O ensaio de sequestro de lactato desidrogenase — Um método simples e confiável para determinar a atividade de Autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos

Aqui, é descrito um protocolo simples e bem validado para medir a atividade de autophagic de sequestro em massa em células de mamíferos. O método baseia-se em quantificar a proporção de lactato desidrogenase (LDH) em frações de célula sedimentáveis em comparação com os níveis LDH totais do celulares.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da autofagia, como como a formação de autofagossomos é regulada e como vários tratamentos e condições celulares afetam a autofagia em massa. A principal vantagem dessa técnica é que ela mede o sequestro de carga endógena. Portanto, o método é amplamente aplicável e independente da superexpressão artificial ou da introdução de sondas de carga.

Demonstrando o procedimento, estarão Paula Szalai e Morten Luhr, alunos de doutorado do meu laboratório. Para começar, cultive células aderentes em frascos de cultura de tecidos de 75 centímetros quadrados em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Permita que as células cresçam até atingirem uma camada celular quase confluente.

Depois disso, lave as células com três mililitros de PBS a 37 graus Celsius em pH 7,4. Remova o PBS e substitua-o por três mililitros de 0,25% de tripsina EDTA. Incube em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius, até que as células se desprendam.

Em seguida, ressuspendemos as células em sete mililitros de meio de cultura contendo 10% de FBS e transferimos para um tubo estéril de 50 mililitros. Usando uma ponta de pipeta de 0,5 a 20 microlitros, transfira 10 microlitros de suspensão celular para um tubo de microcentrífuga contendo 10 microlitros de azul de tripano. Use a mesma ponta de pipeta para encher imediatamente uma lâmina da câmara de contagem e contar as células em um contador de células automatizado.

Em seguida, use meio de cultura contendo 10% FBS para preparar a diluição adequada da suspensão celular. Usando técnicas assépticas, semeie um mililitro da suspensão de células diluídas em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 12 poços. Incubar em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius até que a densidade celular desejada seja atingida.

Nos tratamentos experimentais desejados, deixando um conjunto de poços sem tratamento para definir os níveis de fundo de LDH sedimentável. Três a quatro horas antes da colheita, adicione uma quantidade saturada de inibidor pós-sequestro Bafilomicina A1 a cada poço. Incube em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius.

No final do período de tratamento, você aspira para aspirar o meio. Adicione 200 microlitros de solução de descolamento celular pré-aquecida a 37 graus Celsius a cada poço. Incube a 37 graus Celsius até que as células se desprendam.

Adicione 500 microlitros de PBS à temperatura ambiente em pH 7,4 contendo 2% de BSA em cada poço. Usando uma pipeta, ressuspenda cada poço até que nenhum aglomerado de células seja visível. Depois disso, transfira imediatamente a suspensão celular em cada poço para um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro no gelo.

Centrifugue os tubos a 400 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para sedimentar as células. Use sucção para aspirar completamente o sobrenadante, deixando os pellets celulares o mais secos possível. Em seguida, adicione 400 microlitros de solução contendo 10% de sacarose em água ultrapura a cada tubo.

Usando uma pipeta, ressuspendeu o pellet celular para obter uma suspensão de célula quase única. Transfira esta suspensão para uma cubeta de eletroporação de quatro milímetros. Coloque a cubeta em um eletroporador de onda de decaimento exponencial e descarregue um único pulso elétrico a 800 volts, 25 microfarads e 400 ohms.

Use uma nova ponta de pipeta para transferir o rompimento celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 400 microlitros de solução de sacarose tamponada com fosfato gelado e misture brevemente pipetando. Repita este processo de ressuspensão, eletrodisrupção e mistura para cada amostra. Se realizar o procedimento pela primeira vez, certifique-se de verificar a eletroruptura eficiente e seletiva da membrana plasmática, conforme descrito no texto.

Para obter frações sedimentadas de LDH, remova 550 microlitros de cada solução diluída de ruptura celular e transfira-a para seu próprio tubo de microcentrífuga de dois mililitros contendo 900 microlitros de tampão de ressuspensão gelada com 0,5% BSA e 0,01% Tween 20. Pipete brevemente para misturar. Centrifugar a 18 000 vezes g e quatro graus Celsius durante 45 minutos para produzir pellets contendo LDH sedimentado.

Usando sucção, aspire bem o sobrenadante para deixar os pellets o mais secos possível. Armazene as amostras de LDH sedimentadas a menos 80 graus Celsius até que estejam prontas para análise. Para frações totais de LDH, transfira 150 microlitros de cada uma das soluções de ruptura de células diluídas para seu próprio novo tubo.

Armazene-os em um freezer de 80 graus Celsius negativos até que estejam prontos para análise. Descongele as amostras de LDH sedimentadas e totais de LDH no gelo. Depois de descongelado, adicione 300 microlitros de tampão de ressuspensão gelado contendo 1,5% de Triton X-405 ao total de amostras de LDH.

Gire as amostras em um rolo em uma câmara fria por 30 minutos. Em seguida, adicione 750 microlitros de tampão de ressuspensão gelada contendo 1% de Triton X-405 às amostras de LDH sedimentadas. Use uma pipeta para ressuspender os pellets até que a solução fique homogênea.

Centrifugue todas as amostras a 18.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos para sedimentar os detritos celulares não dissolvidos. Após a conclusão da centrifugação, coloque as amostras no gelo. Determine os níveis de LDH nos sobrenadantes usando um ensaio enzimático clássico, conforme descrito no texto, ou qualquer um dos diversos kits disponíveis comercialmente.

Neste estudo, a atividade de sequestro autofágico em massa é monitorada em várias linhagens celulares de mamíferos diferentes. Como mostrado aqui, tanto o sequestro de LDH basal quanto o induzido por fome e as células LNCaP são completamente abolidos pelo inibidor da pan-PI3-quinase, 3MA. O inibidor seletivo de PI3-quinase Classe três, SAR-405 e o inibidor da bomba de cálcio ER, Thapsigargin.

Nas células HEK293, o sequestro de LDH em condições de fome é fortemente reduzido tanto pela Thapsigargin quanto pelo inibidor de ULK, MRT 67307. Além disso, o sequestro de LDH induzido pela fome é consistentemente inibido pelo 3MA nas outras linhagens celulares observadas. Em seguida, vários MEFs nocaute do gene ATG são empregados para testar se os genes relacionados à autofagia relatados como essenciais para a formação de autofagossomos são necessários para o sequestro de LDH.

Como pode ser visto, o sequestro de LDH induzido pela fome é abolido no MEFS nocaute para ATG5. Além disso, também é embotado em MEFs knockout ATG7 e ATG9A. Finalmente, os efeitos do silenciamento mediado por RNAi dos principais transcritos do gene ATG são determinados.

A transfecção com um siRNA direcionado a ATG9A ou com direcionamento combinado de ULK1 e ULK2 reduz fortemente o sequestro de LDH em células LNCaP. Ao tentar este procedimento, é importante ser preciso em todas as etapas da pipetagem. Após este procedimento, outros métodos, como o ensaio de degradação de proteínas de longa duração, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como se foram observadas alterações na atividade de sequestro, resultando em alterações comparáveis na atividade de degradação autofágica.

Depois de estabelecer este método em linhagens celulares de mamíferos, nós o usamos para demonstrar que a autofagia em massa é independente da família de proteínas LC3 e, em vez disso, requer GABARAPs. Isso destaca a importância de empregar métodos independentes de LC3 para monitorar a atividade da autofagia.