Um ensaio de imagem de molécula única in vitro para a análise de cinética de tradução dependente da tampa

Este protocolo é significativo porque permite a utilização de sistemas de tradução sem células existentes para a análise de molécula única de tradução eucariótica ativa. As principais vantagens dessa técnica são que ela preserva as propriedades de tradução em massa, fornece resolução de molécula única e é relativamente simples de adaptar a partir de outros ensaios de tradução em massa. Esse método pode ser aplicado a qualquer sistema de tradução sem células que tenha sido verificado para permitir uma conversão eficiente dependente de maiúsculas em condições em massa.

Demonstrando o procedimento estarão Hongyun Wang, pesquisador associado, e Anthony Gaba, pesquisador sênior do laboratório Xiaohui Qu. Pelo menos três horas antes de realizar um experimento de molécula única, ligue a incubadora do microscópio e reduza o fluxo de ar a uma taxa baixa para evitar distúrbios acústicos excessivos do experimento. Em seguida, defina a temperatura da incubadora para a temperatura ideal específica para o sistema de translação sem células.

Pelo menos uma hora antes do experimento, pressione o botão liga/desliga do laser atrás da caixa do laser, gire a chave de segurança do laser e pressione o botão Iniciar para ligar o laser. Ligue o microscópio e selecione o modo de imagem, a objetiva e o conjunto de filtros. Ligue a câmera EMCCD, o stage controlador, a bomba de seringa e o computador e abra a câmera, o laser, o motorizado stage e o software da bomba de seringa.

No software de controle do laser, clique em conectar para definir a intensidade do laser, desmarque a caixa do obturador e clique em controle para arrastar a barra deslizante de intensidade na janela pop-up do controle do laser. Insira a profundidade de penetração para definir o laser para o ângulo desejado e confirme se a caixa do obturador está fechada para manter o laser no modo desligado quando não estiver criando imagens. Quando a câmera esfriar e estabilizar até a temperatura de trabalho designada, no software da câmera, selecione cinética para o modo de aquisição e insira os parâmetros de tempo de exposição, comprimento da série cinética e valor de ganho de multiplicação de elétrons.

Selecione o diretório e atribua nomes de arquivo para salvar o arquivo de imagem de dados. Defina a bomba da seringa para uma taxa de fluxo modesta a rápida e adicione 500 microlitros de etanol a 70% a um tubo de microcentrífuga. Insira a extremidade da tubulação da bomba de seringa na solução de etanol e use o software da bomba de seringa para alternar a bomba de seringa entre os modos de retirada e dispensação para lavar a tubulação três vezes com etanol e três vezes com água sem RNase.

Após a lavagem final com água, passe a extremidade do tubo em um lenço de papel limpo para remover qualquer água residual do interior do tubo e coloque a extremidade do tubo em um tubo de microcentrífuga limpo. Para imobilização de mRNA biotinilada de três extremidades principais, coloque a câmara de fluxo no suporte de amostra do microscópio com o lado da lamínula voltado para baixo e prenda a câmara com fita adesiva. Use a fita para cobrir as entradas e saídas do canal de fluxo que não estão em uso e adicione 1,5 vezes o volume de uma solução de estreptavidina de 200 microgramas por mililitro ao canal de fluxo.

Após 10 minutos à temperatura ambiente, lave e limpe o canal três vezes com três vezes o volume de tampão de lavagem T50 por lavagem e o tecido de laboratório dobrado. Após a última lavagem, coloque uma gota de óleo de imersão na objetiva do microscópio e coloque o suporte e a câmara no microscópio stage. Em seguida, aproxime a objetiva da lamínula até que o óleo de imersão na objetiva entre em contato com a lamínula e mova o sample stage para que a posição do canal de fluxo fique diretamente acima da lente da objetiva.

Na tela sensível ao toque do controle do microscópio, selecione a guia de foco e clique em pesquisa de foco e iniciar. Um bipe será ouvido quando o plano de foco for alcançado com sucesso. No software da câmera, selecione o modo ao vivo.

No software de controle do laser, abra o obturador do laser e ajuste o nível de intensidade do laser. Observe a imagem de fluorescência em tempo real no modo ao vivo e na tela sensível ao toque de controle do microscópio usando o controle de passo fino para ajustar a posição da objetiva. No software da câmera, mova a platina para avaliar o nível de fundo de fluorescência em várias áreas da superfície de detecção do canal de fluxo.

Se a fluorescência estiver baixa, pare o modo ao vivo e feche o obturador do laser no software de controle do laser e substitua o tampão de lavagem do canal de fluxo por duas vezes o volume da solução de mRNA biotinilada. Após 15 minutos, lave o canal três vezes com três vezes o volume do tampão compatível com a tradução por lavagem. Para detecção de molécula única, monte três vezes o volume da mistura de tradução recém-descongelada sem mRNA e suplementada com uma concentração otimizada de anticorpos marcados com fluorescência em um tubo de microcentrífuga no gelo e gire brevemente o tubo para coletar a mistura no fundo do tubo.

Transfira a mistura de tradução para o interior de uma tampa de tubo de microcentrífuga de 700 microlitros e coloque a bomba da seringa no modo de retirada. Insira a extremidade do tubo da bomba na mistura de tradução e inicie a retirada da seringa. Quando a mistura de tradução tiver entrado completamente na tubulação da bomba, pare a retirada, inverta as configurações da bomba de seringa para o modo de distribuição e defina o fluxo para uma taxa ideal para a entrega da mistura de tradução.

Inicie e pare a seringa para permitir que a mistura de translação atinja a extremidade da tubulação conforme necessário e insira a extremidade da tubulação da bomba na entrada do canal de fluxo, tomando cuidado para evitar bolhas. Aparafuse o suporte de metal feito sob medida na placa do suporte de amostra do microscópio para estabilizar a conexão e avaliar o foco do microscópio e a fluorescência da área de imagem. Confirme se os parâmetros de aquisição de filme estão corretos e se o nome de arquivo e o diretório apropriados foram inseridos para salvar os arquivos.

Mova a platina para permitir a aquisição de imagens de uma área no centro da superfície de detecção do canal de fluxo. E na guia AF contínuo, clique nos botões Iniciar. Um bipe será ouvido quando um plano de foco for alcançado com sucesso.

Depois de reduzir a luz ambiente, abra o obturador do laser e clique no botão de sinal para iniciar a gravação. Após cinco segundos, insira o comando run para entregar a mistura de tradução no canal de fluxo. Em seguida, grave os dados por até duas horas em uma resolução de 0,5 a dois segundos por tempo de quadro.

Para analisar os eventos de ligação Cy3 ANTI-FLAG, as intensidades de fluorescência dos pontos de bandeira alfa Cy3 selecionados foram calculadas quadro a quadro para todo o filme e conectadas para formar uma trajetória de intensidade. As trajetórias brutas podem parecer ruidosas e podem exigir refinamento com um filtro não linear para frente/para trás para reduzir o ruído de fundo. Mais refinamento pode ser alcançado usando algoritmos de detecção de passos para digitalizar trajetórias.

A ligação do anticorpo a um polipeptídeo nascente causa um aumento instantâneo na fluorescência, enquanto a dissociação do polipeptídeo do anticorpo causa uma diminuição instantânea da fluorescência. O histograma de tempo de permanência para o mRNA sinalizador de luciferase se ajusta a uma distribuição logarítmica normal e produz uma taxa de síntese de peptídeos de 2,5 mais ou menos 0,1 aminoácidos por segundo. O histograma do primeiro tempo de chegada se encaixa em uma função normal logarítmica deslocada, ilustrando o alto grau de heterogeneidade na atividade de tradução de mRNA único.

Como o histograma indica, o primeiro evento de síntese de peptídeos em moléculas de mRNA de bandeira de luciferase única pode começar em dois minutos e 20 minutos após a entrega da mistura de tradução. Em comparação com a tradução com o mRNA da bandeira da luciferase, o histograma do primeiro tempo de chegada com a tradução do mRNA da bandeira da luciferase mostrou uma ligação mais lenta do anticorpo. O uso de medições de luminescência em massa de reações de tradução livres de células com esses mesmos mRNAs, no entanto, não resolve as diferenças na cinética de tradução.

A resolução de molécula única deste ensaio fornece mais informações cinéticas de tradução dependente de tampa que não são facilmente alcançáveis com outras abordagens. A tradução livre de células eucarióticas é sensível a pequenas variações e condições experimentais. Portanto, a atenção aos detalhes e a consistência são essenciais ao usar este ensaio para detectar com precisão pequenas diferenças na tradução.