Name: Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 59 s
Description: Aprenda a isolar partículas de lipoproteína da gema de ovo de galinha para estudar a incorporação de ácidos graxos em membranas bacterianas de Staphylococcus aureus usando espectrometria de massas.

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Agradecemos aos membros do laboratório Hammer por sua avaliação crítica do manuscrito e apoio deste trabalho. Dr. Alex Horswill da Universidade de Colorado School of Medicine gentilmente forneceu AH1263. Dr. Chris Waters laboratório na Universidade Estadual de Michigan forneceu reagentes. Este trabalho foi apoiado pela American Heart Association Grant 16SDG30170026 e os fundos de arranque fornecem pela Universidade Estadual de Michigan.

Os autores não têm divulgações.

S. aureus incorpora ácidos graxos exógenos em seus fosfolipídios de membrana27,32,43. A síntese de fosfolipídios usando ácidos graxos exógenos ignora a inibição do fasii, mas também altera as propriedades biofísicas da membrana27,32,44. Embora a incorporação de ácidos graxos exógenos em fosfolipídios de patógenos gram-positivos...

S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é a principal causa de infecção associada à saúde e a resistência antibiótica associadaé um desafio clínico considerável1,2,3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas é uma prioridade alta. Uma estratégia de tratamento promissora para patógenos gram-positivos está inibindo a síntese de ácidos graxos, uma exigência para a produção de fosfolipídios de membrana que, em S. aureus, inclui fosfatidilglicerol (PG), lysyl-PG e cardiolipina4. Em bactérias, a produção de ácidos graxos ocorre através da via de síntese de ácidos graxos II (fasii)5, que é consideravelmente diferente da contraparte eucariótica, tornando fasii um alvo atrativo para o desenvolvimento de antibióticos5,6 . Os nervos inibidores de FASII primeiramente alvo FabI, uma enzima exigida para o alongamento da corrente do carbono do ácido gordo7. O inibidor da Fabi Triclosan é amplamente utilizado em bens de consumo e de saúde8,9. Inibidores adicionais de Fabi estão sendo desenvolvidos por diversas empresas farmacêuticas para o tratamento da infecçãopor S. aureus 10,11,12,13,14 ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26. No entanto, muitos patógenos gram-positivos, incluindo S. aureus, são capazes de eliminar os ácidos graxos exógenos para a síntese de fosfolipídios, contornando a inibição do fasii27,28,29. Assim, o potencial clínico dos inibidores do fasii é debatido devido a lacunas consideráveis em nosso conhecimento sobre as fontes de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais os patógenos extraem ácidos graxos do hospedeiro27,28. Para abordar essas lacunas, desenvolvemos um método de análise lipidomica imparcial para monitorar a incorporação de ácidos graxos exógenos de partículas de lipoproteínas em fosfolipídios de membrana de S. aureus.
Durante a sepse, as partículas de lipoproteínas hospedeiras representam uma fonte potencial de ácidos graxos derivados do hospedeiro dentro da vasculatura, pois a maioria dos ácidos graxos hospedeiros está associada às partículas30. As lipoproteínas consistem em um escudo hidrófilo composto de fosfolipídios e proteínas que envolvem um núcleo hidrofóbico de triglicerídeos e ésteres de colesterol31. Quatro classes principais de lipoproteínas--chylomicron, lipoproteína muito de baixa densidade, lipoproteína de alta densidade, e lipoproteína de baixa densidade (LDL)-são produzidos pelo hospedeiro e funcionam como veículos de transporte lipídico, entregando ácidos graxos e colesterol de e para células hospedeiras através da vasculatura. Os LDLs são abundantes em ácidos graxos esterificados, incluindo triglicerídeos e ésteres de colesterol31. Nós temos demonstrado previamente que os LDLs humanos altamente purified são uma fonte viável de ácidos gordos exógenos para a síntese do PG, assim fornecendo um mecanismo para o desvio32do inibidor de fasii. As LDLs humanas purificantes podem ser tecnicamente desafiadoras e demoradas, enquanto as fontes comerciais de LDLs humanas purificadas são proibitivamente caras de usar em uma base rotineira ou para realizar telas bacterianas em grande escala. Para abordar estas limitações, nós modificamos um procedimento para o enriquecimento de LDLs da gema de ovo da galinha, uma fonte rica de partículas do lipoproteína33. Nós usamos com sucesso a espectrometria maciça unalvejada, de alta resolução/exata e a espectrometria maciça em tandem para monitorar a incorporação de ácidos gordos LDL-derivados humanos na membrana de S. aureus32. Ao contrário dos métodos previamente relatados, esta aproximação pode quantificar isómeros individuais do ácido gordo para cada um dos três tipos estafilocócica principais do fosfolipídeo. O ácido oleico (18:1) é um ácido graxo insaturado presente em todas as partículas de lipoproteínas hospedeiras que é prontamente incorporada aos fosfolipídeos de S. aureus 29,30,32. S. aureus não é capaz de síntese de ácido oleico29; Portanto, a quantidade de ácido oleico incorporado ao fosfolipídios estabelece a presença de ácidos graxos derivados da lipoproteína hospedeira dentro da membrana estafilocócica29. Estas espécies de fosfolípidos podem ser identificadas pelo método de espectrometria de massas de última geração descrito aqui, oferecendo uma resolução sem precedentes da composição da membrana de S. aureus cultivada na presença de uma fonte de ácidos graxos que provavelmente encontros durante a infecção.

<table><tbody><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>Fisher</td><td>BP212R-1</td><td>&ge; 99,5% puro</td></tr><tr><td>Incubadora de cultura celular</td><td>Thermo</td><td>MaxQ 6000</td><td></td></tr><tr><td>Centrafuge</td><td>Thermo</td><td>75-217-420</td><td>Sorvall Legen XTR, rotor F14-6x250 LE</td></tr><tr><td>Placa de ensaio Costar</td><td>Corning</td><td>3788</td><td>96 poços</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Schleicher & Schuell</td><td>597</td><td></td></tr><tr><td>Ovo de galinha grande</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Ovo comprado em loja comum</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro de microplacas</td><td>BioTek</td><td>Epoch 2</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus cepa AH1263</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fornecido por Alex Horswill da Universidade do Colorado</td></tr><tr><td>Tubo de diálise</td><td>Pierce</td><td>68700</td><td>7.000 MWCO</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becton, Dickison and Company</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>grânulos de óxido de zircônio de 0,5 mm</td><td>Next Advance</td><td>ZROB05</td><td></td></tr><tr><td>Bullet Blender</td><td>Next Advance</td><td>BBX24B</td><td></td></tr><tr><td>Metanol (grau LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A4561</td><td></td></tr><tr><td>Clorofórmio (grau reagente)</td><td>Fisher</td><td>MCX10559</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol (grau LC-MS)</td><td>Fisher</td><td>A4611</td><td></td></tr><tr><td>Dimyristoyl fosfatidilcolina</td><td>Avanti Lipídios Polares</td><td>850345C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de amônio</td><td>Sigma</td><td>9830</td><td>&ge; Software puro</td></tr><tr><td>de</td><td>Sigma</td><td>70221-25G-F</td><td></td></tr> Xcalibur do formato de amônio de 99,5% espectrómetro maciço <tr><td></td> de <td>Thermo Scientific</td><td>OPTON-30801</td><td></td></tr><tr><td>LTQ-Orbitrap Velos</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>de alta resolução/massa exata MS</td></tr><tr><td>Agilent 1260 HPLC capilar</td><td>Concentradores</td> do vácuo de Agilent <td></td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus e outros patógenos gram-positivos incorporam ácidos graxos do ambiente em fosfolipídios de membrana. Durante a infecção, a maioria dos ácidos graxos exógenos estão presentes dentro de partículas de lipoproteínas hospedeiras. A incerteza permanece quanto aos reservatórios de ácidos graxos hospedeiros e os mecanismos pelos quais as bactérias extraem ácidos graxos das partículas de lipoproteínas. Neste trabalho, descrevemos protocolos de enriquecimento de partículas de lipoproteína de baixa densidade (LDL) da gema de ovo de frango e determinando se os LDLs servem como reservatórios de ácidos graxos para S. aureus. Este método explora análise lipidomica imparcial e LDLs de frango, um modelo eficaz e econômico para a exploração de interações entre LDLs e bactérias. A análise da integração de S. aureus de ácidos graxos exógenos de LDLs é realizada utilizando espectrometria de massas de alta resolução/acurada e espectrometria de massas em tandem, possibilitando a caracterização da composição de ácidos graxos da bactéria membrana e identificação imparcial de combinações novas de ácidos gordos que se levantam em lipídios bacterianos da membrana em cima da exposição aos LDLs. Estas técnicas avançadas da espectrometria maciça oferecem uma perspectiva incomparável da incorporação do ácido gordo revelando os ácidos gordos exógenos específicos incorporados nos phospholipids. Os métodos aqui descritos são adaptáveis ao estudo de outros patógenos bacterianos e fontes alternativas de ácidos graxos complexos.

O protocolo para o enriquecimento de LDL da gema de ovo de galinha é ilustrado na Figura 1. Este processo começa por diluir a gema de ovo inteira com soro fisiológico e separar os sólidos de gema de ovo referidos como grânulos da fração solúvel ou plasmática contendo os LDLs (Figura 1)33. O teor de LDL da fração plasmática é ainda mais enriquecido pela precipitação do ~ 30-40 kDa β-livetins (<strong class=...

Este método fornece um quadro para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes hospedeiras complexas em membranas bacterianas, particularmente Staphylococcus aureus. Para conseguir isto, os protocolos para o enriquecimento de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha e do perfil de ácido gordo subseqüente de fosfolipídios bacterianos que utilizam a espectrometria maciça são descritos.

Isolação de partículas da lipoproteína da gema de ovo da galinha para o estudo da incorporação do ácido gordo do micróbio patogénico bacteriano em phospholipids da membrana

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

Este protocolo fornece uma estrutura para estudar a incorporação de ácidos graxos exógenos de fontes complexas de hospedeiro em membranas bacterianas, particularmente staphylococcus aureus. O protocolo utiliza análises lipidômicas imparciales e partículas de lipoproteína isoladas de gemas de ovos de galinha como fonte econômica de ácidos graxos complexos para quantificar a incorporação de ácidos graxos em lipídios bacterianos. As técnicas de espectrometria de massa descritas aqui oferecem uma perspectiva incomparável do perfil do ácido graxo dos lipídios staphylococcus aureus, mas podem ser adaptados para estudar outras membranas bacterianas.Ao executar este protocolo, deve-se tomar cuidado para que cada passo de fracionamento para identificar e reter a fração contendo LDL. A remoção do sulfato de amônia da fração de plasma é fundamental para aplicações a jusante dos LDLs. Forneça amplo espaço na tubulação e troque a água conforme necessário para permitir diálise eficaz.Para começar, lave duas gemas duas vezes com 30 mililitros de salina tamponada de fosfato estéril para remover a albumina residual. Puna a membrana vitelline com uma ponta de pipeta estéril e drene o conteúdo da membrana em um tubo de centrífuga cônica estéril de 50 mililitros. Adicione aproximadamente 24 a 30 mililitros ou 17 soluçãos de cloreto de sódio molar no pH sete à gema de ovo e misture vigorosamente.Em seguida, coloque o tubo em um agitador de balanço para misturar a quatro graus Celsius por 60 minutos. Centrifugar a diluição da gema de ovo a 10 graus Celsius a 10.000 vezes g durante 45 minutos. Transfira a fração de plasma supernante em um tubo cônico estéril de 50 mililitros, deixando para trás a fração granular pelleted.E centrífuga de novo. Primeiro, misture a fração de plasma com 40 por cento de sulfato de amônio em um agitador de balanço ou dispositivo similar a quatro graus Celsius por 60 minutos. Depois de ajustar o pH, centrifugar a fração de plasma a quatro graus Celsius e 10.000 vezes g por uma duração de 45 minutos.Remova a fração amarela semisóida superior em tubos de diálise do tamanho de sete kilodalton. Forneça um mínimo de 25% de espaço extra na tubulação para permitir que ele incha. Coloque a tubulação de diálise em três litros de água ultrauso para diálise durante a noite a três graus Celsius para remover o sulfato de amônio.Após a diálise, centrifugar a solução a quatro graus Celsius como descrito anteriormente. Remova cuidadosamente a fração amarela superior e semisóida em um tubo estéril e armazene a quatro graus Celsius. Após a incubação da cultura durante a noite, transfira 500 microliters em dois frascos estéreis de 250 mililitros perplexos contendo 49,5 mililitros de caldo de 1% de triptona.Incubar por aproximadamente quatro horas a 37 graus Celsius com agitação para chegar à fase de meio-longo. Transfira 100 mililitros de cultura em incrementos de 25 mililitros para quatro tubos de centrífuga de 50 mililitros e centrífugas e centrifugar os quatro tubos a 10.000 vezes g para pelotar as células. Remova o supernascer e suspenda de novo cada pelota de célula em 750 microliters de caldo de 1% de triptona.Combine as quatro suspensões de células de 750 microliter em um único tubo de 15 mililitros. E alíquota de 350 microliters da suspensão celular em seis tubos de centrífuga de 1,5 mililitros estéreis. Use uma pipeta para adicionar 30 microliters de LDLs no tubo de centrífuga de 1,5 mililitro para alcançar uma concentração final desejada de 5% e incubar a 37 graus Celsius com agitação por quatro horas.Centrifugar as culturas a quatro graus Celsius a 16.000 vezes g por uma duração de dois minutos. E suspenda as cápsulas de célula em 330 microliters de soro fisiológico estéril tamponado para lavar. Repita esta lavagem mais uma vez.Registre o peso das seis pelotas de células molhadas subtraindo o peso do tubo vazio. Es clique para congelar as pelotas de células em gelo seco. Primeiro adicione uma colher de contas de óxido de zircônio de 5 milímetros em cima de cada pelota de célula.Adicione 740 microliters de 75% de metanol de grau HPLC refrigerado a menos 80 graus Celsius diretamente em cada tubo. Em seguida, adicione dois microliters de 50 dimyristoyl dimyristoyl fosphasphatidylcholina como padrão interno. Coloque a amostra contendo tubos de centrífuga de 1,5 mililitro em uma porta disponível em um homogeneizador de tecido de liquidificador de bala.Homogeneize as amostras em baixa velocidade. Configurando dois a três por três minutos. Inspecione visualmente as amostras em busca de homogeneidade.Se as moitas de células forem visíveis, continue a homogeneização no liquidificador de bala em incrementos de dois minutos. Em seguida, adicione 270 microliters de clorofórmio a cada amostra em uma capa de fumaça química. Vórtice as amostras vigorosamente por 30 minutos.Centrifugar as amostras em uma centrífuga de bancada por até 30 minutos no mínimo 2.000 vezes g. Na capa de fumaça química, colete o supernatante monofásico e transfira-o para um novo tubo de ensaio, evitando cuidadosamente a pelota de proteína na parte inferior do tubo de extração. Transfira os extratos lipídicos diluídos previamente preparados para um frasco de automapeador apropriado.Para análise baseada em injeção de fluxo, coloque os frascos de autosampler em um autosampler controlado pela temperatura de um sistema HPLC capaz de aplicações de fluxo capilar. Configure o sistema HPLC de acordo com o manuscrito. O eluente é introduzido da linha de transferência HPLC para o espectrômetro de massa através de uma fonte de ionização de eletrospray equipada com uma agulha metálica calibre 34 de baixo fluxo.No software de controle de instrumentos Thermo Tune Plus, defina a tensão de ionização para 4.000 volts e gás de baia para cinco. Da mesma forma, ajuste a temperatura capilar para 150 graus Celsius e a lente S para 50% Clique no botão de digitalização definidor e, no menu analisador, selecione FTMS. Defina o campo de alcance de massa como normal e no campo de resolução, selecione 100.000.Certifique-se de que o tipo de varredura está configurado como completo. No menu de intervalos de varredura, digite 200 no primeiro campo de massa e entre em 2.000 no último campo de massa. Depois de definir ainda mais a precisão de massa observada, média do sinal através do pico amplo no cromatógrafo de íon total.Clique com o botão direito do mouse no ícone thumbtack na janela de visualização do espectro de massa e selecione a lista de espectro de exibição. No mesmo menu, selecione opções de exibição e, em seguida, todos os picos alternam caixa no menu de exibição. Clique no botão ok para fechar a janela de visualização.Clique com o botão direito do mouse no ícone da tachinha na janela de visualização do espectro de massa novamente e selecione a massa exata da área de transferência de exportação. Cole a célula de dados exportada A1 da primeira planilha do Excel e proceda de acordo com o manuscrito. Para realizar identificações lipídicas baseadas em massa precisas, abra o software LIMSA.No menu principal, selecione a lista de picos no menu tipo de espectro. Selecione o modo positivo ou o modo negativo para corresponder à polaridade na qual os dados de espectrometria de massa foram adquiridos. No pico de largura total à metade da janela máxima e acima de z, entre na janela de busca em massa desejada para encontrar o pico.Neste protocolo, o teor de LDL da fração de plasma foi ainda mais enriquecido pela precipitação das levitinações beta de 30 a 40 kilodalton. A presença de bandas proteicas em 140, 80, 65, 60 e 15 kilodaltons correlaciona-se com as apoproteínas de LDLs. O tratamento com triclosan inibe o crescimento de estafilococos no meio livre de ácidos graxos.Enquanto a suplementação de culturas com plasma de gema de ovo como fontes de ácidos graxos exógenos supera a inibição de crescimento induzida pelo triclosan. Da mesma forma, a suplementação de culturas tratadas com triclosan com gema de ovo enriquecida LDL restaura o crescimento. Além disso, a adição de LDLs de gema de ovo suporta o crescimento de um ácido graxo S.aureus anteriormente caracterizado, auxotroph.O teor de ácido pré-graxo foi medido em caldo de triptona de 1%ou gema de ovo de galinha LDL, empregando espectrometria de massa precisa de injeção de fluxo. Foram encontradas quantidades mínimas de ácido graxo livre. A análise parcial parcial ortogonal de análises discriminatórias de membrana aureus de estafilococos abundantes demonstraram separação de classe clara, com uma composição de ácido graxo de condições tratadas de gema de ovo de galinha e gema de galinha LDL.O enriquecimento de LDLs de gema de ovo de galinha fornece uma fonte barata de ácidos graxos complexos para investigar as interações entre patógenos bacterianos e lipoproteínas hospedeiras. Clorofórmio e metanol usados na preparação de extratos lipíduos são perigosos. Por favor, certifique-se de usar estes reagentes em um capô de fumaça química e conter todos os fluxos de resíduos.

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Fonte: Armbruster, K. M., Meredith, T. C. Enriquecimento de Lipoproteínas Bacterianas e Preparação de Lipopeptídeos N-terminais para Determinação Estrutural por Espectrometria de Massa. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra o enriquecimento de lipoproteínas bacterianas usando um detergente não iônico que sofre separação de fases após o aquecimento. Por meio de mudanças sequenciais de temperatura e etapas de centrifugação, as lipoproteínas são seletivamente divididas na fase detergente,...

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