Imunofluorescência quantitativa a medida Global localizadas Tradução

O objetivo geral deste experimento é visualizar e quantificar eventos de tradução compartimentados que ocorrem durante as etapas iniciais da adesão celular. Este método tem ampla aplicação. Use-o sempre que a resposta rápida de tradução específica puder ser um ensaio, como ao analisar a migração celular, adesão ou resposta precoce a medicamentos.

A principal vantagem dessa técnica é que ela é fácil, rápida e econômica. Requer apenas puromicina, anticorpos direcionados contra puromicina e o sistema de imagem de varredura confocal padrão. Para começar, faça uma suspensão de células MRC-5.

Use tripsinização, seguida de centrifugação, remoção do sobrenadante e, em seguida, ressuspensão em DMEM com dez por cento de FBS, a 40 mil células por mililitro. Incubar a suspensão com rotação suave durante 20 minutos para dissociar completamente os complexos de adesão focal. Isso é crítico.

Em seguida, em dois pratos com fundo de vidro de 35 milímetros, adicione duas alíquotas de mililitros em suspensão e incube-as para permitir a adesão celular e a formação de SiC. Após 40 minutos, trate uma placa com cicloheximida e devolva-a à incubadora. Esta placa funcionará como controle negativo.

Após 55 minutos, aplique puromicina em ambas as placas na concentração predeterminada e incube as placas por mais cinco minutos. Após uma hora de semeadura e cinco minutos de puromicina em cooperação, lave cada placa duas vezes com dois mililitros de PBS gelado. Em seguida, fixe as células com um mililitro de quatro por cento de formaldeído em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente.

Após a fixação, lave as células três vezes com PBS e, em seguida, permeie as células usando 500 microlitros de 0,5% de triton X-100 em PBS por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave as placas três vezes com PBS e, em seguida, aplique 500 microlitros de um por cento de BSA em PBS. Continue a incubação em temperatura ambiente por mais 20 minutos.

Para remover o excesso de BSA, lave as células três vezes com 0,1% de Tween-20 em PBS. Agora, incube as células com 300 microlitros de anticorpo anti-puromicina. Remova o anticorpo não ligado usando três lavagens com 0,1% de Tween-20.

Em seguida, aplique trezentos microlitros de uma mistura de dois anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para visualizar polipeptídeos puromicolados e de fato. Incube as células por uma hora em temperatura ambiente no escuro. Após uma hora, lave as placas três vezes para remover os anticorpos não ligados e, em seguida, aplique trezentos microlitros de solução Tween-20 a 0,1%, complementada com DAPI.

Deixe o DAPI permanecer nas células por cinco minutos em temperatura ambiente. Por fim, lave as células mais quatro vezes, terminando com uma lavagem em PBS puro. Em seguida, armazene as células em dois mililitros de PBS para obter imagens.

Usando qualquer sistema de imagem confocal disponível comercialmente, primeiro determine as configurações apropriadas que maximizam a faixa dinâmica para quantificação. A tónica na quantificação só pode ser obtida se evitar a saturação da dimensão dos picos e se a concentração for ajustada correctamente. A configuração pode ser obtida ajustando cuidadosamente a vantagem de potência do laser e os deslocamentos.

Primeiro, ajuste o fator de zoom e o número de pixels para otimizar o tamanho do pixel. Faça isso de acordo com o teorema de Nyquist. Em seguida, diminua a velocidade de varredura e use a média para melhorar a relação sinal-ruído.

Em seguida, determine manualmente os planos focais superior e inferior apropriados ao longo do eixo Z e defina o StepSize calculando a resolução axial e dividindo essa distância por 2,3. O resultado típico é de 20 a 25 camadas de imagem. Depois que as configurações forem ajustadas, adquira uma imagem confocal de uma única célula inteira usando uma objetiva de imersão em óleo Plan Apo de 60x com uma abertura numérica de 1,42.

Para quantificar e analisar os sinais do fluróforo, primeiro abra uma imagem correspondente à camada do plano z de interesse na imagem J. Em seguida, usando a ferramenta de desenho, faça uma linha através da célula onde a quantificação é desejada. Em seguida, modifique o cheiro da linha clicando duas vezes em linha reta. Os valores de intensidade serão calculados através da largura da linha, portanto, use uma linha mais fina para evitar a sobreposição de sinais de diferentes estruturas.

Em seguida, perfile a densidade do sinal ao longo da linha. Agora, repita o processo de coleta da densidade do sinal ao longo da mesma linha no canal que corresponde a um fluróforo. Os valores sempre serão ordenados usando a orientação da linha.

Agora, copie os dados do perfil e cole-os em uma planilha para análise. Repita esse processo de coleta de dados de cada imagem do plano Z de interesse antes de prosseguir com a análise estatística. Alternativamente, em vez de coletar sinal ao longo de um eixo, o sinal pode ser coletado de uma área da imagem.

Primeiro, use a função de forma geométrica para selecionar uma região de interesse. Em seguida, ajuste o nível de limite para evitar qualquer plano de fundo. No histograma de intensidades de pixels, mova o controle deslizante para ajustar quais pixels serão incluídos na quantificação.

Defina o limite para eliminar todos os pixels vermelhos fora da célula. Agora, defina os parâmetros de medição necessários para medir o sinal de interesse e não o sinal de fundo. Alterne o limite para as opções de limite e densidade integrada.

Em seguida, use o comando measure. Isso abrirá uma nova janela com os valores médios de cinza e contagem de pixels na área selecionada. Agora repita o processo, aplicando o mesmo limite para determinar a intensidade do sinal em toda a célula.

Em seguida, use esses dados para calcular a proporção do sinal na área selecionada para a de toda a célula. Para uma medição precisa dos eventos de translação usando a incorporação de purmicina, as condições ideais para uma medição axial foram avaliadas primeiro. Um espectro de concentrações versus um tratamento de cinco ou dez minutos foi comparado.

A concentração aceitável de puromicina para células MRC-5 e HeLa foi um pouco maior do que a necessária para células Huh-7. As células tratadas por dez minutos com altas concentrações de puromicina geraram principalmente polipeptídeos puromicolados menores. Os polipeptídeos menores são desarmados mais rapidamente e não são desejáveis.

O menor tempo de incubação foi, portanto, considerado mais desejável. O tratamento com cicloheximida é um controle negativo eficaz e importante. Nas células MRC-5, apenas um sinal fraco de puromicina foi detectado após o tratamento com cicloheximida.

Usando a quantificação do sinal axial, a localização geral de polipeptídeos puromicolados correspondentes a proteínas recém-sintetizadas pode ser avaliada em diferentes níveis dentro da célula. Uma distribuição quantitativa do sinal em toda a célula também foi viável. Para qualquer técnica, era importante quantificar o sinal para cada plano Z na pilha de imagens para avaliar com precisão os eventos de translação em uma célula inteira.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como avaliar o evento de tradução no compartimento subcelular. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em um dia, se executada corretamente. Quando se pensa nesse procedimento, é importante lembrar que a concentração de puromicina e seu tempo de incubação são importantes.

Para limitar a difusão, é preferível limitar o tempo de incubação. Também é importante reconhecer que a qualidade do tipo de aquisição de imagem é fundamental para a obtenção de bons resultados. Não se esqueça de que trabalhar com formaldeído pode ser extremamente perigoso e precauções como trabalhar com capuz químico devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.