3 – 4 h antes de célula colheita. Incubar as células em uma incubadora umidificada com 5% CO2 a 37 ° C.<ol>
<li>Uso 100 nM Baf para LNCaP, HEK293, BJ, MCF-7 e células RPE-1 e 10 nM Baf para MEFs.</li>
			<li>Para tratamentos experimentais que têm uma duração de apenas 3-4 h (como aqueles passo exemplificado em 1.3.1 normalmente tem), adicione o Baf simultaneamente com os tratamentos. Para mais tratamentos experimentais, esperar até 3-4 h antes da colheita e adicionar 2 µ l de uma 500 x concentrado Baf estoque diretamente para o meio.</li>
			<li>Misture agitando a placa imediatamente após a adição do Baf. Neste momento também é aconselhável adicionar macroautophagic inibidores de sequestro como controles, por exemplo, 10 mM da pan-phosphoinositide 3-quinase (PI3K) inibidor 3-metil adenina (3MA)19ou 10 µM de PI3K selectivo classe III inibidor de SAR-40520.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. celular colheita e preparação para Electrodisruption
<ol><li>No final do período de tratamento, Aspire o meio com sucção e adicionar 200 solução de desprendimento de célula µ l (pre-aquecido a 37 ° C) para cada poço. Incube a 37 ° C até que as células desanexar (tipicamente em torno de 5 min). Nota: Considerando que 0,25% (p/v) do Trypsin-EDTA pode ser usado em vez da solução de desprendimento de células, este último contém DNase, que ajuda a reduzir a viscosidade das células desanexadas. Enquanto o meio é completamente aspirado, não é necessário lavar as células antes da adição da solução de desprendimento do Trypsin-EDTA ou célula.</li>
	<li>Adicionar 500 µ l da temperatura ambiente (20-25 ° C) PBS pH 7,4, contendo 2% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em cada poço e ressuspender com a pipeta até sem tufos de célula são visíveis. Transferi imediatamente a suspensão de eritrócitos para tubos de 1,5 mL microcentrifuga no gelo. Nota: A menos que indicado o contrário, execute todas as etapas subsequentes no gelo.</li>
	<li>Sedimento das células por centrifugação a 400 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Aspire cuidadosamente o sobrenadante (por sucção) para deixar as pelotas de célula seca como possível.</li>
	<li>Adicione 400 µ l 10% (p/v) de sacarose (em ultrapura H2O) para cada tubo.</li>
</ol>3. membrana plasmática Electrodisruption e separação de frações Total e sedimentáveis --célula
<ol><li>Ressuspender as células com uma pipeta para obter uma suspensão de célula única perto e transferi-lo para uma cubeta de eletroporação de 4 mm. Nota: Pipetagem inconstante ~ 10 a 15 vezes, usando a ponta da pipeta 100 – 1.000 µ l, normalmente é suficiente.</li>
	<li>Colocar a cubeta em um electroporator de onda de decaimento exponencial e descarga de um único pulso elétrico em 800 V, 25 µF e 400 Ω; essas configurações produzem um pulso de duração ~ 8 ms.</li>
	<li>
Use uma ponta de pipeta nova para transferir o disruptate de célula para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL contendo 400 µ l solução gelada sacarose tampão fosfato (monofosfato de sódio de 100 mM, 2mm ditiotreitol (DTT), EDTA 2 mM e 1,75% de sacarose, pH 7,5) e misture brevemente por pipetagem.
	<ol>
<li>Opcional: Para verificar se a membrana de plasma eficiente electrodisruption17, misture 10 µ l do disruptate célula diluídos da etapa 3.3 com 10 µ l 0.4% Trypan azul em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Transferir para uma câmara de contagem e verifique se a porcentagem de células positivas azul Trypan é &gt; 99%.<ol>
<li>Deixe a amostra na câmara de contagem por 30 min à temperatura ambiente (20-25 ° C) e verifique se que a porcentagem de células positivas Trypan azul manteve-se &gt; 99%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Opcional: Para verificar se o electrodisruption não tem sido muito dura, ou seja, não tem não interrompida organelas intracelulares, execute etapas 1.1 – 3.3 conforme descrito acima, mas use a maior matéria-prima (um poco de uma placa com uma camada de célula confluente de ~ 80% 6), e usar 150 µ l 10% de sacarose em solução de tampão fosfato sacarose µ l etapa 2.5 e 150 sem TDT na etapa 3.3.<ol>
<li>Usar uma pipeta para cuidadosamente camada 200 µ l da solução diluída de célula disruptate em cima de uma almofada de densidade de 1,2 mL de meio de gradiente de densidade de 8% (p/v) de tampão de fosfato (por exemplo, 8% Nycodenz, fosfato de sódio 50 mM, 2,2% de sacarose, 1 mM EDTA) em uma centrífuga de 2 mL tubo. Centrifugar a 20.000 x g durante 45 min a 4 ° C, numa microcentrifuga com função de modo suave (para suave aceleração e desaceleração) e com cuidado, coloque os tubos no gelo.</li>
			<li>Remova cuidadosamente a 60 µ l da fração superior ~ 200 µ l, certificando-se não pegar qualquer solução médio gradiente de densidade e transfira para um tubo de microcentrifugadora fresco. Nota: Isto deve conter citosol de pureza excepcional, denominada "célula sap"21.</li>
			<li>Teste a pureza da fração obtida na etapa acima, através da realização de análises de borrão ocidental de proteínas organela-contido, utilizando as técnicas convencionais e de géis gradiente de 4 – 20%16.</li>
			<li>Executar, por exemplo, immunoblotting para catepsina B21, citocromo c e isomerase de dissulfureto de proteína, para verificar que o choque elétrico em passo 3.2 não desestruturou lisossomos, mitocôndrias ou retículo endoplasmático, respectivamente e immunoblot para LDH para verificar a presença de uma proteína citosólica na seiva do celular.</li>
			<li>Em paralelo, execute immunoblotting em extratos de proteína feitos a partir de solução de disruptate a célula total16 para confirmar que os anticorpos usados podem detectar as proteínas contidas por organela que estão sendo avaliadas.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Repita as etapas de 3.1-3.3 para cada amostra.</li>
	<li>Retire 550 µ l da solução de disruptate cada célula diluído (obtida na etapa 3.3) para tubos de microcentrifuga de 2 mL contendo 900 µ l gelada ressuspensão buffer (monofosfato de sódio 50 mM, 1 mM DTT, 1 mM EDTA e 5,9% de sacarose, pH 7,5) suplementado com 0,5% de BSA e 0,01% Tween-20 e misture brevemente por pipetagem.</li>
	<li>Centrifugar a 18.000 x g por 45 min a 4 ° C para produzir pelotas contendo "LDH sedimentada". Aspire cuidadosamente o sobrenadante (por sucção) para deixar as bolinhas tão seco quanto possível. Coloca as amostras em um freezer-80 ° C.</li>
	<li>Transferência de 150 µ l de cada solução de disruptate de célula diluído (obtida na etapa 3.3) para tubos novos e colocar as amostras em um freezer-80 ° C. Use estas amostras para determinar os níveis de "total de LDH" nas células. Nota: Neste momento o experimento pode ser pausado para contanto que desejado.</li>
</ol>4. LDH extração e avaliação da actividade enzimática de LDH
<ol><li>Descongele o "LDH sedimentada" (da etapa 3.6) e "total de LDH" amostras (da etapa 3.7) no gelo.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de tampão de ressuspensão gelada contendo 1,5% Triton X-405 para "LDH total" amostras (produzindo uma concentração final de Triton X-405 de 1%). Gire as amostras em um rolo em uma sala fria (4 – 8 ° C) por 30 min.</li>
	<li>Adicione 750 µ l de tampão de ressuspensão gelada com 1% Triton X-405 para "LDH sedimentada" amostras e ressuspender as pelotas com uma pipeta até que seja alcançada uma solução homogénea.</li>
	<li>Centrifugar as amostras da etapa 4.2 e 4.3 a 18.000 x g por 5 min a 4 ° C para restos celulares de sedimentos não dissolvido.</li>
	<li>Mix 4 peças do imidazol frio 65mm (piruvato de mM pH 7.5)/0.75 com uma parte do imidazole frio 65 mM (pH 7,5) / 1,8 mM NADH para obter uma solução de trabalho que é estável pelo menos três semanas a 4 ° C.</li>
	<li>Misture 3 – 30 µ l dos sobrenadantes da etapa 4.4 com 200 µ l da solução de trabalho passo 4.5.</li>
	<li>Determinar a quantidade de LDH, medindo a atividade enzimática de LDH como o declínio da nicotinamida adenina dinucleótido (forma reduzida) absorbância (NADH) 340 nm a 37 ° C, em comparação com um padrão com uma concentração conhecida de LDH. Executar medidas de absorvância até a reação se aproximou de conclusão, ou seja, até a absorbância em 340 nm já não muda com o tempo. Nota: Este é o clássico método bioquímico para medir a atividade da LDH. Embora o atual protocolo realiza a reação a 37 ° C, ele também pode ser realizado à temperatura ambiente (20-25 ° C), que é aconselhável se fazer espectrofotometria manual. O protocolo atual usa um instrumento multianalyzer robótico, que, em uma forma automatizada, mistura de amostras com solução de trabalho em uma placa de 96 poços e mede a absorbância em 340 nm a 37 ° C cada 20 s por 3 min. Depois disso, o software de instrumento calcula a concentração de LDH, expressado como unidades (U) / L, comparando-se a inclinação das medições absorvância ao longo do tempo, em comparação com uma curva padrão obtida através de calibração com um padrão de LDH conhecido concentração. O intervalo linear de detecção por esta abordagem é 30 – 1.500 U/L. Como alternativa, existe uma grande variedade de kits comercialmente disponíveis para medir a LDH. Alguns deles são baseados na reação enzimática para a geração de produtos colorimétricos ou fluorescentes, permitindo a deteção por outros meios de espectrofotometria UV e com outras escalas lineares de deteção de acoplamento.</li>
</ol>5. cálculo do sequestro de LDH
<ol><li>Calcule a percentagem de LDH sedimentada a LDH total para cada amostra, tomando as diluições e amostragem em conta: LDH sedimentada (%) =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq1.jpg"> Nota: Durante as etapas 3.1 – 3.3 aproximadamente 50 µ l é perdida devido à transferência para dentro e fora da cubeta de eletroporação. Assim, calcule de ter um total de 750 µ l (em vez de 800 µ l) de disruptate de célula diluídos na etapa 3.3.</li>
	<li>Subtrair a porcentagem de LDH sedimentada obtido nas amostras de células não tratadas (etapa 1.3.2) da porcentagem de LDH sedimentada, obtida em amostras de células tratadas experimentalmente e dividir pelo tempo de tratamento com Baf para obter a percentagem de LDH sequestrado por hora durante o período de amostragem: Isolado de LDH (% / h) =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57971/57971eq2.jpg">
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nenhum conflito de interesses.

Em resumo, o protocolo descrito aqui representa um método confiável e amplamente aplicável para monitorar a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. Em comparação com o original método de12,16, ter removido um número de etapas desnecessárias, simplificamos várias das etapas restantes e introduziu uma substancial redução de escala. Como resultado, o protocolo é muito melhorado em relação ao custo e tempo-eficiência, e a mesma quantida...

Autofagia (do grego para "Self comendo") é um processo evolutivo e conservado pela degradação vacuolar/lysosomal do material intracelular. Após a descoberta de genes relacionados com autofagia ("ATG"), que são importantes para a autofagia no fermento e seres humanos, e a realização que autofagia desempenha um papel significativo na saúde e na doença (reconhecido por 2016 Prêmio Nobel de medicina ou fisiologia de Yoshinori Ohsumi), autofagia rapidamente se tornou um dos processos mais intensamente estudados na célula biologia1,2.
Macroautophagy (doravante referida como "autofagia") é caracterizada pela expansão e dobramento de pequenos membrana intracelular ("phagophores") em estruturas seladas, double ou multi membrane ("autophagosomes") que efetivamente sequestram o enwrapped material do resto do citoplasma. Mediante a fusão de autophagosomes com lisossomos, membrana interna autophagosomal e a carga sequestrada é degradado e reciclados. Autophagosomes pode requisitar material citoplasmático em aleatória (não-seletivo autofagia) e modos seletiva (autofagia seletiva). Granel autofagia provavelmente representa uma mistura de autofagia não-seletivos e seletiva.
Nos anos 60 e 70 ("a morfológica era" da pesquisa de autofagia), sequestro de autophagic principalmente foi avaliado através de análises ultraestrutural. Na década de 1980 e início dos anos 90 ("a era bioquímico") por Seglen e colegas de trabalho — quem estudou autofagia em hepatócitos primários de rato — desenvolveu os primeiro métodos para medir quantitativamente o sequestro autophagic atividade3. Usando estes ensaios, Seglen definidos e caracterizados diferentes etapas da via lisossomal-autophagic4,5, descoberto e cunhou o amphisome6 (o produto da fusão endossomo-autophagosome) e foi o primeiro a Descreva o papel da fosforilação de proteínas em autofagia Regulamento7. No entanto, após a descoberta dos ATGs de 1990 ("a era molecular") e a primeira caracterização de uma proteína ATG8 mamíferos, proteína microtubule-associada 1A/1B-luz corrente 3 (LC3) em 20008, a utilização de proteínas ATG como marcadores para o autophagic processo rapidamente ganhou popularidade, e os mais velhos e mais trabalhosos métodos bioquímicos foram deixados para trás. Na verdade, durante os últimos 18 anos, borrão ocidental e análises de microscopia de fluorescência de LC3 tornaram-se de longe mais populares (e em muitos casos, o único) meio de estudar autofagia em células de mamíferos. A vantagem é a relativa facilidade pelo qual estes métodos podem ser realizados. A desvantagem é que um está estudando um componente de carrinho (LC3) ao invés de carga autophagic real. Esta é uma desvantagem bastante séria, porque a relação entre os Estados-Membros e/ou fluxo de LC3 através da via contra o sequestro e o fluxo de carga é altamente incerto. Na verdade, mostramos que o fluxo de carga em massa pode ser mantido em níveis elevados em condições onde não há nenhum fluxo LC3, apesar da presença de conjugados LC3 na9células. Além disso, temos demonstrado que autofagia em massa não é afetada pela depleção de LC3 eficiente e assim provavelmente é LC3-independente9. Este achado mais tarde foi confirmado por LC3 nocaute estudos10,11, que também indicam que mitophagy Parkin-dependente (a seletiva autofagia mitocondrial) é independente dos LC310,11 .
Em resumo, há uma clara necessidade ensaios baseados em carga monitorar a atividade do autophagic. Otimamente desses ensaios devem ser amplamente aplicável, bem definido e fácil de executar. Ao longo dos últimos anos, demos um interesse particular no ensaio de sequestro de LDH, que foi desenvolvido por Per Seglen na década de 198012e baseia-se na medição da transferência de LDH citosólico para sedimentáveis, célula vacúolo contendo autophagic frações. LDH é uma proteína citosólica estável, solúvel que prontamente co é sequestrada quando phagophores Wrap carga citoplasmática. Sequestro de LDH é, portanto, uma medida geral de sequestro autophagic. LDH é exclusivamente degradado pela via lisossomal-autophagic12. Assim, na presença de inibidores da degradação dos lisossomos, por exemplo, bafilomycin A1 (Baf)13, efeitos do tratamento experimental diretamente refletir alterações na atividade de sequestro autophagic. Na ausência de inibidores da degradação, o efeito líquido de alterações no sequestro de LDH e degradação pode ser medido.
O ensaio de sequestro de LDH é amplamente aplicável, desde que a LDH é altamente e ubiquitously expressa em todos os tipos de células, e os níveis LDH podem ser quantificados com precisão por um ensaio enzimático de14,15. No entanto, o original do protocolo12 — estabelecido em hepatócitos primários de rato — foi bastante demorado e exigiu uma alta quantidade de começar o material, bem como um capacitor feito por descarga elétrica. De uma forma faseada, nós transformaram gradualmente o ensaio em um método fácil e versátil. Em primeiro lugar, o protocolo original foi adaptado para uso em linhas de células de mamíferos16. Em segundo lugar, o método foi substancialmente downscaled3,9. Terceiro, várias etapas no protocolo foram eliminadas, incluindo uma almofada de densidade laborioso passo17. Isto permitiu simultaneamente uma regionalização ainda mais do método, do ponto de partida original do uso de uma placa de 10cm por exemplo16 usando um único poço de uma placa de 12 por amostra (ou seja, aproximadamente 15-fold menos começando material)17. Em quarto lugar, nós identificamos uma aparelho de eletroporação comercial que poderia substituir o capacitor de descarga elétrica sob medida17.
Aqui nosso protocolo mais atualizado do ensaio do sequestro de LDH, que inclui algumas simplificações adicionais do método em comparação com o anteriormente publicado17 é apresentado. Além disso, é mostrado um conjunto de resultados típicos obtidos em um número de diferentes tipos de células, e importante, várias linhas de validações experimentais do método usando o knockdown farmacológica, bem como genética e nocaute abordagens são fornecidas. Um regime global de fluxo do protocolo inteiro, veja a Figura 1.

<table><tbody><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL e 2 mL&nbsp;</td><td>Placas de</td> 12 poços Eppendorf <td>211-2130 e 211-2120</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Solução</td><td>de</td> desprendimento de células Falcon 353043 <td></td></tr><tr><td>Accumax&nbsp;</td><td>Tecnologias Celulares Inovadoras</td><td>A7089</td><td>Mantenha as alíquotas em -20 &nbsp; C por anos, e na geladeira por alguns meses</td></tr><tr><td>Bafilomicina A1</td><td>Enzo</td><td>BML-CM110-0100</td><td>Dissolver em células DMSO</td></tr><tr><td>BJ</td><td>ATCC</td><td>CRL-2522</td><td>usar na passagem < 30</td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>VWR</td><td>422361V</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem de Burker</td><td>Fisher Scientific</td><td>139-658585</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de câmara de contagem de células Countess</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Contador de células automatizado Countess II</td><td>ThermoFisher Scientfic</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de vidro para a câmara</td> <td>de contagem de BurkerFisher Scientific</td><td>139-658586</td><td></td></tr><tr><td>Criterion Tris-HCl Gel, 4&ndash; 20%, 26 poços, 15 e micro; L, 13,3 cm x 8,7 cm (L x C)&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>3450034</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina balanceada de Earle (EBSS)</td><td>Gibco</td><td>24010-043</td><td>contém 0,1% de glicose</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Cubeta de eletroporação (4 mm)</td><td>Bio-Rad</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td>Eletroporador de onda de decaimento exponencial</td><td>BTX Harvard Aparelho</td><td>&nbsp; EMC 630</td><td></td></tr><tr><td>Soro fetal bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td>10% de concentração final em células médias HEK1640</td></tr><tr><td>HEK293</td><td>RPMI</td><td>1640 ATCC CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56750</td><td>Autoclave uma solução de 65 mM e mantenha na geladeira por meses</td></tr><tr><td>Incubadora; Incubadora de CO2 de calor direto IR Autoflow</td><td>NuAire</td><td>NU-5510E</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX Reagente de transfecção</td><td>ThermoFisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>células LNCaP</td><td>ATCC</td><td>CRL-1740</td><td>uso na passagem < 30</td></tr><tr><td>3-Metil Adenina (3MA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9281</td><td>Estoque 100 mM em RPMI em -20 &deg;C.&nbsp; Aqueça o caldo a 65 graus; C por 10 min, e use a 10 mM de concentração final</td></tr><tr><td>Microcentrífuga Refrigerada</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Refrigerada com função soft-mode</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Eppendorf 5417R&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MRT67307 cloridrato (ULKi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0702</td><td>inibe a atividade da quinase ULK. Dissolva em DMSO.</td></tr><tr><td>Instrumento multianalisador MaxMat</td><td>Erba Diagnostics</td><td>PL-II</td><td></td></tr><tr><td>Células MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.24644.001</td><td></td></tr><tr><td>Nycodenz</td><td>Axis-Shield</td><td>1002424</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Soro Reduzido Meio</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta 3 (0.5-20 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2223</td><td>Thermo Fischer ART Pontas de barreira Ponteiras</td></tr><tr><td>de pipeta (1-200 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2207&nbsp;</td><td>Pontas de barreira Thermo Fischer ART</td></tr><tr><td>Ponteiras de pipeta (100-1.000 &micro; L)</td><td>VWR</td><td>732-2355&nbsp;</td><td>Pontas de barreira Thermo Fischer ART</td></tr><tr><td>Pipetas</td><td>ThermoFisher</td><td>4701070</td><td>Finnpipette F2 GLP Kit</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-10X5MG</td><td>Faça uma solução estoque de 1 mg/mL em H2O. Esta solução é estável a -20 &graus; C por pelo menos 1 ano.</td></tr><tr><td>Células Pyruvate</td><td>Merck-Millipore</td><td>1066190050</td><td></td></tr><tr><td>RPE-1 (hTERT RPE-1)</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875-037</td><td></td></tr><tr><td>SAR-405</td><td>ApexBio&nbsp;</td><td>A8883</td><td>Inibe a fosfoinositídeo 3-quinase classe III (PIK3C3). Dissolva em DMSO.</td></tr><tr><td>Controle Negativo de Seleção de Silenciador #1 (siCtrl)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>4390843</td><td></td></tr><tr><td>siRNA de segmentação ATG9 (siATG9A)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s35504</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA de segmentação FIP200 (siFIP200)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18995</td><td></td></tr><tr><td>SiRNA de segmentação ULK1 (siULK1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s15964</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select siRNA direcionado a ULK2 (siULK2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s18705</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select SIRNA direcionado a GABARAP (siGABARAP)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22362</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select siRNA direcionado a GABARAPL1 (siGABARAPL1)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s24333</td><td></td></tr><tr><td>Silencer Select siRNA direcionado a GABARAPL2 (siGABARAPL2)</td><td>ThermoFisher/Ambion</td><td>s22387</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico di-hidratado (NaH2PO4 &bull; 2H2O)&nbsp;</td><td>Merck-Millipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico di-hidratado (Na2HPO4 &bull; 2H2O)&nbsp;</td><td>Prolabo</td><td>28014.291</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>VWR</td><td>443816T</td><td>10% de concentração final em água; filtrar através de 0,45 &micro; m filtra e mantém na geladeira por meses</td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td>Inibe a bomba SERCA ER Ca2+. Dissolva em DMSO.</td></tr><tr><td>Triton X-405</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X405</td><td>1% final</td></tr><tr><td>Trypan Blue mancha 0,4%</td> <td>Sondas Moleculares</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25% com tripsina)</td> <td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td>0,01% final</td></tr></tbody></table>

o ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — um método simples e confiável para determinar a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Autofagia em massa caracteriza-se por sequestro de grandes porções do citoplasma nas estruturas de duplo/multi-membrane denominado autophagosomes. Aqui um protocolo simples para monitorar este processo é descrito. Além disso, o típicos resultados e validação experimental do método sob condições indutoras autofagia em vários tipos de células de mamíferos cultivadas são fornecidos. Durante autofagia em massa, autophagosomes sequestrar citosol e desse modo também proteínas citosólica solúveis, juntamente com outras cargas autophagic. LDH é estável e altamente solúvel, abundante enzima citosólica que não seletivamente é sequestrada em autophagosomes. A quantidade de sequestro de LDH, portanto, reflete a quantidade de sequestro de autophagic em massa. Para eficiência e precisão determinar o sequestro de LDH em células, nós empregamos um protocolo baseado em electrodisruption de fracionamento que efetivamente separa sedimentáveis LDH citosólica, seguido de medida da atividade enzimática em sedimentáveis fracções contra amostras de células inteiras. Sequestro de autophagic é determinado subtraindo-se a proporção de sedimentáveis LDH em células não tratadas do que em células tratadas. A vantagem do ensaio do sequestro de LDH é que dá uma medida quantitativa da autophagic embargo da carga endógena, ao contrário de outros métodos que também envolvem expressão ectópica de sondas de sequestro ou semi-quantitativa de protease análises de proteção de marcadores de autofagia ou receptores.

Usando o protocolo descrito aqui, a atividade de autophagic de sequestro em massa em um número de linhas de células de mamíferos diferentes, incluindo LAPC4, DU145, Huh7, PNT2A, HeLa, capnografia, H3122, Hec1A, MCF-7 T47D, U2OS, PC3, G361, mouse embrionários fibroblastos (MEFs), RPE-1, Células HEK293, BJ e LNCaP foi medido. Sequestro foi avaliado em condições basais (em médio completo, rico em nutrientes), ou em células agudamente faminta de soro e aminoácidos (uma bona fide indu...

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da autofagia, como como a formação de autofagossomos é regulada e como vários tratamentos e condições celulares afetam a autofagia em massa. A principal vantagem dessa técnica é que ela mede o sequestro de carga endógena. Portanto, o método é amplamente aplicável e independente da superexpressão artificial ou da introdução de sondas de carga.Demonstrando o procedimento, estarão Paula Szalai e Morten Luhr, alunos de doutorado do meu laboratório. Para começar, cultive células aderentes em frascos de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Permita que as células cresçam até atingirem uma camada celular quase confluente.Depois disso, lave as células com três mililitros de PBS a 37 graus Celsius em pH 7,4. Remova o PBS e substitua-o por três mililitros de 0,25% de tripsina EDTA. Incube em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, até que as células se desprendam.Em seguida, ressuspendemos as células em sete mililitros de meio de cultura contendo 10% de FBS e transferimos para um tubo estéril de 50 mililitros. Usando uma ponta de pipeta de 0,5 a 20 microlitros, transfira 10 microlitros de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga contendo 10 microlitros de azul de tripano. Use a mesma ponta de pipeta para encher imediatamente uma lâmina da câmara de contagem e contar as células em um contador de células automatizado.Em seguida, use meio de cultura contendo 10% FBS para preparar a diluição adequada da suspensão celular. Usando técnicas assépticas, semeie um mililitro da suspensão de células diluídas em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços. Incubar em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que a densidade celular desejada seja atingida.Nos tratamentos experimentais desejados, deixando um conjunto de poços sem tratamento para definir os níveis de fundo de LDH sedimentável. Três a quatro horas antes da colheita, adicione uma quantidade saturada de inibidor pós-sequestro Bafilomicina A1 a cada poço. Incube em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.No final do período de tratamento, você aspira para aspirar o meio. Adicione 200 microlitros de solução de descolamento celular pré-aquecida a 37 graus Celsius a cada poço. Incube a 37 graus Celsius até que as células se desprendam.Adicione 500 microlitros de PBS à temperatura ambiente em pH 7,4 contendo 2% de BSA em cada poço. Usando uma pipeta, ressuspenda cada poço até que nenhum aglomerado de células seja visível. Depois disso, transfira imediatamente a suspensão celular em cada poço para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro no gelo.Centrifugue os tubos a 400 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para sedimentar as células. Use sucção para aspirar completamente o sobrenadante, deixando os pellets celulares o mais secos possível. Em seguida, adicione 400 microlitros de solução contendo 10% de sacarose em água ultrapura a cada tubo.Usando uma pipeta, ressuspendeu o pellet celular para obter uma suspensão de célula quase única. Transfira esta suspensão para uma cubeta de eletroporação de quatro milímetros. Coloque a cubeta em um eletroporador de onda de decaimento exponencial e descarregue um único pulso elétrico a 800 volts, 25 microfarads e 400 ohms.Use uma nova ponta de pipeta para transferir o rompimento celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 400 microlitros de solução de sacarose tamponada com fosfato gelado e misture brevemente pipetando. Repita este processo de ressuspensão, eletrodisrupção e mistura para cada amostra. Se realizar o procedimento pela primeira vez, certifique-se de verificar a eletroruptura eficiente e seletiva da membrana plasmática, conforme descrito no texto.Para obter frações sedimentadas de LDH, remova 550 microlitros de cada solução diluída de ruptura celular e transfira-a para seu próprio tubo de microcentrífuga de dois mililitros contendo 900 microlitros de tampão de ressuspensão gelada com 0,5% BSA e 0,01% Tween 20. Pipete brevemente para misturar. Centrifugar a 18 000 vezes g e quatro graus Celsius durante 45 minutos para produzir pellets contendo LDH sedimentado.Usando sucção, aspire bem o sobrenadante para deixar os pellets o mais secos possível. Armazene as amostras de LDH sedimentadas a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para análise. Para frações totais de LDH, transfira 150 microlitros de cada uma das soluções de ruptura de células diluídas para seu próprio novo tubo.Armazene-os em um freezer de 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para análise. Descongele as amostras de LDH sedimentadas e totais de LDH no gelo. Depois de descongelado, adicione 300 microlitros de tampão de ressuspensão gelado contendo 1,5% de Triton X-405 ao total de amostras de LDH.Gire as amostras em um rolo em uma câmara fria por 30 minutos. Em seguida, adicione 750 microlitros de tampão de ressuspensão gelada contendo 1% de Triton X-405 às amostras de LDH sedimentadas. Use uma pipeta para ressuspender os pellets até que a solução fique homogênea.Centrifugue todas as amostras a 18.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para sedimentar os detritos celulares não dissolvidos. Após a conclusão da centrifugação, coloque as amostras no gelo. Determine os níveis de LDH nos sobrenadantes usando um ensaio enzimático clássico, conforme descrito no texto, ou qualquer um dos diversos kits disponíveis comercialmente.Neste estudo, a atividade de sequestro autofágico em massa é monitorada em várias linhagens celulares de mamíferos diferentes. Como mostrado aqui, tanto o sequestro de LDH basal quanto o induzido por fome e as células LNCaP são completamente abolidos pelo inibidor da pan-PI3-quinase, 3MA. O inibidor seletivo de PI3-quinase Classe três, SAR-405 e o inibidor da bomba de cálcio ER, Thapsigargin.Nas células HEK293, o sequestro de LDH em condições de fome é fortemente reduzido tanto pela Thapsigargin quanto pelo inibidor de ULK, MRT 67307. Além disso, o sequestro de LDH induzido pela fome é consistentemente inibido pelo 3MA nas outras linhagens celulares observadas. Em seguida, vários MEFs nocaute do gene ATG são empregados para testar se os genes relacionados à autofagia relatados como essenciais para a formação de autofagossomos são necessários para o sequestro de LDH.Como pode ser visto, o sequestro de LDH induzido pela fome é abolido no MEFS nocaute para ATG5. Além disso, também é embotado em MEFs knockout ATG7 e ATG9A. Finalmente, os efeitos do silenciamento mediado por RNAi dos principais transcritos do gene ATG são determinados.A transfecção com um siRNA direcionado a ATG9A ou com direcionamento combinado de ULK1 e ULK2 reduz fortemente o sequestro de LDH em células LNCaP. Ao tentar este procedimento, é importante ser preciso em todas as etapas da pipetagem. Após este procedimento, outros métodos, como o ensaio de degradação de proteínas de longa duração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se foram observadas alterações na atividade de sequestro, resultando em alterações comparáveis na atividade de degradação autofágica.Depois de estabelecer este método em linhagens celulares de mamíferos, nós o usamos para demonstrar que a autofagia em massa é independente da família de proteínas LC3 e, em vez disso, requer GABARAPs. Isso destaca a importância de empregar métodos independentes de LC3 para monitorar a atividade da autofagia.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Este vídeo descreve um ensaio colorimétrico para medição de lactato em lisados celulares usando a enzima lactato desidrogenase. Esta enzima converte lactato em piruvato, juntamente com a conversão de NAD em NADH que reage com corantes de tetrazólio e dá um produto colorido que pode ser medido espectrofotometricamente para quantificar o lactato.

Ensaio Colorimétrico para Quantificação de Lactato em Amostras de Teste

O vídeo demonstra um ensaio para avaliar a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos. Ele utiliza eletroporação para liberar proteínas citosólicas, incluindo lactato desidrogenase (LDH). As frações LDH sequestradas e LDH celular total são determinadas para avaliar o sequestro de LDH, fornecendo informações sobre a atividade geral de sequestro em massa.

Quantificando a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos

Aqui, a citometria de fluxo de imagem multiespectral com uma característica analítica que compara imagens de detalhes brilhantes de 3 marcadores de autofagia e quantifica sua co-localização, juntamente com a contagem de pontos LC3, foi usada para medir autofagia de forma objetiva, quantitativa e estatisticamente robusta.

Avaliando o Fluxo Autofágico Medindo LC3, p62 e LAMP1 Co-localization Usando a Citometria de Fluxo de Imagem Multiespectral

Mitophagy, o processo de compensação danificada mitocôndrias, é necessário para a manutenção de saúde e homeostase mitocondrial. Este artigo apresenta alguns dos mitophagy mais recente métodos de deteção em células humanas, Caenorhabditis eleganse os ratos.

In Vitro e In Vivo de deteção de Mitophagy em células humanas, C. Eleganse os ratos

Descreveremos um protocolo para mapear a distribuição espacial da atividade enzimática por enzimas que geram nicotinatmide adenina dinucleótido fosfato (NAD(P)H) + H + diretamente em amostras de tecido.

Metabolismo de mapeamento: Monitorar a atividade de lactato desidrogenase diretamente no tecido

Nós descrevemos nosso protocolo para medir ritmos biológicos no catabolismo da proteína através do autofagia e do Proteassoma no fígado do rato.

Medindo ritmos diurnos no fluxo autophagic e Proteasomal

O objetivo deste protocolo é determinar os níveis autofágicos em câncer de pâncreas e células acinares pancreáticas através da imunofluorescência da LC3 e quantificação do ponto da CL3.

Avaliação dos Níveis de Autofagia em Dois Diferentes Modelos de Células Pancreáticas Utilizando Imunofluorescência LC3

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para o uso de um ensaio de repórter baseado em luciferase em um formato de triagem semi-automatizado e de alto rendimento.

Triagem de Drogas Baseadas em Células para Inibidores da Autofagia 4B Cisteína Peptidase Relacionada

Aqui, apresentamos a metodologia para avaliar de forma concisa os níveis de LC3-II do marcador autofagossomo em vesículas extracelulares (EVs) por immunoblotting. A análise dos níveis de LC3-II em EVs, formação de autolisossomos e formação de ômegassomos sugere o novo papel de STX6 na liberação de EVs positivos para LC3-II quando a fusão autofagossomo-lisossomo é inibida.

Avaliação da liberação de LC3-II via vesículas extracelulares em relação ao acúmulo de vesículas intracelulares positivas para LC3

Aprenda a medir a atividade de sequestro autofágico em massa em células de mamíferos usando o ensaio de lactato desidrogenase. Este método confiável quantifica LDH endógeno sem necessidade de sondas artificiais.

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos (Vídeo) | JoVE Journal

O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

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