Quantificar alterações agudas na atividade do nervo simpático Renal em resposta a manipulações do sistema nervoso Central em ratos anestesiados

Este método pode ajudar a responder a questões-chave sobre o sistema nervoso autônomo, particularmente sobre os mecanismos do sistema nervoso central que regulam o fluxo simpático para o rim. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite medir o impacto que as manipulações do sistema nervoso central têm no fluxo simpático renal para o rim. Antes da canulação arterial, inspecione o cateter sensor de pressão sob alta ampliação para confirmar se o cateter está livre de bolhas e detritos e tem um menisco intacto entre os componentes preenchidos com fluido e gel.

Antes de cada implantação, reabasteça o gel na ponta distal do cateter e use um ímã para ligar o transmissor. Coloque um meio nó solto na sutura proximal para ocluir brevemente a artéria femoral. E segurando o introdutor do cateter na mão não dominante, use uma pinça de canulação do vaso para segurar a ponta da cânula da unidade de telemetria para evitar deslocar o gel da ponta.

Use uma ponta de agulha dobrada de calibre 22 para fazer um orifício na artéria e insira a cânula na artéria o máximo possível. Em seguida, prenda o cateter de pressão com os laços de sutura proximal e distal. E coloque o corpo do implante de telemetria dentro do flanco adjacente à incisão.

Para acesso ao cérebro, mova suavemente o rato para a posição de bruços em uma estrutura de cirurgia estereotáxica com a cabeça entre as barras auriculares e ajuste a barra incisiva para equalizar a altura de lambda e bregma. Em seguida, faça uma incisão caudal rostral de dois centímetros na linha média do couro cabeludo e use aplicadores com ponta de algodão para remover firmemente qualquer tecido conjuntivo da superfície do crânio. Aplique peróxido de hidrogênio no crânio exposto para auxiliar na visualização das suturas de bregma, lambda e linha média.

Usando um atlas do cérebro do rato para orientar o direcionamento, faça uma osteotomia com orifício de rebarba dimensionado para acesso ao eletrodo através do crânio. Para isolar os nervos simpáticos renais, conecte um fio de atividade nervosa simpática renal ou eletrodo RSNA a um pré-amplificador 10X e um amplificador de microeletrodo e faça uma incisão de bisturi estendendo-se de quatro a cinco centímetros abaixo das costelas na direção caudal ligeiramente lateral à coluna. Dissecar sem corte para visualizar os músculos paraespinhais e fazer uma incisão caudal rostral muito superficial de um a dois centímetros, onde a gordura encontra o músculo.

Usando aplicadores com ponta de algodão, espalhe a gordura para longe do músculo para visualizar o rim sem entrar no espaço peritoneal. E use afastadores para separar suavemente o rim dos músculos paraespinhais para visualizar a artéria renal e a aorta abdominal. E use alta ampliação para identificar os nervos renais na bolsa de incisão.

Os feixes nervosos são mais facilmente visíveis no ângulo reto formado pela aorta e pela artéria renal, seguindo de perto a artéria renal da aorta aos rins. Em seguida, use uma pinça de microdissecação para dissecar suavemente um segmento do feixe nervoso a ser colocado no eletrodo de registro do tecido circundante. Prenda o eletrodo RSNA do fio em um suporte e abaixe o eletrodo até o nível do segmento nervoso.

Use um gancho nervoso para levantar suavemente um segmento do nervo renal no eletrodo sem esticar o nervo. E preencha a incisão com óleo mineral para manter o nervo simpático renal exposto hidratado. Conecte um clipe de aterramento ao animal e a outra extremidade à gaiola de Faraday e use filtragem passa-alta e baixa para direcionar o sinal para os amplificadores.

Em seguida, ajuste o ganho em até 10 kilohertz, incluindo um monitor de áudio para avaliar o padrão de ruptura do RSNA. Para avaliar a qualidade do registro do RSNA, evoque o barorreflexo com uma injeção intravenosa em bolus de 100 microlitros de 10 microgramas por mililitro de fenilefrina para aumentar a pressão arterial e inibir a atividade nervosa simpática renal, ajustando a posição dos eletrodos para melhorar o sinal conforme necessário. Uma vez obtido um sinal claro, aspire o óleo mineral e prenda o eletrodo no lugar com sílica gel.

Neste experimento representativo, a injeção intravenosa de fenilefrina foi usada para induzir um aumento na pressão arterial média e para evocar a inibição barorreflexa e transitória. Para quantificar o RSNA, o RSNA bruto foi retificado e calculado com média para segmentos de 10 segundos não sobrepostos e a estimativa de ruído foi subtraída de cada segmento. Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de garantir que o rato esteja adequadamente anestesiado, que esteja posicionado corretamente na estrutura estereotáxica e que o sistema esteja adequadamente aterrado para reduzir o ruído elétrico.

Após esse procedimento e coleta de tecido cerebral, métodos histológicos podem ser aplicados para caracterizar os tipos de núcleos do sistema central que controlam uma resposta simpatoexcitatória. Essa técnica permite que os neurocientistas explorem os mecanismos de regulação autonômica em ratos anestesiados, o que informa estudos futuros em animais para entender o controle da pressão arterial e da função renal. Não se esqueça de que é fundamental avaliar o plano da anestesia pelo menos a cada 15 minutos.

E para fornecer anestesia suplementar conforme necessário.